專利名稱：酶法拆分外消旋色氨酸的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生化制品的制備方法，特別涉及一種酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法。
背景技術：
L-色氨酸是人和動物體內的重要必需氨基酸，在醫藥、食品和飼料添加劑等方面具有廣泛的用途。D-色氨酸屬于非天然氨基酸，具有獨特的生物學特性，在短肽的合成中具有重要的作用。將短肽中的某些L-氨基酸代之以D-色氨酸能產生特殊的生物特性，一些氨基酸類抗生素中雜以D-色氨酸時，難以被細菌酶降解而不至產生抗藥性，D-色氨酸及其衍生物還用于無公害新型氨基酸農藥的合成，應用前景十分廣闊。目前對L和D型色氨酸的研究工作已廣泛開展，穩定同位素15N作為一種獨特的示蹤劑，在生理和生命科學研究中得到了有效得應用。15N標記的L和D型色氨酸產品國內和國際市場前景廣闊。
氨基酸的生產方法主要有四種，即蛋白水解提取法、化學合成法、微生物發酵法和酶促轉化法。化學合成(不對稱合成法除外)的氨基酸除了甘氨酸以外均為DL型外消旋體，必須經過光學拆分才能得到D型和L型氨基酸。但氨基酸的左、右旋體在化學性質上完全一樣，而物理性質上又沒有明顯的差異，分離起來十分困難，人們不斷探索了結晶拆分法、手性試劑拆分法、色譜拆分法、膜拆分法等多種拆分方法，但效果都不能令人十分滿意。
1957年Greenstein首次報道利用從豬腎中提取的酰化酶I可以拆分40余種酰化-DL-氨基酸，此后，Chibata等人又發現米曲霉的氨基酰化酶具有良好的光學選擇性，從而替代了由動物腎臟提取的酰化酶，并于1969年在日本以DEAE-葡聚糖凝膠A-25固定化形式，最早實際了工業化生產，成功地實現了包括乙酰-DL-苯丙氨酸在內的5種乙酰化DL-氨基酸的拆分。
我國在這方面的研究始于上世紀70年代初期，進入90年代中后期，對氨基酰化酶的研究進展十分迅速，清華大學、復旦大學、天津大學、武漢大學等高等院校對氨基酰化酶的性質、提取、固定化及固定化酶拆分等方面進行了大量的研究，尤其出現了直接用米曲霉菌體或用包埋米曲霉菌體細胞進行酶拆分的新工藝，取得了比較滿意的拆分效果。
中國專利CN1856180A提供了一種利用大腸桿菌合成L-色氨酸的方法；中國專利CN1085950A提供了一種生產色氨酸的微生物及其制備方法；中國專利CN1263153A提供了一種米曲霉菌體固定化制備氨基酰化酶的方法及拆分混旋氨基酸的裝置；中國專利CN1306092A提供了一種固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生產左旋氨基酸的方法，該法對混旋乙酰氨基酸進行脫乙酰生成L-氨基酸后，對D-乙酰氨基酸進行外消旋再混入下一步拆分。世界專利WO 00/23598提供了一種用D型氨基酰化酶拆分制得D型氨基酸的方法。未見有酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法的報道。
發明內容
本發明的目的，在于提供一種酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法。使用該方法獲得的L-色氨酸15N和D-色氨酸15N產品收率高、化學純度和光學純度高。
