專利名稱：C型凝集素樣受體l1的單克隆抗體及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及人NK細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)單克隆抗體及其制備和應用。本發明的該單克隆抗體可提高NK細胞的殺傷活性。
背景技術：
自然殺傷細胞(natural killer，NK)無需抗原預先作用就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細胞，因為具備此功能特點，NK細胞在機體免疫監視和早期抗感染免疫過程中起重要作用。NK細胞表面分布殺傷活化受體和殺傷抑制受體，通過兩種受體的相互作用確保NK細胞既能殺傷病毒感染的細胞和突變腫瘤細胞，又能保護宿主自身正常細胞免遭破壞。NK細胞表面殺傷抑制受體與靶細胞表面組織相容性復合體I類分子(MHC I類分子)結合，可產生殺傷抑制信號，能阻斷殺傷信號的傳遞。對于宿主自身組織細胞，因MHC I類分子表達正常使殺傷抑制受體介導的抑制作用占主導地位，表現為NK細胞失活；對于病毒感染的細胞和腫瘤細胞，由于MHC I類分子表達減少或缺失而影響殺傷抑制受體與相應配體的結合，從而使殺傷活化受體的作用占主導地位，表現為NK細胞活化并產生殺傷作用。
NK細胞是機體天然免疫系統的重要組成部分，在機體抗病毒感染和抗腫瘤免疫中，NK細胞和CTL細胞作為最主要的效應細胞擔負重要的作用。因此，對如何提高NK細胞殺傷靶細胞的效應和精確調控其靶向性的探索一直是研究抗病毒感染和抗腫瘤免疫治療的熱點，NK細胞作為免疫殺傷效應的第一道防線在機體腫瘤發生的早期承擔最主要的抗腫瘤任務，也就是說，機體NK細胞的殺傷活性直接影響腫瘤的早期治療和預后。
隨著一系列NK細胞表面抑制性受體和活化性受體的發現，通過精確調節NK細胞表面受體提高NK細胞殺傷效應和成為抗腫瘤免疫治療的新策略。因此，NK細胞抑制性受體的結構與功能的深入研究必然為抗腫瘤免疫治療研究開辟新的途徑，同時，也為抗病毒感染的免疫治療提供新的思路。
近年來研究表明，人類NK細胞表面抑制性受體可以分為三個家族第一個家族為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer Ig-like Receptors KIR)，在結構上為胞外段有二到三個免疫球蛋白樣結構域的一型膜蛋白受體，配體為人類白細胞抗原I類分子(HLA I類分子)；第二個家族為免疫球蛋白樣轉錄產物(ILT)；第三個家族為殺傷細胞凝集素樣受體(Killer cell Lectin-likeReceptors KLR)，所有成員定位于12號染色體的NK復合體(NKC)。免疫抑制性受體的結構特點為胞內段含有一個或多個免疫受體酪氨酸相關的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)，ITIM是由6個氨基酸組成的保守序列(I/L/VXYXXL/V，X代表任一氨基酸)。當免疫抑制性受體與相應配體偶聯時，ITIM發生酪氨酸磷酸化，然后與SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶或/和SPIP肌醇磷酸酶的結合，產生細胞活化的負調節效應。
C型凝集素家族基因定位于人12號染色體，小鼠6號染色體和大鼠4號染色體，此區域基因編碼蛋白多與NK細胞功能相關，又稱NK復合體(NKC)。人NK復合體長度約為2.5Mb，含有28個基因，目前已知與免疫功能相關的基因有18個，明確表達于NK細胞的有13個分別編碼以下分子MAFA-L，NKRP1A，LLT1，CD69，AICL，KLRF1，CLEC-2，CD94，NKG2A/B，NKG2C，NKG2D，NKG2E/H和NKG2F。NK復合體所編碼的大部分受體分子因尚不清楚相應配體及生理功能，仍為孤兒受體；已明確為NK細胞抑制性受體的分子是MAFA-L，CD94-NKG2A，Ly49a，Ly49c，Ly49e和Ly49g。
由于每一種抗原決定簇只能被一個B細胞克隆所識別，并產生一種特異性抗體，根據雜交瘤技術原理經過選擇培養的雜交瘤細胞就只分泌一種抗體，即為單克隆抗體(mAb，簡稱單抗)。自從1975年德國Khler和英國Milstein采用雜交瘤技術首次成功的制備出針對一種抗原決定簇的mAb，單抗在診斷、治療、預防和蛋白質純化等方面日益顯示出重要的作用和廣闊的前景。由于此種抗體的純度高和特異性強，可用于對各種免疫細胞及其他組織細胞表面分子的檢測，這對免疫細胞的分離、鑒定、分類以及研究各種細胞膜表面分子的結構和功能等具有重要意義。
綜上所述，本領域迫切需要開發對NK細胞的殺傷能力有調控作用(如激活作用)的單克隆抗體。
發明內容
本發明的目的提供一種提高NK細胞殺傷能力的單克隆抗體。
本發明的另一目的是提供含有該單克隆抗體的制法和用途。
在本發明的第一方面，提供了一種免疫球蛋白，其特征在于，它特異性地結合于C型凝集素樣受體L1，并且提高天然殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。
在另一優選例中，所述的腫瘤細胞是肺癌細胞、乳腺癌細胞或宮頸癌細胞。
在另一優選例中，所述的免疫球蛋白是單克隆抗體。
在另一優選例中，所述的免疫球蛋白由雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1HK-13，CCTCC No.C200417所產生。
在本發明的第二方面，提供了一種免疫偶聯物，該免疫偶聯物含有本發明上述的免疫球蛋白和選自下組的偶聯部分藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、酶。
