專利名稱：利用數據性狀位點信息進行作物功能基因電子克隆的方法
技術領域：
本發明屬功能基因電子克隆技術領域，具體涉及一種利用數據性狀位點(QTL)信息進行作物功能基因電子克隆的方法。
背景技術：
電子克隆是近年來伴隨著基因組計劃和EST(表達序列標簽)計劃發展起來的基因克隆新方法，主要原理是利用日益發展的生物信息學技術，借助電子計算機的巨大運算能力，通過EST或基因組的序列組裝和拼接，利用RT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈式反應)的方法快速獲得功能基因，具有投入低、速度快、技術要求低和針對性強等優點。隨著水稻基因組計劃的實施，已有研究人員利用電子克隆的方法克隆了很多水稻的功能基因。目前利用電子克隆進行作物功能基因發掘的方法有兩種1利用EST數據庫信息利用EST數據庫信息進行功能基因的電子克隆是目前最常用的手段，其實驗流程見圖1。首先選擇感興趣的目標作物EST作為查詢探針，搜索該作物dbEST(非冗余EST)數據庫，找到部分重疊的EST進行拼接，然后再以拼接好的EST重疊群(EST contig)為新的查詢探針，繼續搜索dbEST庫，直到沒有新的EST可供拼接為止，最后根據拼接好的完整序列設計PCR引物，通過RT-PCR的方法獲得目的cDNA(互補脫氧核糖核酸)克隆并進行序列測定驗證。除了利用該作物EST作查詢探針外，還可以選擇其他物種尤其是親緣關系較近的物種全長或EST作為查詢探針，搜索該作物的dbEST庫，進而拼接成完整的cDNA序列，其主要理論依據是不同物種同類基因之間存在序列保守性。
2利用基因組信息隨著越來越多的植物的全長基因組序列測序的完成，并供全世界免費使用，促進了植物功能基因的電子克隆。利用基因組信息資料進行電子克隆的最大優點就是基因的克隆不受作物發育時期或特殊環境條件的限制，可以用來源于任何時期或組織的該作物和其他作物的EST或全長cDNA序列作為信息探針，搜索GenBanki(核苷酸數據庫)，隨后根據內含子“GU...AG”的規則通過人工拼接或相應的計算機軟件預測，可以得到該基因完整的開放讀碼框(ORF)，根據拼接的序列結果設計PCR引物，進一步采取RT-CR的方法獲得目的基因的cDNA克隆并進行序列測定，具體實驗流程見圖2。
發明內容
本發明的目的在于針對作物的QTL信息中包含有大量的功能基因，提出一種具有廣泛適用性的對作物進行功能基因電子克隆的方法。
本發明提出的進行作物功能基因電子克隆的方法，是利用作物抗逆相關的QTL(數據性狀位點)信息進行功能基因的電子克隆，是在上述兩種電子克隆方法基礎上加以創新而形成的一種新的電子克隆方法。該方法對物種并沒有特異性，只要被研究的物種有相關的QTL及EST信息，且該作物的基因組已經測序，均可以采用該方法進行基因發掘，故具有廣泛的適用性。其實驗流程見圖3。具體步驟如下選擇感興趣的QTL作為查詢探針，利用QTL內部的核苷酸序列進行分析1、利用QTL內部的核苷酸序列搜索dbEST庫，找到與該序列同源的所有抗逆相關的EST序列；2、利用基因預測軟件(如Genscan(http//ccr-081.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com)軟件)對該QTL序列進行基因預測，找到該序列內部所有涉及的基因；3、將該序列與該作物基因組BAC(細菌人工染色體)文庫進行同源比對，以找到該序列所對應的作物基因組BAC文庫；4、綜合上述三個步驟的結果，將EST序列定位在基因預測結果的相對位置，由于一個EST對應一個功能基因，故與EST匹配的預測基因可能為抗逆相關的基因；同時用這些預測的功能基因與作物BAC文庫中預測的功能基因進行比較，以進一步預測結果的準確性；5、最后根據預測的功能基因設計PCR引物，通過RT-PCR的方法獲得目的cDNA克隆并進行序列測定驗證。
通過該方法，可以方便、快捷的得到QTL中控制目標性狀的基因，而且由于這些功能基因均對應相應的抗逆EST序列，故預測結果的可靠性較高，是一種發現QTL內部所包含的功能基因，并闡明QTL和基因之間的相互關系的一種新方法。
圖1為利用作物EST數據庫進行電子克隆的方法流程圖，說明*基本局域網聯配搜尋工具，一種序列對齊算法和軟件。
圖2為利用作物基因組信息進行功能基因電子克隆的方法的流程圖。
圖3為利用作物抗逆QTL信息進行功能基因發掘的方法的流程圖。
具體實施例方式
以水稻為例，具體的操作過程為1、選擇感興趣的QTL作為查詢探針，到Cornell水稻基因數據庫網站(http//stein.cshl.org/)和日本水稻基因組計劃網站(http//rgp.dna.affrc.go.jp)獲得該QTL兩端的分子標記信息及兩分子標記之間的基因組序列。
