專利名稱：一種檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法及其專用引物。
背景技術：
小麥多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，簡稱PPO)是引起面條、饅頭、餃子和面團等小麥制品在貯存期間顏色褐變的主要因素，其決定面條等制品顏色穩定性的70％。通過遺傳育種途徑降低小麥PPO活性，培育PPO活性低的小麥品種是小麥品質改良的重要目標。
研究人員已作過許多關于小麥PPO活性的遺傳研究，例如，葛秀秀等應用植物數量性狀主基因加多基因混合遺傳模型對冬小麥PPO活性進行了遺傳分析，分析結果表明PPO活性受2對獨立的主基因控制。Jimenz和Anderson等通過對代換系PPO活性的測定，也推測控制小麥PPO的主效基因為1-2個，同時指出針對PPO的底物專化性存在多個等位基因。但是目前還未發現PPO基因在小麥染色體上的位置。
Demeke等研究了三個重組近交系群體的QTL標記，發現三個群體均出現超親分離，PPO主效基因位于第二部分同源群染色體上與RFLP標記Xfba314連鎖。Udall和Demekes等利用RFLP標記分析研究了四個重組近交系群體，Mares等利用AFLP標記分析了一個DH群體，上述兩項研究結果均證明PPO活性的主效基因位于第二同源群染色體上。但是，RFLP標記和AFLP標記不是基于PCR(PCR-based)的分子標記技術，難以在小麥育種上應用。
此外，Demeke和Morris根據蘋果、馬鈴薯等作物PPO基因序列的保守區設計引物擴增出大小為2070bp的小麥PPO的DNA序列。Jukanti等和Anderson等也發表了一段PPO基因序列。但迄今為止還未開發出可應用于小麥育種的PPO活性分子標記。
發明內容
本發明的目的是提供一種可用于檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的引物。
本發明所提供的用于檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的引物，名稱為Xgwm312，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。
序列表中的序列1由20個堿基組成，序列表中的序列2由21個堿基組成。
本發明的第二個目的是提供一種檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法。
本發明所提供的檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有198bp大小的條帶。
如擴增產物中有198bp大小的條帶，表明待測小麥中的多酚氧化酶活性高。
其中，以20μl總體積為例，PCR擴增的反應體系包括1×PCR緩沖液(50mmol·L-1KCl，10mmol·L-1Tris·Cl，0.01％明膠)、MgCl21.5mM、dNTP(A.T.C.G)各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每條引物4pmol、模板DNA 80ng。反應條件可為首先94℃變性5min；然后94℃變性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共36個循環；最后72℃延伸10min。
可通過6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物中是否有198bp大小的條帶。
本發明應用分子數量遺傳學方法和小麥微衛星(microsatellite或SSR)技術將小麥多酚氧化酶基因PPO定位在小麥染色體2A長臂(2AL)上，并提供了該基因的SSR分子標記Xgwm312，該標記與PPO基因緊密連鎖(1.6cM)，利用該標記可以對小麥多酚氧化酶基因PPO進行分子標記輔助選擇，從而培育出多酚氧化酶活性低的優良小麥品種；此外，還可利用該分子標記檢測小麥中多酚氧化酶的活性，檢測方法簡單易行、穩定可靠。本發明的方法及其專用引物將在小麥多酚氧化酶活性性狀的檢測和小麥育種中發揮重要作用。
圖1為SSR標記與多酚氧化酶基因PPO的連鎖2為引物Xgwm312對15個小麥品種的PCR擴增產物電泳圖具體實施方式
實施例1.小麥多酚氧化酶基因PPO的SSR分子標記Xgwm312的獲得用中國農科院作物所培育的PPO活性高的小麥品種‘中優9507’與PPO活性較低的小麥品種“CA9632”雜交，F1代種于試驗田中，抽穗時取花藥離體培養，并進行單倍體加倍，得到DH群體，然后進行PPO活性分析。
田間試驗分別在中國農科院作物所(北京)、中國農科院棉花所(安陽)和山東農科院作物所(濟南)3個地點進行，每個地點重復2次，小區為3行區，行長2米，每行播種80粒。收獲后測試每個DH系的PPO活性。
