根癌農桿菌介導的質粒對頂頭孢霉的轉化方法

專利名稱：根癌農桿菌介導的質粒對頂頭孢霉的轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種頂頭孢霉的轉化方法，特別是一種基于根癌農桿菌介導的頂頭孢霉轉化方法。
背景技術：
傳統的頂頭孢霉的轉化法還是采用原生質體法轉化，與高效率的質粒轉化大腸桿菌相比(通常轉化率可達108～109轉化子/μg質粒DNA)，目前在頂頭孢霉質粒轉化中普遍使用的原生質體方法，其轉化率非常低，僅達1-4轉化子/μg質粒DNA。
在植物基因工程研究中，一個普遍使用的方法是由根癌農桿菌Ti質粒(Tumor-inducing plasmid)介導的二元質粒轉化方法(Bundock P，1995)。最近，Marcel等(Marcel，1998)將這個方法應用于絲狀真菌的轉化，并已在黑曲霉、盤長孢狀毛盤孢(Colletotrichum gloeosporioides)、Fusariumvenenatum、瑞氏木霉和粗糙鏈孢霉等絲狀真菌中獲得成功，轉化頻率與常規的原生質體方法相比可提高600倍。這個成功的例子啟迪我們可根據其原理建立Ti質粒轉化頂頭孢霉的新方法，提高轉化率，有望突破頂頭孢霉基因工程研究的這一瓶頸，促進這個重要的工業微生物菌種的基因工程改良。
現有的載體質粒轉化頂頭孢霉的效率很低，僅1～4cfu/μg質粒DNA(質粒對大腸桿菌和鏈霉菌的轉化率可分別達106-9和105cfu/μg質粒DNA)，這成為從事頂頭孢霉基因工程研究的最大障礙。

發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種根癌農桿菌介導的質粒對頂頭孢霉轉化的方法，以克服現有技術的不足。
本發明需要解決的另一個技術問題是公開一種含有質粒pYG306的根癌農桿菌。
建立了根癌農桿菌介導的質粒對頂頭孢霉(頭孢菌素C產生菌)的轉化，具有極大的工業價值。
本發明的方法包括如下步驟(1)構建重組載體質粒pYG306，其含有真菌中廣泛使用的構巢曲霉啟動子PtrpC和相應的終止子TtrpC，在啟動子下游含有供選擇用的博萊霉素抗性基因和細菌來源的vgb基因；pYG306質粒的構建可參見文獻沈陽藥科大學學報，2003年20卷第6期451頁。
(2)采用電激轉化法和三親雜交法，構建根癌農桿菌Ti質粒介導轉化法中需要的含雙元載體系統的供體，用含有雙元載體系統的根癌農桿菌與頂頭孢霉原生質體共培養，在含乙酰丁香酮的條件下，篩選到博萊霉素抗性轉化子的效率達到140cfu/107原生質體；(3)用含有雙元載體系統的根癌農桿菌與頂頭孢霉菌絲體共培養，在含或不含乙酰丁香酮的條件下，能得到博萊霉素轉化子，轉化效率分別為104和44。
根癌農桿菌T-DNA介導的外源基因的轉化效率是PEG-CaCl2介導的原生質體的轉化效率的15倍。轉化子質粒DNA抽提物中未發現原質粒，通過Southern blotting分析，PCR擴增，測序等證明質粒已經整合進頂頭孢霉的染色體中。
通過該項目的研究，解決轉化率低這個限制頂頭孢霉基因工程研究的瓶頸問題，將有可能使頂頭孢霉的基因工程研究能象大腸桿菌和鏈霉菌那樣很好地開展起來，從而促進這一工業真菌的基因工程改良。
在PEG/CaCl2介導的絲狀真菌——頂頭孢霉原生質體轉化法中，每107受體原生質體細胞得到的博萊霉素抗性轉化子僅為6～11個，相當于每μg質粒DNA可得到6～11個博萊霉素抗性轉化子。與以前的1～4個轉化子相比，轉化率已經有了較大的提高。
用含有雙元載體的根癌農桿菌(pYG306)與頂頭孢霉原生質體共培養，在含有10μg/ml博萊霉素的最低營養培養基上篩選轉化子，轉化子數量較少，降低博萊霉素的篩選濃度為5μg/ml時，篩選得到的轉化子的數量為每107個受體細胞可得到109個博萊霉素抗性轉化子，說明適當降低抗生素的使用濃度，有利于含有目的基因的轉化子的篩選。
同樣將得到的轉化子在含博萊霉素的平板上連續傳代五代后，淘汰假陽性轉化子，再轉接到不含相應濃度的博萊霉素的平板上連續培養五代后，發現抗性沒有丟失現象，表現為抗博萊霉素的遺傳性能穩定。