本發明的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，以外消旋N-乙酰色氨酸15N(N-AC-DL-Trp-15N)為底物，以氨基酰化酶(EC3.5.1.14)為水解催化劑，以磷酸緩沖液為緩沖劑，以ZnCl2為酶促反應激活劑。在37℃下保溫反應，達到終點后經萃取、鹽酸水解、樹脂分離、結晶等步驟可獲得L-色氨酸15N和D-色氨酸15N，其具體步驟如下a、取一定量的N-乙酰-DL-色氨酸15N，用稀NaOH溶解后定容至0.05-0.20mol/L的濃度，再用稀鹽酸調pH＝6-8，加入等體積的10-3mol/L的ZnCl2溶液以及pH＝7.0的磷酸緩沖液，配制成酶反應液；b、按照每1000mL酶反應液加入0.2-0.4g氨基酰化酶的比例，加入氨基酰化酶酶粉；
c、在37℃下保溫反應40-60小時；d、達到終點后，反應液濃縮至原體積的1/6-1/3，用2mol/L鹽酸調節pH至1-3，用乙酸乙酯萃取3遍；e、萃取后水相蒸干以除去殘存的乙酸乙酯，然后用水溶解，再用2mol/L鹽酸調節pH至1-3，勻速流過裝有一種大孔強酸性陽離子離子交換樹脂的離子交換柱，去除雜質純化；f、用去離子水流洗交換柱，直至流出液無色，pH呈中性，無Cl-時，改用0.05-0.3mol/L的氨水洗脫，用自動收集器收集流出液中紙層析點樣確定含L-色氨酸15N的洗脫液；g、合并上述含L-色氨酸15N的洗脫液，在40-45℃下真空濃縮，趕凈氨后用60-90％的乙醇在60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，經真空干燥得到L-色氨酸15N產品；h、用旋轉蒸發器除去萃取有機相中的乙酸乙酯，然后用鹽酸調至pH＝1-3，至冰箱中過夜，抽濾獲得N-乙酰-D-色氨酸15N；i、在氮氣保護下，用2-6mol/L的鹽酸在80-110℃下水解N-乙酰-D-色氨酸15N，二者體積比控制在5∶1-20∶1之間，回流反應1.5-6小時，直至水解完全；j、水解反應結束后在氮氣保護下降溫至室溫，用10mol/L的NaOH調至色氨酸的等電點，置于-18℃冰箱中過夜；k、對步驟j得到的懸濁液進行抽濾，并用-18℃的乙醇和水混合液洗除Cl-，所得固體用60-90％的乙醇在60℃下溶解，置于-18℃結晶過夜，抽濾得到D-色氨酸15N晶體，干燥后得到一批D-色氨酸15N產品；l、對步驟k獲得的母液蒸干除去乙醇，用水溶解，調pH至1-3后，其余步驟同e、f、g，又可獲得一批D-色氨酸15N。
本發明方法簡練，設備易得，采用酶與鹽酸兩步水解法，從外消旋N-乙酰色氨酸15N得到了L-色氨酸15N和D-色氨酸15N兩種產品。有機溶劑直接萃取法即可實現L-色氨酸15N與N-乙酰-D-色氨酸15N的分離，大大縮短了操作周期；選用的大孔強酸性陽離子交換樹脂流速快、吸附溫和，用它進行色氨酸15N的去雜質過程，可大大減少強酸環境對色氨酸15N的破壞作用，而且還起到去除色素的作用；利用酒精可溶解色素的特點，采用適量酒精結晶色氨酸15N的同時省去了脫色步驟(采用活性炭脫色時色氨酸15N損失大)，提高了產品收率；在氮氣保護下用鹽酸水解N-乙酰-D-色氨酸15N，有效地解決了色氨酸15N遇氧分解的問題，采用等電點沉淀和樹脂處理兩步法提取出D-色氨酸15N，大大提高了D-色氨酸15N的收率。
具體實施例方式
實施例1.