在本發明的第三方面，提供了一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1HK-13，CCTCC No.C200417。
在本發明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有0.001-99.9wt％(更佳地0.1-9wt0％)本發明上述的免疫球蛋白，以及藥學上可接受的載體。
在本發明的第五方面，提供了一種產生單克隆抗體的方法，包括步驟(a)培養上述的雜交瘤細胞，從而表達單克隆抗體；和(b)從培養物中分離出單克隆抗體。
在本發明的第五方面，提供了本發明上述免疫球蛋白的用途，它們被用于制備提高天然殺傷細胞的殺傷活性的藥物。
在另一優選例中，所述的殺傷活性針對腫瘤細胞(如肺癌、乳腺癌或宮頸癌的細胞)。
圖1是本發明的單克隆抗體HK-13特異性識別NK細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)及本發明的單克隆抗體HK-13可用于證實人KLRL1對磷酸酶SHP-1和SHP-2的募集作用。
A為HK-13特異性識別NK細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)B為人KLRL1對磷酸酶SHP-1和SHP-2的募集作用圖2是本發明的單克隆抗體HK-13可以檢測NK-92細胞表面C型凝集素樣受體L1(KLRL1)的表達。
圖3顯示了本發明的單克隆抗體HK-13特異性結合NK-92細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)，提高效應的殺傷活性具體實施方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，制備和篩選了抗不同蛋白的各種單克隆抗體，意外發現抗C型凝集素樣受體L1的單克隆抗體HK-13具有提高NK細胞殺傷能力的優異效果。在此基礎上完成了本發明。
人NK細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)一種免疫抑制性受體，蛋白分子全長265個氨基酸，分子量約75kDa；該分子是殺傷細胞凝集素樣受體家族中的II型跨膜糖蛋白，胞內區段含有一個ITIM特征結構，具有結合SHP-1和SHP-2的潛在能力；其基因定位于人12號染色體短臂NK復合體編碼區，與hCLEC1、hCLEC2、CD94有較高的同源性；KLRL1主要表達于淋巴組織和免疫細胞。
如本文所用，“單克隆抗體HK-13”、“HK-13單克隆抗體”、“單抗HK-13”、“HK-13單抗”可互換使用，指由雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1HK-13，CCTCC No.C200417產生的單克隆抗體。
本發明包括具有HK-13單抗的相應氨基酸序列的單克隆抗體、具有HK-13單抗可變區鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90％同源性，較佳地至少95％同源性。如本領域技術人員所知，免疫偶聯物及融合表達產物包括藥物、毒素、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與HK-13單抗或其片段結合的而形成的偶聯物。
如本文所用，“免疫毒素”指對靶細胞有特異性親和力和殺傷力的物質，例如免疫偶聯物及融合表達產物包括藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治療分子與HK-13單抗或其片段結合的而形成的偶聯物。具體的例子有例如131I-HK-13偶聯物等。
對于本發明HK-13單抗重鏈和輕鏈序列，可以用常規方法測定。HK-13單抗V鏈的超變區或互補決定區(complementarity determining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與HK-13單抗CDR具有90％以上(較佳地95％以上)的同源性。
本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab′)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以用常規技術(如PCR擴增法)，利用小鼠雜交瘤細胞系HK-13(CCTCC No.C200417)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的HK-13單抗的DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達單抗蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌等細菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS7、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的HK-13單抗。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