用含有雙元載體系統的根癌農桿菌(pYG306)與頂頭孢霉原生質體共培養時，vir基因的誘導作用至關重要。加入乙酰丁香酮后轉化效率達140cfu/107原生質體。
用含有雙元載體系統的根癌農桿菌(pYG306)與頂頭孢霉菌絲體共培養，在含或不含AS的條件下，均能得到博萊霉素抗性(10μg/ml)轉化子，前者與后者的轉化子分別為104和44。
(4)對根癌農桿菌Ti質粒介導的轉化法中獲得的兩種抗性轉化子基因組DNA進行Southern雜交分析，結果顯示雜交結果呈陽性，對照未轉化的頂頭孢霉雜交結果呈陰性，說明前二者的基因組DNA中存在vgb基因同源片段。
利用PCR方法從博萊霉素抗性轉化子基因組DNA中分別擴增出vgb基因片段，擴增片段分別克隆到載體質粒pBluescript KS中并命名為pYG304，而在相同條件下不能從未轉化的頂頭孢霉基因組DNA中擴增出任何片段。
基因序列同源性分析結果表明，從兩種博萊霉素抗性轉化子基因組DNA中擴增出的vgb基因序列完全相同，它們和報道的vgb基因的同源性為99.3％，氨基酸序列同源性為99.3％。
VHb表達的SDS-PAGE分析結果表明vgb基因在頂頭孢霉中表達量較低。
CO結合試驗分析結果表明與對照(vgb-菌株)相比，博來霉素抗性轉化子在420nm處產生了吸收峰。說明轉化子細胞中表達了血紅蛋白，且具有生物活性。
本發明的有益效果如下與PEG-CaCl2方法比較，本發明的方法除了具有高轉化率的特點外，是否還具有高的整合率和高的表達率，本文明的優點1、與傳統方法比較，轉化率大大提高；2、除了可以用原生質體，還可以用菌絲體法轉化；3、與傳統方法比較，導入的質粒范圍大大擴大；4、可以更方便地對頭孢菌素C產生菌進行遺傳操作，為利用生物技術改良抗生素產生菌建立基礎。


圖1為質粒pYG306的構建圖2為質粒pYG306酶切電泳鑒定圖3為2-3電場強度對根癌農桿菌存活率的影響圖4為2-4電場強度及電脈沖時間對轉化率的影響圖5為2-5細胞濃度對轉化率的影響圖6為2-6根癌農桿菌生長時期對轉化率的影響圖7為2-7 pYG306的酶切電泳鑒定圖8為2-8 PCR(vgb基因)擴增產物電泳9為2-9 pYG303質粒的構建圖10為2-10質粒pYG303的酶切電泳鑒定(EcoRI and HindIII)圖11為根癌農桿菌質粒中擴增的vgb基因序列與發表序列的比對(深區域表示相同堿基)圖12為3-1頂頭孢霉菌抗性轉化子的菌落形態圖13為3-2基因組DNA的電泳鑒定圖14為3-3 vgb基因探針標記效率的測定圖15為3-4博萊霉素抗性轉化子基因組DNA的Southern雜交分析1.pYG715vgb2.vgb(500bp)3.C.acremonium transformants CCOM31*C.acremonium轉化子CCOM314.C.acremonium transformants CCOM31/ClaIC.acremonium轉化子CCOM31/ClaI酶切5.C.acremonium transformants CCOP13**C.acremonium轉化子CCOP136.C.acremonium transformants CCOP13/ClaIC.acremonium轉化子CCOP13/ClaI酶切7.C.acremonium(untransformed)C.acremonium(未轉化的)8.C.acremonium(untransformed)/ClaIC.acremonium(未轉化的)/ClaI酶切M.λDNA Marker(HindIII digested，TaKaRa Biotech)M.λDNA分子量標準(HindIII酶切)CCOM31*根癌農桿菌與頂頭孢霉菌絲共轉化獲得的轉化子