稱取8.2克N-乙酰-DL-色氨酸15N固體，用稀NaOH溶解后加水定容至333mL，然后用稀鹽酸調節至pH＝7左右，加入等體積的濃度為10-3mol/L的ZnCl2和等體積的pH＝7.0的磷酸緩沖液至溶液總體積為1000mL。然后向溶液中加入0.3克氨基酰化酶酶粉。將混合液在水浴搖床中于37℃，120轉/min的轉速下反應48小時，此時水解率接近100％，N-乙酰-DL-色氨酸15N被拆分為L-色氨酸15N和N-乙酰-D-色氨酸15N。反應液在42℃下減壓濃縮至原體積的1/3，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，L-色氨酸15N進入水相，N-乙酰-D-色氨酸15N進入有機相，實現產物L-色氨酸15N與未反應的N-乙酰-D-色氨酸15N的分離。
將300mL大孔強酸性陽離子交換樹脂裝填于φ2.5×70cm的玻璃柱中待用。將上述水相首先在42℃下蒸干除去殘存的微量乙酸乙酯，然后用水溶解，調節pH＝2后上柱。用去離子水以50mL/h的流速流過離子交換柱，待流出液無色、呈中性、無Cl-時，改用0.2mol/L的氨水洗脫，用茚三酮顯色反應判斷流出液中含有L-色氨酸15N時收集流出液，合并液體，在42℃進行濃縮、趕氨后用適量的80％的乙醇溶液于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離出晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，得到本發明的L-色氨酸15N產品。
將上述有機相用旋轉蒸發器于42℃下除去乙酸乙酯，然后用鹽酸溶解并調至pH＝2，放入冰箱中過夜結晶，抽濾得N-乙酰-D-色氨酸15N。然后在氮氣保護下，于100℃下用2mol/L的鹽酸加熱回流，控制N-乙酰-D-色氨酸15N與鹽酸的體積比為1∶10，回流反應4小時。然后在氮氣保護下待溫度降至室溫后，用10mol/L的NaOH調至色氨酸15N的等電點，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離出固體，并用-18℃的乙醇和水的混合液反復洗滌直至除去Cl-，所得固體用80％的乙醇適量于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，所得結晶再用80％的乙醇在60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離得到本發明的一批D-色氨酸15N產品。母液蒸干除去乙醇后，用水溶解，調pH至2后上柱到裝有大孔強酸性陽離子樹脂的離子交換柱，上柱完畢后，改用去離子水洗滌，待流出液無色，pH呈中性，無Cl-時，改用0.2mol/L的氨水洗脫，用茚三酮顯色反應判斷流出液中含有D-色氨酸15N時收集流出液，合并液體，在42℃進行濃縮、趕氨后用適量的80％的乙醇溶液于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，又得到本發明的一批D-色氨酸15N產品。
實施例2.
稱取10克N-乙酰-DL-色氨酸15N固體，用稀NaOH溶解后加水定容至333mL，然后用稀鹽酸調節至pH＝7左右，加入等體積的濃度為10-3mol/L的ZnCl2和等體積的pH＝7.0的磷酸緩沖液至溶液總體積為1000mL。然后向溶液中加入0.4克氨基酰化酶酶粉。將混合液在水浴搖床中于37℃，120轉/min的轉速下反應60小時，此時水解率接近100％，N-乙酰-DL-色氨酸15N被拆分為L-色氨酸15N和N-乙酰-D-色氨酸15N。反應液在42℃下減壓濃縮至原體積的1/5，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，L-色氨酸15N進入水相，N-乙酰-D-色氨酸15N進入有機相，實現產物L-色氨酸15N與未反應的N-乙酰-D-色氨酸15N的分離。
將300mL大孔強酸性陽離子交換樹脂裝填于φ2.5×70cm的玻璃柱中待用。將上述水相首先在42℃下蒸干除去殘存的微量乙酸乙酯，然后用水溶解，調節pH＝1后上柱。用去離子水以50mL/h的流速流過離子交換柱，待流出液無色、呈中性、無Cl-時，改用0.3mol/L的氨水洗脫，用茚三酮顯色反應判斷流出液中含有L-色氨酸15N時收集流出液，合并液體，在45℃進行濃縮、趕氨后用適量的90％的乙醇溶液于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離出晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，得到本發明的L-色氨酸15N產品。
將上述有機相用旋轉蒸發器于42℃下除去乙酸乙酯，然后用鹽酸溶解并調至pH＝1，放入冰箱中過夜結晶，抽濾得N-乙酰-D-色氨酸，在氮氣保護下，于110℃下用6mol/L的鹽酸加熱回流，控制N-乙酰-D-色氨酸15N與鹽酸的體積比為1∶5，回流反應2小時。然后在氮氣保護下待溫度降至室溫后，用10mol/L的NaOH調至色氨酸15N的等電點，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離出固體，并用-18℃的乙醇和水的混合液反復洗滌直至除去Cl-，所得固體用90％的乙醇適量于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，所得結晶再用90％的乙醇在60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離得到本發明的一批D-色氨酸15N產品。母液蒸干除去乙醇后，用水溶解，調pH至1后上柱到裝有大孔強酸性陽離子樹脂的離子交換柱，上柱完畢后，改用去離子水洗滌，待流出液無色，pH呈中性，無Cl-時，改用0.3mol/L的氨水洗脫，用茚三酮顯色反應判斷流出液中含有D-色氨酸15N時收集流出液，合并液體，在42℃進行濃縮、趕氨后用適量的90％的乙醇溶液于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，又得到本發明的一批D-色氨酸15N產品。
實施例3.