用126對SSR引物(wmc336a，Xgwm136，gdm33c，wmc329，wmc84b，Xgwm357，wmc469，wmc312b，Xgwm448c，Xgwm99，wmc367，Xgwm26，gdm33b，wmc336b，wmc522，wmc177，Xgwm356，wmc191，Xgwm372，Xgwm425，Xgwm448b，Xgwm382，Xgwm312，Xgwm294，Xgwm410，Xgwm374，wmc154，wmc257b，Xgwm261，Xgwm296，Xgwm157，Xgwm539，Xgwm349，wmc419，wmc256a，wmc200a，wmc132c，wmc36a，wmc41，wmc410，wmc532，Xgwm66，Xgwm493，wmc326，wmc308c，Xgwm114c，Xgwm264a，Xgwm285，wmc291，Xgwm376，Xgwm247，Xgwm389，gdm72，wmc533，Xgwm3，wmc170b，Xgwm645，Xgwm383，wmc236，wmc132e，wmc297，wmc308a，wmc238，Xgwm495，wmc349，Xgwm6，Xgwm251，Xgwm149，wmc449，wmc459，wmc285，wmc473，gdm125，wmc308b，wmc457，gdm133a，Xgwm194，Xgwm293，wmc257a，Xgwm186，wmc327b，Xgwm126，gdm133c，wmc537，Xgwm67，wmc118，gdm132b，Xgwm190，gdm68，Xgwm182，Xgwm272，Xgwm114a，wmc215，wmc132a，gdm33a，wmc201，Xgwm570，wmc256b，wmc32，wmc84a，wmc312a，Xgwm169，Xgwm518，Xgwm114g，Xgwm193，gdm132a，Xgwm325，wmc479，wmc17，Xgwm276，Xgwm282，wmc36b，Xgwm264b，Xgwm569，Xgwm297，wmc402b，wmc396，wmc76，Xgwm400，Xgwm577，wmc323，wmc132b，Xgwm111，wmc346，wmc38，wmc438)、4對貯藏蛋白的STS引物(Glu-A3，Glu-B3，Gli-B1，Glu-D1)和26對AFLP引物組合(P41-M32e，P33-M38c，P42-M45c，P42-M45a，P32-M35e，P41-M32a，P42-M45h，P42-M45j，P32-M35b，P33-M38a，P31-M31a，P38-M46d，P42-M45g，P38-M46b，P38-M46a，P42-M45d，P42-M45e，P31-M31c，P42-M45f，P41-M32c，P35-M41d，P42-M45i，P35-M41a，P31-M31e，P35-M41b，P31-M31b)對該DH群體進行遺傳分析，應用MAPMAKER3.0軟件構建連鎖圖，并用Cartographer軟件包的復合區間作圖法(CIM)分別進行3個地點(北京、安陽和濟南)PPO活性的QTL分析。
結果如圖1所示，表明在小麥染色體2A長臂(2AL)上有一主效PPO活性基因，并與微衛星標記Xgwm312緊密連鎖(1.6cM)。
實施例2.小麥多酚氧化酶(PPO)活性的測定實驗用小麥品種1.蘇引10號(購自江蘇農科院作物所)，2.農大152(購自中國農業大學)，3.豫麥21(購自河南省漯河市農業科學研究所)，4.中梁88375(購自甘肅天水市農科所)，5.揚麥5號(購自江蘇里下河地區農科所)，6.豫麥56(購自河南農科院小麥所)，7.冬豐9801(購自中國農科院作物所)，8.晉麥50(購自山西省農科院棉花研究所)，9.藁城8901(購自河北省藁城農業科學研究所)，10.高優503(購自中國科學院石家莊農業現代化研究所)，11.冀麥38(購自河北省石家莊市農科院)，12.98中18(購自中國農科院作物所)，13.臨汾138(購自山西省農科院小麥研究所)，14.云麥46(購自云南省農科院作物所)，15.山東928802(購自山東省農科院作物所)。
將上述15個冬小麥品種種植于中國農科院棉花研究所(安陽)、中國農科院作物所(北京)和山東農科院作物所(濟南)，田間管理按常規方法進行，收獲籽粒并按下述方法測定其PPO活性，具體步驟為
a)稱取15粒種子放入約20ml玻璃瓶內，加入4.5ml反應試劑，放在混旋器上混合，使樣品充分濕潤。
反應試劑為50mM pH6.5的MOPS(3-[N-morpholino]propanesulfonic acid)緩沖液，10mM L-DOPA(L-3，4-dihydroxyphenyl alanine)。
b)把樣品瓶放在往復振蕩機上振蕩0.5小時(樣品充分暴露在空氣中)。再放在混旋器上迅速混合，使樣品顏色一致。馬上將樣品放在冰塊上終止反應。
c)以空白L-DOPA/MOPS溶液為比色對照，用分光光度計取1.0cm比色皿，在475nm下測定上清液的吸光度A。計算結果PPO活性(A475nm/min·g-1×103)＝A/(30min×15粒種子克數)×103式中A為475nm下上清液的吸光度。