此外，本發明還提供了一種檢測KLRL1的試劑盒，它含有容器以及裝于容器中的上述的免疫球蛋白或免疫偶聯物，或其活性片段。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有上述的免疫球蛋白(或免疫偶聯物)，以及藥學上可接受的載體。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內、靜脈內、或局部給藥。
本發明的藥物組合物可直接用于促進NK-13的殺傷活性，因此在某些癌癥(如肝癌、肺癌、結腸癌、乳房癌、前列腺癌等)的治療。
本發明的藥物組合物含有安全有效量的本發明上述的免疫球蛋白(或上述的免疫偶聯物)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明單克隆抗體施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
本發明的主要優點在于抗人NK細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)單克隆抗體可提高NK細胞對某些腫瘤細胞的殺傷活性，因此在提高或輔助提高免疫力方面有潛在的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1抗原制備人KLRL1單克隆抗體的制備用Trizol試劑提取處于人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞總RNA，取5μg細胞總RNA與1μg Oligo-dT12-18混合，進行反轉錄。反轉錄體系為20μl，反應結束后加80μl ddH2O進行稀釋。PCR擴增人KLRL1全長開放閱讀框的引物如下有義引物5’-AAAGAATTCATGTCTGAAGAAGTTACTT-3’(SEQ ID NO1)，該引物含有EcoR I限制性內切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是翻譯起始子和人KLRL1的部分編碼序列；反義引物5’-AAAGGATCCTCATGCCTCCCATTT-3’(SEQ ID NO2)，該引物含有BamH I限制性內切酶的酶切位點、翻譯終止子和人KLRL1的部分編碼序列。
PCR反應體積為50μl，其中含反轉錄模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara)，擴增參數為95℃15秒、57℃30秒、72℃90秒，32個循環后PCR產物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳初步確認。DNA序列分析結果表明該PCR產物(約800bp)的編碼DNA序列與人KLRL1的ORF序列完全相同。
將獲得的PCR產物純化后經EcoR I-BamH I酶切再與質粒pcDNA3.1/myc-his(-)B(Invitrogen公司)按常規方法重組并轉化至感受態大腸桿菌BL21，挑取陽性克隆鑒定后純化并測序(ABI公司的377型測序儀，BigDye Terminator試劑盒，PE公司)。經測序證實，已插入了所設計的CLSPa編碼序列。正確序列的克隆形成載體pcDNA-KLRL1。
利用LipofectAMINE試劑(Invitrogen)進行真核細胞的基因轉染，按照說明書操作。主要步驟為待轉染的質粒pcDNA-KLRL1與脂質體LipofectAMINE按一定比例混合，室溫作用45分鐘；處60-80％匯合(confluent)生長6孔細胞培養板或10mm培養皿的待轉染細胞，用OPTI-MEM無血清培養基(Invitrogen)洗兩遍后，加入DNA-脂質體混合物，置37℃5％CO2培養6-8小時，加等體積含20％血清的正常培養基，繼續培養6小時后更換新鮮培養基。瞬時表達于轉染后48-72小時收集細胞進行檢測，并收集細胞。經裂解后將裂解液作為抗原備用。
實施例2動物免疫以實施例1中制備的瞬時轉染pcDNA-KLRL1的NIH3T3細胞小鼠成纖維細胞為抗原經腹腔注射免疫BALB/c小鼠，初次免疫3-4周后加強免疫3次，每次間隔2周。經四次免疫后，尾靜脈取血，用免疫雙擴法測得小鼠血清中有1∶4以上的免疫應答后，取等量細胞經尾靜脈加強免疫。
實施例3細胞融合末次免疫3天后，取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0做細胞融合。取對數生長的骨髓瘤細胞SP2/0，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養液混懸細胞后計數，取所需的細胞數，用不完全培養液洗滌2次。同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養液洗滌2次。將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內用不完全培養液洗1次，1200rpm，8分鐘。棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。在室溫下融合30秒內加入預熱的1ml 45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，邊加邊攪拌；作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘；加預熱的不完全培養液，終止PEG作用，每隔2分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml；離心，800rpm，6分鐘；棄上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640輕輕混懸。根據所用96孔培養板的數量，補加完全培養液，10ml一塊96孔板。將融合后細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100μl/孔，然后將培養板置于37℃、5％CO2的孵箱內培養。