稱取6克N-乙酰-DL-色氨酸15N固體，用稀NaOH溶解后加水定容至333mL，然后用稀鹽酸調節至pH＝7左右，加入等體積的濃度為10-3mol/L的ZnCl2和等體積的pH＝7.0的磷酸緩沖液至溶液總體積為1000mL。然后向溶液中加入0.2克氨基酰化酶酶粉。將混合液在水浴搖床中于37℃，120轉/min的轉速下反應40小時，此時水解率接近100％，N-乙酰-DL-色氨酸15N被拆分為L-色氨酸15N和N-乙酰-D-色氨酸15N。反應液在42℃下減壓濃縮至原體積的1/6，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，L-色氨酸15N進入水相，N-乙酰-D-色氨酸15N進入有機相，實現產物L-色氨酸15N與未反應的N-乙酰-D-色氨酸15N的分離。
將300mL大孔強酸性陽離子交換樹脂裝填于φ2.5×70cm的玻璃柱中待用。將上述水相首先在42℃下蒸干除去殘存的微量乙酸乙酯，然后用水溶解，調節pH＝3后上柱。用去離子水以50mL/h的流速流過離子交換柱，待流出液無色、呈中性、無Cl-時，改用0.1mol/L的氨水洗脫，用茚三酮顯色反應判斷流出液中含有L-色氨酸15N時收集流出液，合并液體，在40℃進行濃縮、趕氨后用適量的60％的乙醇溶液于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離出晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，得到本發明的L-色氨酸15N產品。
將上述有機相用旋轉蒸發器于42℃下除去乙酸乙酯，然后用鹽酸溶解并調至pH＝1，放入冰箱中過夜結晶，抽濾得N-乙酰-D-色氨酸。然后在氮氣保護下，于80℃下用4mol/L的鹽酸加熱回流，控制N-乙酰-D-色氨酸15N與鹽酸的體積比為1∶20，回流反應6小時。然后在氮氣保護下待溫度降至室溫后，用10mol/L的NaOH調至色氨酸15N的等電點，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離出固體，并用-18℃的乙醇和水的混合液反復洗滌直至除去Cl-，所得固體用60％的乙醇適量于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，所得結晶再用60％的乙醇在60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離得到本發明的一批D-色氨酸15N產品。母液蒸干除去乙醇后，用水溶解，調pH至3后上柱到裝有大孔強酸性陽離子樹脂的離子交換柱，上柱完畢后，改用去離子水洗滌，待流出液無色，pH呈中性，無Cl-時，改用0.1mol/L的氨水洗脫，用茚三酮顯色反應判斷流出液中含有D-色氨酸15N時收集流出液，合并液體，在42℃進行濃縮、趕氨后用適量的60％的乙醇溶液于60℃下溶解，置于-18℃下結晶過夜，抽濾分離晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，又得到本發明的一批D-色氨酸15N產品。
采用本發明的方法得到的L-色氨酸15N產品和D-色氨酸15N產品，其純度達到98％以上，收率分別達到80％、70％，旋光度分別為[α]D20＝-32±0.50(c＝1，H2O)、[α]D20＝+32±10(c＝1，H2O)。
權利要求