CCOP13**根癌農桿菌與頂頭孢霉原生質體共轉化獲得的轉化子Tm Difference between primers3.1；GC Difference3.1總體積V＝20μl，*template from C.acremonium transformant by protoplastscocultivation，**PCR products of I，***template from C.acremoniumtransformant by mycellium cocultivation*原生質體轉化法獲得的C.acremonium轉化子中分離得到的基因組DNA為模板，**I的PCR產物，***菌絲體轉化法獲得的C.acremonium轉化子中分離得到的基因組DNA為模板圖16為3-5 PCR(vgb基因)擴增產物電泳圖1.template from C.acremonium transformant CCOP13；C.acremonium轉化子CCOP13中分離得到的基因組DNA為模板2.PCR products of I；I的PCR產品3.without template；4.without Taq polymerase3.沒有模板.4。沒有Taq聚合酶圖17為3-6 PCR(vgb基因)擴增產物電泳圖M.DI 2000 marker1.template from C.acremonium transformant CCOM31；C.acremonium轉化子CCOM31中分離得到的基因組DNA為模板2.without template；沒有模板3.without Taq polymerase沒有Taq聚合酶圖18為3-7 E.coli DH5α陽性克隆質粒EcoRI and HindIII酶切電泳圖譜
M.λDNA Marker(HindIII digested，TaKaRa Biotech)；1，3positive plasmids pYG304；陽性質粒pYG3042control(pBluescript KS)；對照(pBluescript KS)圖19為3-8 pYG304質粒的構建圖20為3-9頂頭孢霉轉化子中括增vgb基因序列與發表序列的比對(深區域表示相同堿基)圖21為3-10括增vgb基因編碼VHb與發表氨基酸序列比對(深區域表示相同堿基)圖22為3-11 VHb表達的SDS-PAGE分析1sonicated extract of C.acremonium(CCOP13)C.acremonium(CCOP13)的超聲波破碎提取物2sonicated extract of C.acremonium(CCOM31)C.acremonium(CCOM31)的超聲波破碎提取物3sonicated extract of C.acremonium(untransformated)C.acremonium(未轉化的)的超聲波破碎提取物Mlow MW protein marker圖23為3-12頂頭孢霉菌轉化子CCOM31細胞抽提液CO結合差光譜分析圖A、control(without vgb gene)；對照(沒有vgb基因)B、transformant CCOM31(with vgb gene)轉化子CCOM31(有vgb基因)圖24為3-13頂頭孢霉轉化子CCOP13細胞抽提液CO結合差光譜分析圖。
A、control(without vgb gene)；對照(沒有vgb基因)B、transformant CCOP13(with vgb gene)轉化子CCOP13(有vgb基因)具體實施方式
pBI121為一常用的二元轉化載體質粒，可從Clontech公司購得。
pYG715/vgb質粒的構建可參見文獻中國抗生素雜志1999年24卷第4期269頁。
實施例1中間載體質粒pYG306的構建用SacI和HindIII雙酶切質粒pBI121，瓊脂糖凝膠電泳分離后，用TheGene-clean II kit(可從Qbiogene公司購得)回收含有T-DNA的10.3kb的大片段，然后經Klenow酶補平5′端，經Mung bean nuclease切平3′端，再經T4DNA連接酶連接構建質粒pYG305。在pYG305的T-DNA左右邊界之間有EcoRI單酶切點，用EcoRI分別酶切質粒pYG715vgb和pYG305，瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收兩個質粒的酶切片段，其中pYG715vgb的6.3kb片段經CIAP堿性磷酸酶去磷酸化后，與pYG305大片段經T4DNA連接酶連接，構建成中間載體質粒pYG306。中間載體構建流程圖見圖1。