實施例4篩選和制備抗體應用HAT選擇培養液篩選融合細胞，ELISA及免疫印跡法檢測陽性克隆，采用有限稀釋法反復克隆化3-4次，得到有穩定分泌抗體能力的雜交瘤細胞株HK-13。離心收集至少5×106個生長良好的雜交瘤細胞，棄上清，加入1ml的凍存液，置于-196℃液氮中保存。另腹腔注射0.5ml液體石臘于BaLb/c小鼠，1～2周后腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天后可收集腹水，經Affi-Gel protein A-agarose親和柱(Bio-Rad Laboratories)純化得到單克隆抗體。結果得到了多種單克隆抗體。
用標準抗Ig類與亞類血清系統作夾心ELISA來分析所得到各個單克隆抗體的表型。
結果顯示獲得一種小鼠抗人KLRL1單克隆抗體HK-13的表型為IgGl，kappa。(一些其他單克隆抗體因為沒有明顯的提高NK細胞殺傷活性，故沒有進一步分析其表型。)產生單克隆抗體HK-13的細胞是雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1HK-13，該雜交瘤細胞系于2004年11月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)，保藏號為中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)No.C200417。
實施例5免疫共沉淀和Western印跡檢測收集培養細胞SP2/0-hKLRL1HK-13(CCTCC NoC200417)，在含1mM PMSF的PBS中洗兩次后，重懸于T-PER組織蛋白抽提試劑(Pierce公司)中，混勻，放冰上20min，以10,000g 4℃離心10分鐘，收集上清。蛋白樣品定量采用BCA法。
收集用于免疫共沉淀的細胞，在含1mM PMSF的PBS中洗兩次后，加入0.5mlPBS置于37℃預處理5分鐘；加入終濃度為100μM的Na3VO4和0.03％H2O2置于37℃孵育5分鐘；隨后在冰上加入2×1％毛地黃皂苷(digitonin)裂解液(25mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5，1％毛地黃皂苷，1mM NaF，1mM PMSF，1mM Na3VO4，10μg/ml leupeptin，and 10μg/ml aprotinin)裂解30分鐘，16,000g4℃離心15分鐘，收集細胞裂解上清，加入正常BALB/c小鼠血清和蛋白A beads4℃震蕩孵育預封閉1小時，2,300g 4℃離心2分鐘收集上清，加入單克隆抗體HK-13和蛋白A beads 4℃震蕩孵育8小時。2,300g 4℃離心2分鐘收集anti-FlagM2-瓊脂糖珠，用0.5％毛地黃皂苷裂解液洗3次，即為免疫沉淀物。
將蛋白樣品或免疫沉淀物行SDS-PAGE，隨后以100V恒電壓于4℃轉至硝酸纖維素膜上，麗春紅染色并標記大小和方向。室溫阻斷2小時(5％脫脂奶粉的TBST溶液)，以阻斷液稀釋一抗，室溫孵育1小時。TBST(0.05％Tween 20的TBS溶液)洗15分鐘、3次，以阻斷液稀釋二抗，室溫孵育2小時。TBST洗15分鐘、3次，TBS(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl)洗15分鐘，然后加入化學發光底物作用1min，并迅速封膜和自顯影。
用于Western印跡檢測KLRL1蛋白表達的—抗為小鼠抗KLRL1單克隆抗體HK-13，二抗為HRP標記抗鼠IgG(Santa Cruz公司)；用于免疫共沉淀后Western印跡檢測SHP-1、SHP-2和SHIP1的—抗分別為兔抗SH-PTP1(SHP-1)多抗、兔抗SH-PTP2多抗和兔抗SHIP1多抗(Santa Cruz公司)，二抗為HRP標記抗兔IgG(Santa Cruz公司)。
結果提示，在NK細胞系NK-92以及髓系/單核細胞系U937中，用單克隆抗體HK-13能夠特異性識別并結合人KLRL1，并證實KLRL1在酪氨酸磷酸化的情況下可以通過募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2(圖1)。
實施例6用單克隆抗體HK-13檢測NK-92細胞表面KLRL1的表達收集指數生長期的常規的天然殺傷細胞NK-92細胞(購自ATCC，CRL-2407)，用PBS懸浮為1×106細胞/ml，加入離心管，100μl/管，以單克隆抗體HK-13為間標第一抗體，同型Ig為對照抗體。4℃標記45分鐘，PBS洗2遍；然后，加入FITC標記的抗鼠IgG；終濃度5ug/ml，置暗處，4℃標記45分鐘，PBS洗2遍，用流式細胞儀(FACS calibur，BD公司)檢測細胞表面KLRL1表達，CellQuest軟件分析。
結果如圖2所示，表明HK-13單抗可以檢測NK-92細胞表面C型凝集素樣受體L1(KLRL1)的表達。