1.一種酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于以N-乙酰-DL-色氨酸15N為原料，按以下步驟制備A、配制酶反應液取一定量的N-乙酰-DL-色氨酸15N，用稀NaOH溶解后配制成濃度為0.05-0.20mol/L的溶液，調節pH＝6-8，加入ZnCl2溶液和磷酸緩沖液，配制成酶反應液；B、酶水解拆分N-乙酰-DL-色氨酸15N向步驟A所得酶反應液中加入氨基酰化酶，加熱反應，N-乙酰-DL-色氨酸15N被拆分為L-色氨酸15N和N-乙酰-D-色氨酸15N；C、萃取分離L-色氨酸15N和N-乙酰-D-色氨酸15N將步驟B所得溶液濃縮，調節pH為1-3，用乙酸乙酯萃取，L-色氨酸15N進入水相，N-乙酰-D-色氨酸15N進入有機相；D、樹脂分離出L-色氨酸15N將步驟C萃取后所得水相蒸干除去乙酸乙酯，用水溶解，調節pH為1-3，導入強酸性陽離子交換樹脂柱吸附，用去離子水流洗柱至檢驗不出Cl-，然后用稀氨水洗脫，收集含有L-色氨酸15N的洗脫液；E、精制出L-色氨酸15N產品將步驟D所得含有L-色氨酸15N的洗脫液，經濃縮、去氨、結晶、分離、干燥得到L-色氨酸15N產品；F、鹽酸水解制備D-色氨酸15N將步驟C萃取后所得有機相除去乙酸乙酯，用鹽酸調至pH＝1-3，至冰箱中過夜，抽濾得N-乙酰-D-色氨酸15N，然后在氮氣保護下，加入鹽酸加熱水解，得到含D-色氨酸15N的溶液；G、等電點沉淀出D-色氨酸15N并精制成D-色氨酸15N產品將步驟F所得含有D-色氨酸15N的溶液冷卻后用NaOH調至色氨酸的等電點，經結晶、分離、去氯、重結晶、分離、干燥得到D-色氨酸15N產品；H、樹脂分離出殘留D-色氨酸15N并精制成D-色氨酸15N產品將步驟G結晶和重結晶后分離所得母液蒸干除去乙醇后按與步驟D、步驟E相同的方法處理得到殘留在母液中的D-色氨酸15N產品。
2.根據權利要求1所述的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于所述的步驟A中所加入的ZnCl2溶液的濃度為10-3mol/L，體積與底液相等，所加入的磷酸緩沖液的體積與底液相等。
3.根據權利要求1所述的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于所述的步驟B中加入氨基酰化酶的量控制在每1000mL酶反應液加入氨基酰化酶0.2-0.4克；加熱溫度為35-40℃；反應時間為40-60小時。
4.根據權利要求1所述的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于所述的步驟D中，強酸性陽離子交換樹脂柱中采用大孔強酸性陽離子交換樹脂；氨水的濃度為0.05-0.3mol/L；以紙層折點樣確定洗脫液中的L-色氨酸15N。
5.根據權利要求1所述的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于步驟E中所述的L-色氨酸15N精制的具體步驟是，在40-45℃下真空濃縮，趕凈氨后用60-90％的乙醇在60℃下溶解，在-18℃下結晶，抽濾分離出晶體，并用-18℃的乙醇和水混合液反復洗滌，真空干燥得到L-色氨酸15N產品。
6.根據權利要求1所述的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于所述的步驟F中，除去有機相中的乙酸乙酯在旋轉蒸發器中進行；水解用鹽酸的濃度為2-6mol/L；水解溫度為80-110℃；鹽酸與N-乙酰-D-色氨酸15N的體積比為5-20∶1。
7.根據權利要求1所述的酶法拆分外消旋色氨酸15N制備左旋和右旋色氨酸15N的方法，其特征在于步驟G中所述的等電點沉淀出D-色氨酸15N的具體步驟是，溶液調至色氨酸的等電點后，置于-18℃下結晶，抽濾分離出固體，并用-18℃的乙醇和水混合液洗除Cl-，所得晶體用60-90％的乙醇在60℃下溶解，再置于-18℃下結晶，抽濾分離出D-色氨酸15N晶體，干燥后得到D-色氨酸15N產品。
全文摘要
本發明提供了一種酶法拆分外消旋色氨酸
文檔編號C12P41/00GK1782088SQ200410089078
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月3日 優先權日2004年12月3日
發明者羅鳳山, 呂志賢, 孫建春, 李良君, 杜曉寧, 宋明鳴 申請人:上海化工研究院