實施例2質粒pYG306的酶切鑒定中間載體質粒pYG306大小為16.6kbp，連接產物轉化大腸桿菌，篩選Apr、Kmr、Rifr、Smr的抗性轉化子，經質粒提取、酶切和電泳驗證結果見圖2。
酶切結果顯示質粒大小及主要酶切位點正確。
實施例3
電激轉化法轉化根癌農桿菌的研究中間載體pYG306經電激轉化轉入根癌農桿菌LBA4404中，可用100μg/ml Ap、50μg/ml Km篩選抗性轉化子。
電場強度對根癌農桿菌存活率的影響電場強度是電激轉化中的重要參數，細胞存活率直接與轉化率有關。電場強度對細胞存活率的影響見圖3。致死率隨著場強的增加而提高，表現為細胞存活率隨著場強的增加而下降。在場強達到15kv.cm-1時，細胞存活率僅為17.5％。
電場強度及電脈沖時間對轉化率的影響電場強度和脈沖時間是影響轉化效率的兩個關鍵因素。在電激轉化過程中，在電場的作用下，細胞表面結構的兩側形成極化，產生高強度的跨膜電勢，當該電位差超過某一臨界水平時，細胞表面被擊穿而產生暫時性的孔道，這些孔道是外源分子進出的孔隙。這些過程在幾秒到幾十毫秒內完成，因此，從理論上講，只要采用足夠高的電場強度擊穿細胞，并用一定時間的電壓維持這些孔道的存在就可以實現細胞的轉化。
為考慮電場強度及脈沖時間兩項綜合因素對轉化率的影響，分別在2、6、8、10、15kv.cm-1的電場強度下，通過改變電路中電容值的大小來控制脈沖時間的長短(2、4、6、9、11ms)，結果見圖4。電場強度的影響較為復雜，電場強度恒定時，脈沖時間延長，轉化效率在一定范圍內增加，更長的脈沖時間將導致轉化效率明顯降低，不同電場強度在某一脈沖時間有最大轉化率。本實驗表明，場強8kv.cm-1，脈沖6ms時，A.tumefaciens菌株的電轉化效率最高，每μg質粒可轉化得400個轉化子。
實施例4細胞濃度對轉化率的影響將根癌農桿菌細胞懸液按1∶10梯度稀釋。取每種濃度的細胞懸液50μl，加上5μl質粒溶液，電激轉化條件為25μF電容器，300Ω并聯電阻和8kv場強，電脈沖時間分別為6.96ms，電激轉化后，從1ml培養物中取出100μl涂布抗性平板。細胞濃度對轉化率的影響見圖5。
細胞濃度和轉化效率的關系結果顯示在實驗范圍內，細菌濃度越高轉化率越高，兩者成正相關，在本實驗條件下當細胞濃度為1×1010時，每μg質粒DNA可得到385個轉化子。
實施例5根癌農桿菌生長時期對轉化率的影響按3％～5％接種量，將菌株培養至不同的生長時期(分別在接種后3、4、6h)(OD600分別為0.816、1.05、1.217)(細胞濃度均達到107L-1數量級)，取樣，分別制備感受態細胞，在場強為8kv.cm-1，脈沖時間為6ms時進行電激轉化，結果見圖6。細胞生長至OD600為1.05的菌株轉化效率最高，每μg質粒可得到126個轉化子，表明處于對數生長中期的A.tumefaciens LAB4404菌株，其轉化效率高于對數生長早、晚期(每μg質粒分別可得到83、84個轉化子)的菌株。
處于對數生長早期的菌株數量較少，轉化率不高，處于對數生長后期的菌株，細胞壁結構致密，外源DNA不易進入。而處于對數生長中期的菌株生命力旺盛，細胞壁結構致密性相對差，外源DNA容易進入，因而轉化率高。
實施例6影響三親雜交法的各種因素A.tumefaciens LAB4404菌株的生長周期、各菌株濃度、菌株之間的配比和菌株結合培養時間等對構建帶有雙元載體系統的的A.tumefaciensLAB4404(pYG306)均有影響。處于對數生長中期的A.tumefaciens LAB4404菌株，其轉化效率高于對數生長早、晚期和穩定期的菌株；適當增加三親雜交三株菌的濃度，抗性轉化子數目明顯增加，但濃度過高不利于抗性轉化子的檢出；Ecoli HB101(pRK2013)，Ecoli DH5α(pYG306)和A.tumtfaeitus(LBA4404)三個菌株的接合比例由1∶1∶1改為2∶1∶1，即增加誘動菌Ecoli HB101的濃度，有利于轉化子的檢出；菌株在28℃條件下的結合培養時間對轉化率影響較大，以放置1.5h時，轉化率最高。
