專利名稱：青霉素酰化酶晶體和固定化青霉素酰化酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種青霉素酰化酶晶體和固定化青霉素酰化酶。
背景技術：
半合成β-內酰胺類抗生素的生產主要有化學法和酶法兩種。國內半合成β-內酰胺類抗生素的生產主要采用化學法，通過6-APA(6-氨基青霉素烷酸)、7-ADCA(7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸)、7-ACA(7-氨基頭孢烷酸)等酰基受體與酰基供體的化學酰化反應而合成。化學合成步驟繁瑣，并且需要在二氯甲烷等高毒性有機溶劑中進行。酶法合成β-內酰胺類抗生素與化學方法相比具有很多優點1、酰基供體不需要用毒性相當強的試劑進行羧基活化，或只需要較溫和的條件，如以酸或酯的形式；2、酶催化反應的特異性使得無須對抗生素母核上的羧基進行保護；3、高度特異性和高催化活性避免產物的外消旋，減少副反應(如果酶足夠純)；4、不需要像化學合成那樣采用高毒性有機溶媒等。因此酶法合成β-內酰胺類抗生素是一種更“干凈”的工業生產方法，可以解決環境和工業的矛盾，降低工業成本，具有替代化學合成方法的趨勢。
工業上應用的酶多是固定化的酶。傳統的酶固定化方法主要有四種包埋法、吸附法、共價法、交聯法(張偉、楊秀山.酶的固定化技術及其應用.自然雜志，2000，22(5)282-286)。20世紀60年代科研人員在研究羧肽酶-A晶體結構時發現用雙功能交聯試劑交聯酶晶體，酶在獲得穩定性時仍然保持活性(F.A.Quiocho，F.M.Richards.Intermolecular cross linking of aprotein in the crystalline stateCarboxypeptidase-A.J Biochemistry，1964，52833-839)。
青霉素酰化酶的固定化常采用共價法，即將青霉素酰化酶共價連接在特殊的惰性載體上而達到固定化的目的。用傳統方法固定化的青霉素酰化酶雖然得到廣泛應用，但在穩定性方面仍然存在不足，尤其是在極端pH、高溫、以及有機溶劑中的穩定性較差，因而限制了其應用。
發明內容
本發明的要解決的技術問題是提供一種青霉素酰化酶晶體及其應用交聯法制得的一種固定化青霉素酰化酶。
上述技術問題之一是通過下列技術方案來解決一種青霉素酰化酶晶體，其可采用下列批量沉淀結晶的方法制備得到將蛋白質濃度為8～12mg/ml、青霉素酰化酶純度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶純化溶液，加入含有沉淀劑聚乙二醇(PEG)、pH為6.0～7.0的緩沖溶液中進行結晶，其中聚乙二醇的重量占緩沖溶液體積的9～13％。
其中，該沉淀劑聚乙二醇的分子量為4000～8000道爾頓。
該緩沖溶液較佳的為磷酸鹽溶液(PBS)。
上述技術問題之二是通過下列技術方案來解決一種固定化青霉素酰化酶，將上述的青霉素酰化酶晶體加入含有雙功能交聯劑的緩沖系統中進行交聯反應制得。
其中，優選的青霉素酰化酶晶體的直徑在50～200μm。
而所述的雙功能交聯劑可以為戊二醛、丁二醛、丙二醛或己二醛等。
常用的雙功能交聯劑為戊二醛，其在緩沖溶液中的濃度為0.05～0.1％(v/v)。
所述的緩沖系統較佳的是pH為6～9的磷酸鹽緩沖液。
另外，所述的青霉素酰化酶晶體加入上述的磷酸鹽緩沖液中時，使其濃度最好為1～20mg/mL。
而該交聯反應的時間一般為10～30分鐘。
本發明得到的一種固定化青霉素酰化酶，是一種交聯青霉素酰化酶晶體，其與傳統共價固定化的青霉素酰化酶相比有以下明顯優點1.交聯酶晶體相對于傳統固定化酶對溫度、酸堿、有機溶劑、蛋白酶都不敏感，機械強度也明顯增強。
2.交聯酶晶體中無惰性載體，酶的含量及純度均較高，提高了酶的反應速度和反應專一性。
3.交聯酶晶體以固體形態存在，且不溶于水和有機溶劑，使用方便，只需直接加入而不必進行溶劑轉換，同時回收再生也很方便，只需通過過濾、離心或直接傾出溶劑即可；易于干燥，無需成本較高的冷凍干燥。
4.交聯酶晶體顆粒形狀規則，孔徑均一，有利于底物的進出。大分子物質如蛋白質、核酸、多糖和高分子聚合物都不能進入晶體內部進行反應。