實驗結果表明1.蘇引10號籽粒PPO活性10.29 A475/g min-1×103，2.農大152籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103，3.豫麥21籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103，4.中梁88375籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103，5.揚麥5號籽粒PPO活性2.08 A475/g min-1×103，6.豫麥56籽粒PPO活性3.09 A475/g min-1×103，7.冬豐9801籽粒PPO活性2.96A475/g min-1×103，8.晉麥50籽粒PPO活性2.50 A475/gmin-1×103，9.藁城8901籽粒PPO活性3.29 A475/g min-1×103，10.高優503籽粒PPO活性4.60 A475/g min-1×103，11.冀麥38籽粒PPO活性2.88 A475/g min-1×103，12.98中18籽粒PPO活性3.27 A475/g min-1×103，13.臨汾138籽粒PPO活性9.62 A475/gmin-1×103，14.云麥46籽粒PPO活性8.61A475/g min-1×103，15.山東928802籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103。結果表明蘇引10號(籽粒PPO活性10.29 A475/gmin-1×103)，農大152(籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103)，豫麥21(籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103)，中梁88375(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)，臨汾138(籽粒PPO活性9.62 A475/g min-1×103)，云麥46(籽粒PPO活性8.61A475/g min-1×103)和山東928802(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)的PPO活性明顯高于其它小麥品種。
實施例3.Xgwm312分子標記用于檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的有效性驗證實驗用小麥品種與實施例2相同。
將上述15個冬小麥品種分別種植于中國農科院棉花研究所(安陽)、中國農科院作物所(北京)和山東農科院作物所(濟南)，田間管理按常規進行，收獲籽粒后提取各個小麥品種的基因組DNA，然后以其為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增。
其中，PCR擴增的反應體系為20μl總體積中包含1×PCR緩沖液(50mmol·L-1KCl，10mmol·L-1Tris·Cl，0.01％明膠)、MgCl21.5mM、dNTP(A.T.C.G)各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每條引物4pmol、模板DNA 80ng。反應條件為首先94℃變性5min；然后94℃變性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共36個循環；最后72℃延伸10min。
可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物中是否有198bp大小的條帶。所述電泳檢測的方法為電泳緩沖液為pH8.0的1×TBE；制膠用6％聚丙烯酰胺膠儲存液(尿素420.2g，丙稀酰胺60.0g，N’N-甲叉雙丙烯酰胺3.16g，10×TBE 50ml，定容至1000ml)60ml，10％過硫酸銨(APS)300μl，TEMED 60μl，混合均勻后灌膠，膠型為380mm/300mm/0.4mm；電泳程序為首先100W預電泳30min，插60孔加樣梳，點樣后80W電泳60min。電泳結束后進行銀染程序(1)脫色與固定將膠板放入10％冰醋酸中輕搖30min；(2)漂洗用蒸餾水漂洗3次，每次3min；(3)銀染1L 1％的AgNO3溶液中加2ml 37％的甲醛，放入膠板輕搖30min；(4)蒸餾水漂洗約20sec；(5)顯影在預冷的1L 30％的Na2CO3溶液中加2ml甲醛和200μl 1％ NaS2O3溶液，放入膠板輕搖直到目標片段顯示出來；(6)終止迅速將膠板轉入10％冰醋酸溶液中，終止顯色反應；(7)用蒸餾水飄洗2min；(8)將膠板自然干燥后，記錄帶型并用數碼相機照相。結果如圖2所示(泳道M為pBR332DNA/BsuRI(HaeIII)Marker，泳道1-15分別為以上述15種小麥的基因組DNA為模板的PCR擴增產物)，出現了四種電泳帶型，分別稱為帶型1、2、3和4，其片段大小分別約為198bp、216bp、232bp和240bp。