實施例7抗性轉化子質粒的酶切驗證用限制性內切酶ScaI(單一酶切位點)對電激轉化和三親雜交轉化所獲抗性轉化子的質粒DNA進行酶切消化，再電泳檢測，結果見圖7，抗性轉化子的質粒大小正確(16kb)。
實施例8PCR擴增根癌農桿菌質粒中的vgb基因為了驗證上述工作中得到的根癌農桿菌質粒中vgb基因的存在，以這些根癌農桿菌中的質粒DNA為模板，進行PCR擴增vgb基因實驗，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢查，結果如圖8。結果表明兩種轉化方法所得到的根癌農桿菌質粒上均擴增出預期大小的目的片段(約500bp)，而從陰性對照組中卻沒有擴增出相應的條帶。表明vgb基因在構建的各個根癌農桿菌質粒上確實存在。
實施例9vgb基因的亞克隆和測序將從根癌農桿菌質粒中擴增出的PCR產物和載體質粒pBluescript KS分別用EcoRI，HindIII雙酶切，并采用Boyle提出的DNA純化方法(1995)分別回收目的條帶(0.5kb和2.9kb)DNA，經T4ligase的連接后，構建質粒pYG303(圖9)，轉化E.coli DH5α感受態細胞，在含Ap的LB平板上隨機挑取抗性單菌落，提取質粒并進行EcoRI和HindIII雙酶切，電泳鑒定，結果如圖10。
將從根癌農桿菌質粒中擴增出的片段克隆到載體質粒pBluescript KS后構建的質粒pYG303送上海聯合基因公司進行測序，結果見圖11。
上海聯合基因公司采用T7啟動子引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)對質粒pYG303中的vgb進行測序，獲得完整的擴增片段序列，整個vgb片段長度為441bp。
測得的擴增vgb序列和已發表的vgb序列比較后發現同源性為100％，表明克隆進根癌農桿菌中的質粒攜帶的vgb基因正確。
實施例10博萊霉素對頂頭孢霉最低抑菌濃度的測定文獻檢索表明常見的絲狀真菌抗性選擇性標記如表1所示。
為了便于質粒轉化頂頭孢霉后篩選轉化子，必須選擇合適的抗性基因作為選擇性標記，本研究前期工作中根據實驗室現有的抗性基因情況對頂頭孢霉進行了多種抗生素的耐藥性試驗。結果，頂頭孢霉僅對博萊霉素、腐草霉素、潮霉素等抗生素敏感。
考慮到腐草霉素在國內難以獲得，而博萊霉素是和腐草霉素同類型的作用于DNA的寡肽抗生素，而且在國內較容易獲得，所以本研究工作選擇博萊霉素取代腐草霉素為抗性選擇壓力。
本研究工作進一步就博萊霉素對頂頭孢霉的最低抑菌濃度進行了測定如表2。結果表明，博萊霉素對頂頭孢霉的最低抑菌濃度是0.5μg/ml。因此，最終把轉化子篩選平板的博萊霉素濃度定為5～10μg/ml。
表1絲狀真菌載體常用的抗性選擇性標記


表2博來霉素對頂頭孢霉的最低抑菌濃度

+Growth；-No growth實施例11根癌農桿菌Ti質粒介導的頂頭孢霉轉化方法的建立借助根癌農桿菌轉化條件研究最終完成根癌農桿菌介導的頂頭孢霉轉化方法的建立，并通過雜交確認vgb已整合入頂頭孢霉基因組DNA中。
頂頭孢霉菌絲的共轉化及博萊霉素抗性分析用含有雙元載體系統的根癌農桿菌(pYG306)與頂頭孢霉菌絲體共培養，在含或不含AS的條件下，均能得到博萊霉素抗性(10μg/ml)轉化子，前者與后者的轉化子比為104∶44(見表3)。所得到的轉化子的菌落形態基本正常，見圖12。將得到的轉化子在含博萊霉素的平板上連續傳代五代后，淘汰假陽性轉化子，再轉接到不含相應濃度的博萊霉素的平板上連續培養五代后，發現抗性沒有丟失現象。表現為抗博萊霉素的遺傳性能穩定。
表3根癌農桿菌(含質粒pYG306)介導的頂頭孢霉菌絲共轉化