2、利用該基因組序列到NCBI網站(http//www.ncbi.nih.gov/)搜索dbEST庫，找到與該序列同源的所有抗逆相關的EST序列。
3、利用基因預測軟件Genscan(http//ccr-081.mit.edu/GENSCAN.html)和Fgenesh(http//www.softberry.com)軟件對該序列進行基因預測，找到該序列內部所有涉及的基因。
4、將該序列與該作物基因組BAC(細菌人工染色體)文庫進行同源比對，以找到該序列所對應的水稻基因組BAC文庫。
5、綜合上述三個步驟的結果，將EST序列定位在所匹配的基因對應位置，由于一個EST對應一個功能基因，故與EST匹配的預測基因可能為抗逆相關的基因；同時用這些預測的功能基因與水稻BAC文庫中預測的功能基因進行比較，以進一步預測結果的準確性。
6、最后根據預測的功能基因設計PCR引物，通過RT-PCR的方法獲得目的cDNA克隆并進行實驗驗證。
利用該方法，我們對部分水稻QTL區間進行了分析，結果表明絕大多數的QTL標記區間均與一到多個抗逆相關EST同源，由于EST代表一個功能基因的部分cDNA表達序列，故確定這些QTL區間存在著一到多個與抗逆有關的基因。部分結果如下染色體4上控制根基粗(root thickness)的QTL標記區間RZ23--RM255對應的核苷酸序列長度為910KB，與dbEST數據庫進行BLAST分析，發現有14個抗逆相關的EST與之匹配，其中EST----CA763678與擬南芥中的鋅指蛋白(RING finger-like protein)相似，而鋅指蛋白是與植物抗逆密切相關的一類蛋白。兩個EST(CA759506、CA759507)與醛糖還原酶基因(aldose reductase-related protein)序列同源，該基因已證明與水稻抗逆性密切相關。此外，CA753947與乙烯應答因子結合蛋白(ethylene-responsive element binding protein)同源，該乙烯被認為在植物抗逆反應中起著重要作用的調控因子，可見在QTL區間RZ23-RM255內至少存在著3個與抗逆相關的基因。
染色體3上控制水稻分蘗數和植株高度性狀的QTL區間RZ519～RZ448之間的核苷酸序與3個水稻抗逆EST高度同源，分別是CA759165(與受體激酶有關)、CA765696、CA756047(與葡萄糖磷酸變位酶基因有關)；該序列位于genebank標記號為AC082645的BAC基因組文庫內，位于該文庫內部94892----119035bp處。綜合該文庫的信息及基因預測軟件的結果，發現該QTL內部只存在4個基因，其中有一個基因與CA759165、CA765696兩個EST匹配，故可以預測該基因為與抗逆密切相關的受體激酶基因(putativereceptor kinase)；此外還有一個與CA756047匹配的基因預測為葡萄糖磷酸變位酶基因(phosphoglucomutase)，該基因也在水稻抗逆脅迫下發揮重要作用。
權利要求
1.一種進行作物功能基因電子克隆的方法，其特征在于利用作物抗逆相關的數據性狀位點-QTL信息進行功能基因的電子克隆，具體步驟如下選擇感興趣的QTL作為查詢探針，利用QTL內部的核苷酸序列進行如下分析(1)利用QTL內部的核苷酸序列搜索dbEST庫，找到與該序列同源的所有抗逆相關的EST序列；(2)利用基因預測軟件對該QTL序列進行基因預測，找到該序列內部所有涉及的基因；(3)將該序列與該作物基因組BAC文庫進行同源比對，以找到該序列所對應的作物基因組BAC文庫；(4)綜合上述三個步驟的結果，將EST序列定位在基因預測結果的相對位置，同時用這些預測的功能基因與作物BAC文庫中預測的功能基因進行比較，以進一步預測結果的準備性；(5)最后根據預測的功能基因設計PCR引物，通過RT-PCR的方法獲得目的cDNA克隆并進行序列測定驗證。
全文摘要
本發明屬功能基因電子克隆技術領域，具體為一種利用與作物抗道相關的QTL信息進行作物功能基因電子克隆的方法。該方法選擇感興趣的QTL作為查詢探針，利用QTL內部的核苷酸序列進行分析，包括利用QTL序列搜索dbEST庫，利用基因預測軟件對該QTL序列進行基因預測，并將該序列與該作物基因組BAC文庫進行同源比對等步驟，最后根據預測的功能基因設計PCR引物，通過RT－PCR方法獲得cDNA克隆。本發明方法預測結果的可靠性高，是發現QTL內部所包含功能基因的一種新方法。本方法對作物沒有特異性要求，故具有廣泛的適用性。
文檔編號C12N15/10GK1683530SQ20041008457
公開日2005年10月19日 申請日期2004年11月25日 優先權日2004年11月25日
發明者曾華宗, 羅利軍, 鐘揚 申請人:復旦大學, 上海市農業生物基因中心