實施例7NK細胞殺傷活性檢測和單克隆抗體HK-13功能檢測運用LDH釋放法檢測NK細胞殺傷活性檢測，基本原理如下乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是胞漿中的酶，細胞死亡后釋放到上清中；在硫辛酰胺脫氫酶和氧化型輔酶I的共同作用下，乳酸脫氫酶可以將2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑(INT)轉化為紅色formazan；通過吸光檢測可以間接檢測細胞死亡率。檢測試劑盒是CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promego)，基本方法如下收集對數生長期的靶細胞，計數；在96孔圓底板中加入靶細胞，每孔50μl，細胞數為1×103；收集對數生長期的效應細胞，計數倍比稀釋；向每孔加入效應細胞50μl，效應細胞和靶細胞(各種癌細胞)分別為50∶1、25∶1和12.5∶1，250g離心5分鐘后置37℃5％CO2孵育4小時；250g離心5分鐘，每孔吸出50μl上清對應加入另一96孔酶聯檢測板，依次加入50μl反應液，室溫避光放置30分鐘，在酶聯檢測儀上檢各孔吸光度(OD值)，檢測波長490nm。
單克隆抗體HK-13中和實驗收集對數生長期的效應細胞，與純化的單克隆抗體HK-13在37℃5％CO2的孵箱內共孵育30分鐘，HK-13的終濃度為20μg/ml，對照組用與之濃度相同的IgG，然后用RPMI 1640無血清培養基洗兩遍，記數鋪板，以下步驟與上述相同。
殺傷活性(％)＝[(OD實驗組-OD總自然釋放)/(OD最大釋放組-OD總自然釋放)]×100結果顯示，經HK-13預處理的NK-92細胞作用于肺癌細胞A549(購自ATCC，CCL-185)、乳腺癌細胞MCF-7(購自ATCC)和宮頸癌HeLa細胞(購自ATCC)的殺傷效率明顯提高。其中對A549細胞的殺傷效果如圖3所示。當效應細胞∶靶細胞＝25∶1時，對乳腺癌細胞MCF-7和宮頸癌HeLa細胞的裂解率為48-50％，高于對照IgG的裂解率(約30％)。
上述結果證明HK-13抗體作為一種hKLRL1的單克隆抗體可以提高NK-92細胞對于某些腫瘤細胞的殺傷活性。
實施例8藥物組合物將純化的HK-13單克隆抗體與生理鹽水配制成溶液，濃度為10μg/ml，裝于滅菌小瓶中，10ml/瓶。
菌種保藏雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1HK-13于2004年11月20日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)，保藏號為中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國，武漢市)No.C200417。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國人民解放軍第二軍醫大學<120>C型凝集素樣受體L1的單克隆抗體及其制備和應用<130>048324<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1aaagaattca tgtctgaaga agttactt 28<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aaaggatcct catgcctccc attt 2權利要求
1.一種免疫球蛋白，其特征在于，它特異性地結合于C型凝集素樣受體L1，并且提高天然殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。
2.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的腫瘤細胞是肺癌細胞、乳腺癌細胞或宮頸癌細胞。
3.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是單克隆抗體。
4.如權利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1 HK-13，CCTCC No.C200417所產生。
5.一種免疫偶聯物，其特征在于，該免疫偶聯物含有權利要求1所述的免疫球蛋白和選自下組的偶聯部分藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、酶。
6.一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，它是雜交瘤細胞SP2/0-hKLRL1 HK-13，CCTCC No.C200417。
7.一種藥物組合物，其特征在于，它含有權利要求1所述的免疫球蛋白，以及藥學上可接受的載體。
8.一種產生單克隆抗體的方法，其特征在于，包括步驟(a)培養權利要求6所述的雜交瘤細胞，從而表達單克隆抗體；和(b)從培養物中分離出單克隆抗體。
9.如權利要求1所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，用于制備提高天然殺傷細胞的殺傷活性的藥物。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述的殺傷活性針對肺癌、乳腺癌或宮頸癌。
全文摘要
本發明公開了一種人NK細胞C型凝集素樣受體L1(KLRL1)單克隆抗體及其制備和應用。本發明的該單克隆抗體可提高NK細胞對于某些腫瘤細胞的殺傷活性。
文檔編號C12N5/00GK1778822SQ20041008449
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月24日 優先權日2004年11月24日
發明者韓巖梅, 李楠, 萬濤, 曹雪濤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學