實施例12頂頭孢霉原生質體的共轉化及博萊霉素抗性分析將中間載體質粒pYG306通過電激轉化法或三親雜交法轉入根癌農桿菌LBA4404中，篩選標記為四種抗性(Ap 100μg/ml，Km 50μg/ml，Rif 50μg/ml，Sm 30μg/ml)；1)將含有雙元載體的根癌農桿菌LBA4404在含有四種抗生素的LB液體培養基中培養48h，離心洗滌菌體，經誘導培養基誘導培養6h(添加乙酰丁香酮，AS)；2)對于頂頭孢霉的原生質體共培養將100μl原生質體(2×107～3×108個原生質體/ml)與100μl的根癌農桿菌LBA440誘導培養物混合；對于頂頭孢霉菌絲體的共培養將100mg濕重的菌絲體與100μl的根癌農桿菌LBA440誘導培養物混合；3)分別將這些混合物點種在含有10mmol/L葡萄糖(含有或不含有AS)的共培養培養基表面的硝酸纖維素濾膜上，28℃培養3～5天，直到濾膜表面長出菌苔；4)將上述濾膜轉移到含有200μmol/L頭孢噻肟(cefotaxime，殺死根癌農桿菌LBA4404))和10μg/ml博萊霉素(bleomycin)的頂頭孢霉基礎培養基上，28℃培養5～7天，篩選抗性轉化子。
用含有雙元載體系統的根癌農桿菌(pYG306)與頂頭孢霉原生質體共培養(見方法)，在含乙酰丁香酮(AS)的條件下，可篩選博萊霉素抗性(10μg/ml)轉化子，而在不含AS的對照組中，沒有博萊霉素抗性轉化子(表4)。結果表明vir基因的誘導作用在根癌農桿菌介導的頂頭孢霉原生質體轉化中至關重要。其轉化效率達80至140cfu/107原生質體。
將得到的轉化子在含博萊霉素的平板上連續傳代五代后，淘汰假陽性轉化子，再轉接到不含相應濃度的博萊霉素的平板上連續培養五代后，發現抗性沒有丟失現象，表現為抗博萊霉素的遺傳性能穩定。
表4根癌農桿菌(含質粒pYG306)介導的頂頭孢霉原生質體共轉化

實施例13
PEG-CaCl2原生質體轉化法與根癌農桿菌介導轉化法的比較將根癌農桿菌T-DNA介導的外源基因vgb的轉化作用和PEG-CaCl2介導的原生質體的轉化作用進行比較，結果見表5。這里均以100mg濕重的菌絲體制備的原生質體為比較單位。表5結果顯示根癌農桿菌T-DNA介導的外源基因vgb的轉化效率是PEG-CaCl2介導的原生質體的轉化效率的15.9倍。
表5 PEG-CaCl2原生質體轉化法與根癌農桿菌介導轉化法的比較

實施例14頂頭孢霉抗性轉化子基因組DNA的提取首先提取上述兩種轉化方法獲得的博萊霉素抗性轉化子的基因組DNA，將它們溶解在TEL溶液中，經過適當比例的稀釋，用分光光度計測定其濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度，結果見表6和圖13，從A260/A280比值和電泳圖譜觀察，所提取的DNA質量符合要求。此外，據文獻報道(Chien等，1976)，基因組DNA溶液中的EDTA濃度能夠因螯合Mg2+而影響PCR反應。因此，在所提取的模板DNA中不應含有高濃度的鰲合劑EDTA，也不應含有高濃度的帶負電荷離子基團，所以將提取的基因組DNA溶解在TEL緩沖液中，TEL中的EDTA濃度只有TE緩沖液的十分之一。本研究將此方法提取的DNA進行EcoRI、Sau3A等酶切鑒定，發現所提取的DNA能有效地被特定的限制內切酶消化。
表6博萊霉素抗性轉化子基因組DNA的特性

樣品1從未轉化的頂頭孢霉JM-2002中分離得到的基因組DNA樣品2從根癌農桿菌介導的原生質體轉化法獲得的一株頂頭孢霉轉化子中分離得到的基因組DNA樣品3從根癌農桿菌介導的菌絲體轉化法獲得的一株頂頭孢霉轉化子中分離得到的基因組DNA實施例15頂頭孢霉博萊霉素抗性轉化子基因組DNA的Southern blotting雜交分析以pHZ1250來源的vgb基因為模板制作地高辛標記的探針，然后將探針溶液和地高辛標記的標準樣品按照相同的方式進行稀釋，將一系列稀釋梯度溶液分別點樣在尼龍膜上，在顯影后的膠片上觀察到第5稀釋度的標準和探針樣品都可見(如圖14)，經過和標準樣品的濃度比較測得探針濃度為33μg/ml。