其中，以蘇引10號(籽粒PPO活性10.29 A475/g min-1×103)，農大152(籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103)，豫麥21(籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103)，中梁88375(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)，臨汾138(籽粒PPO活性9.62A475/g min-1×103)，云麥46(籽粒PPO活性8.61 A475/g min-1×103)和山東928802(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)的基因組DNA為模板的PCR擴增產物均為帶型1(198bp)，實施例2的實驗結果表明這四種小麥的PPO活性明顯高于其它小麥品種，從而證明Xgwm312的198bp擴增片段的有無與小麥品種PPO活性大小密切相關，該片段出現表明該小麥品種的PPO活性高。圖2中，1為蘇引10號(籽粒PPO活性10.29 A475/g min-1×103)，2為農大152(籽粒PPO活性9.07 A475/g min-1×103)，3為豫麥21(籽粒PPO活性9.34 A475/g min-1×103)，4為中梁88375(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)，5為揚麥5號(籽粒PPO活性2.08 A475/g min-1×103)，6為豫麥56(籽粒PPO活性3.09 A475/g min-1×103)，7為冬豐9801(籽粒PPO活性2.96A475/g min-1×103)，8為晉麥50(籽粒PPO活性2.50A475/g min-1×103)，9為藁城8901(籽粒PPO活性3.29 A475/g min-1×103)，10為高優503(籽粒PPO活性4.60 A475/g min-1×103)，11為冀麥38(籽粒PPO活性2.88 A475/g min-1×103)，12為98中18(籽粒PPO活性3.27 A475/g min-1×103)，13為臨汾138(籽粒PPO活性9.62 A475/g min-1×103)，14為云麥46(籽粒PPO活性8.61 A475/gmin-1×103)，15為山東928802(籽粒PPO活性11.83 A475/g min-1×103)。
序列表<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1atcgcatgat gcacgtagag 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2acatgcatgc ctacctaatg g2權利要求
1.用于檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。
2.一種檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有198bp大小的條帶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增的反應體系的總體積為20μl，包括1×PCR緩沖液、MgCl21.5mM、dNTP各250μM、TaqDNA聚合酶1U、每條引物4pmol、模板DNA 80ng；反應條件為首先94℃變性5min；然后94℃變性1min，55℃退火55sec，72℃延伸1min，共36個循環；最后72℃延伸10min。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述檢測擴增產物方法為對擴增產物進行6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后銀染顯色。
全文摘要
本發明公開了一種檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法及其專用引物。本發明所提供的用于檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的引物，是由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列組成的一對引物。檢測小麥多酚氧化酶活性性狀的方法，是以待測小麥基因組DNA為模板，以序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列為引物，進行PCR擴增，檢測擴增產物中是否有198bp大小的條帶。本發明的方法及其專用引物將在小麥多酚氧化酶活性性狀的檢測和育種中發揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK1778966SQ20041009042
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月18日 優先權日2004年11月18日
發明者何中虎, 張立平, 孫道杰, 夏先春 申請人:中國農業科學院作物育種栽培研究所