以攜帶pHZ1250來源vgb基因的質粒pYG715vgb經ClaI酶切樣品為陽性對照，把兩種不同轉化方法獲得的博萊霉素抗性轉化子基因組DNA用BamHI酶切，瓊脂糖凝膠電泳并將DNA轉移到尼龍膜上進行Southern雜交，結果發現DNA分子量標準上沒有雜交條帶；陽性對照在500bp有相應的陽性條帶；兩種不同轉化方法獲得的博萊霉素抗性轉化子基因組DNA經BamHI酶切后的泳道上出現相應的陽性條帶，而未經轉化的對照頂頭孢霉DNA泳道上卻沒有出現陽性條帶(如圖15)。本研究結果表明經兩種不同轉化方法獲得的博萊霉素抗性轉化子基因組DNA中存在vgb基因同源片段。
實施例16PCR引物的設計根據pYG715/vgb質粒中vgb的基因序列，在利用美國Informax公司Vector NTI Suite軟件輔助設計引物時，考慮到了幾方面的因素(1)設計引物時，為便于克隆到載體質粒pBluescript KS，設計的引物5′端分別帶有酶切位點EcoRI和HindIII。所選擇的限制酶識別序列在目的片段中是沒有的，寡核苷酸引物的5′端存在不配對的堿基，并不影響它引導DNA合成的能力。在后續的擴增循環中，這些與初始模板并不配對的序列將被帶到雙鏈DNA中去，因而反應產物既含有目的序列，同時兩側又有新的限制酶識別位點。用相應的酶切割這些位點后，便可將DNA擴增產物高效地插入帶有相應末端的載體中去，便于進一步的研究。(2)位于末端的酶切位點可能在切割時有困難，為保證PCR擴增產物有較高的EcoRI和HindIII酶切割效率，在識別位點的5′EcoRI端增加了3個堿基CCGGAATTCCGG，以保證酶切效率達到75％以上。在HindIII的外側也增加了3個堿基CCCAAGCTTGGG。(4)據文獻報道，引物3末端堿基在錯誤配對時，對不同堿基的引發效率存在很大差異，當末位堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能引發鏈的合成，而末位堿基為T時，錯配時引發效率大大降低。所以3末端的末位堿基最好選用T、C、G，而不選A。(5)用計算機輔助分析引物內部是否有二級結構形成，兩引物之間特別在3′末端有無互補鏈存在。設計的引物及其性質如表7。
表7 vgb基因引物序列及其性質

實施例17PCR反應體系的建立參考前面所述的條件進行PCR反應，分別考察了PCR反應體系中的dNTP、模板、Mg2+、以及反應條件中的變性、退火、延伸溫度和時間等參數后建立了擴增vgb基因的反應體系和條件，見表8。
以博萊霉素抗性轉化子基因組DNA為模板，利用合成的引物PCR擴增vgb基因，擴增產物的電泳結果見圖16，圖17。結果顯示頂頭孢霉博萊霉素抗性轉化子中有與vgb基因大小相符合的條帶(約0.5kb)。
實驗中發現反應體系中Mg2+的濃度對于PCR產物的擴增至關重要。Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量，甚至使PCR擴增失敗。在本研究中，MgCl2的濃度在3.5mmol/L，取得了較為滿意的結果。
表8 PCR反應體系組成

實施例18vgb基因的亞克隆和測序將從頂頭孢霉博萊霉素抗性轉化子中擴增出的PCR產物和載體質粒pBluescript KS分別用EcoRI，HindIII雙酶切，并分別回收目的條帶(0.5kb和2.9kb)DNA，經T4ligase連接后，轉化E.coli DH5α感受態細胞，在含Ap的LB平板上隨機挑取抗性單菌落，經質粒提取、酶切電泳鑒定(見圖18)、篩選重組質粒，重組質粒分別定名為pYG304，大小為3400bp(圖19)，最后將質粒分別送上海聯合基因公司進行測序。
聯合基因公司對上述擴增出的PCR產物，采用T7啟動子引物(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)進行測序，獲得完整的擴增片段序列，整個片段長度為441bp。測得的序列和已知序列比較后發現同源性為99.3％，表明vgb基因已正確整合入頂頭孢霉基因組DNA中。
實施例19vgb基因的同源性分析
利用計算機軟件Vector NTI Suite進行分析，頂頭孢霉博萊霉素抗性轉化子基因組DNA的PCR擴增產物的序列與標準vgb基因比較結果如圖20。
結果表明所測出的vgb基因全長序列的441bp中，有3個堿基對的差異，發現它們之間同源性為99.3％，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。
同時經過氨基酸序列分析，發現頂頭孢霉菌博萊霉素抗性轉化子基因組PCR擴增產物和透明顫菌來源vgb基因的氨基酸序列同源性為99.3％(如圖21)。
VHb表達的SDS-PAGE分析頂頭孢霉菌絲體經超聲波破碎離心后的上清液經濃縮100倍后通過SDS-PAGE電泳，與對照相比，在15kd附近有一蛋白條帶(如圖22)，但含量很少，說明vgb基因在頂頭孢霉中的表達量還是比較低。
實施例20VHb蛋白在頂頭孢霉中的表達的CO結合試驗分析透明顫菌血紅蛋白的分析方法主要有電泳法、印記法、紅外光譜法、核磁共振波譜法及紫外-可見光譜等等。與紫外可見光譜法比較，前幾種方法分別存在操作繁瑣、測量周期長、不易定量或價格昂貴等特點，因此不能快速準確的反映重組菌細胞內VHb表達的情況。反之紫外可見光譜法，則具有特異性強，成本低廉，操作簡單及可定量檢測等許多優點。
離心收集頂頭孢霉菌絲體，將菌絲體用玻璃勻漿器研磨破碎菌體小球，用蒸餾水離心洗滌，沉淀懸浮于10ml磷酸緩沖液(0.1mol/L Na2HPO489.5ml，0.1mol/L NaH2PO410.4ml，pH 7.8)，采取反復凍融結合超聲破碎處理，用JY88-II型超聲波細胞粉碎機300～400瓦超聲破碎20-40次(超聲處理20s，停20s，冰浴靜置2min，然后重復操作)，取樣顯微鏡下觀察絲狀菌絲體消失、細胞碎片聚團即可。超聲破碎后離心(6000r/min，5min)去除細胞碎片，上層裂解液分成等體積兩份(各5ml)。分別加入20mg連二亞硫酸鈉，其中一份通CO，鼓泡15min，另一份做參比，用分光光度計在420nm處測其差光值。
頂頭孢霉轉化子(vgb+)細胞抽提液吸收CO后，通過分光光度計測定CO結合差光譜，發現與對照(vgb-)相比，轉化子在420nm處產生了吸收峰。如圖23、圖24。說明轉化子細胞中表達了血紅蛋白，且具有生物活性。
權利要求
1.一種根癌農桿菌介導的頂頭孢霉的轉化方法，包括以下步驟(1)構建重組載體質粒；(2)通過電激法和三親雜交法將載體質粒導入根癌農桿菌中，構建含有雙元載體系統的根癌農桿菌；(3)將含有雙元載體系統的根癌農桿菌與頂頭孢霉共培養，得到轉化子；(4)獲得的轉化子以耐抗生素進行篩選。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述及的載體質粒含有構巢曲霉啟動子PtrpC和相應的終止子TtrpC，在啟動子下游含有博萊霉素抗性基因和細菌來源的vgb基因。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述及的頂頭孢霉為菌絲體或原生質體。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中還含有乙酰丁香酮。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中的抗生素為博萊霉素。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中的博萊霉素濃度為5μg/ml-10μg/ml。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述及的博萊霉素濃度為5μg/ml。
8.一種含有質粒pYG306的根癌農桿菌。
全文摘要
本發明涉及根癌農桿菌介導的頂頭孢霉的轉化。本發明提供了構建適用于頭孢菌素C產生菌頂頭孢霉基因工程研究用的新型載體質粒，并建立了根癌農桿菌Ti質粒介導的轉化頂頭孢霉的新方法，無論是用菌絲體或是原生質體，每10
文檔編號C12N15/87GK1778913SQ200410084578
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者朱春寶, 朱寶泉, 徐威, 趙文杰 申請人:上海醫藥工業研究院