圖1是本發明中不同直徑的交聯固定化青霉素酰化酶晶體的相對活性比較；圖2是本發明中直徑100μm的交聯固定化青霉素酰化酶晶體的物理穩定性試驗結果；圖3是本發明交聯固定化青霉素酰化酶晶體(簡稱晶體酶)、現有溶液酶和現有固定化酶對pH穩定性的試驗結果；圖4是本發明交聯固定化青霉素酰化酶晶體(簡稱晶體酶)和現有溶液酶對溫度穩定性的試驗結果；圖5是本發明交聯固定化青霉素酰化酶晶體(簡稱晶體酶)和現有溶液酶對蛋白酶穩定性的試驗結果；圖6是本發明交聯固定化青霉素酰化酶晶體(簡稱晶體酶)、現有溶液酶和現有固定化酶對有機溶劑(DMF)穩定性試驗結果。
具體實施例方式
實施例1青霉素酰化酶晶體的制備(1)青霉素酰化酶純化溶液的制備常溫下首先對溶液態青霉素酰化酶(購自浙江海德爾公司)進行純化，采用常規的硫酸銨分級沉淀、超濾、疏水層析和離子交換層析方法，可以將青霉素酰化酶純化到25u/mg以上，這種純度的青霉素酰化酶可以比較容易的利用沉淀結晶方法獲得晶體。純化好后保存在4℃冰箱的蛋白質貯備液中，4℃下12000rpm離心10min，以除去變性蛋白質和雜質沉淀，上清用0.22μm膜過濾，Lowry法測定蛋白質濃度105mg/ml；(2)青霉素酰化酶晶體的制備取1.14ml蛋白貯存液，加入7.06ml pH6.0、0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，100rpm緩慢攪拌下慢慢加入50(w/v)％PEG-8000貯存液1.8ml，用6mol/L NaOH調節pH至6.0，混合液略顯渾濁，最終蛋白質濃度為12mg/ml，PEG濃度為9(w/v)％；將得到的樣品靜置于25℃恒溫培養箱中，48h后取出，1000rpm離心收集晶體并用pH6.0、0.1M PBS洗滌3次以上，盡量去除PEG及溶解蛋白，得到200μm左右的青霉素酰化酶晶體。
實施例2青霉素酰化酶晶體的制備按實施例1的方法和步驟，沉淀劑PEG-8000換用PEG-4000，使結晶母液蛋白質濃度為8mg/ml，PEG濃度為13％，結晶周期為3天，其他條件相同，得到50μm左右的青霉素酰化酶晶體。
實施例3青霉素酰化酶晶體的制備按實施例1的方法和步驟，使結晶母液蛋白質濃度為10mg/ml，PEG-8000濃度為12％，其他條件相同，得到100μm左右的青霉素酰化酶晶體。
實施例4 交聯固定化青霉素酰化酶的制備取大約100mg實施例3的100μm的青霉素酰化酶晶體，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀釋至10ml，4℃下100rpm緩慢攪拌過程中加入25％戊二醛溶液20μl，使其濃度為0.05(v/v)％，反應30min后立即1000rpm離心收集晶體，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗滌數遍，以去除未反應戊二醛，得到100μm左右顆粒大小的交聯固定化青霉素酰化酶晶體。
實施例5交聯固定化青霉素酰化酶的制備取大約100mg實施例3的青霉素酰化酶晶體，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀釋至10ml，常溫下100rpm緩慢攪拌過程中加入25％戊二醛溶液30μl，使其濃度為0.075％(v/v)，反應20min后立即1000rpm離心收集晶體，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗滌數遍，以去除未反應戊二醛，得到100μm左右顆粒大小的交聯固定化青霉素酰化酶晶體。
實施例6交聯固定化青霉素酰化酶的制備取大約200mg實施例3的青霉素酰化酶晶體，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀釋至10ml，20℃下100rpm緩慢攪拌過程中加入25％戊二醛溶液40μl，使其濃度為0.1(v/v)％，分別反應10min后立即1000rpm離心收集晶體，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗滌數遍，以去除未反應戊二醛，得到100μm左右顆粒大小的交聯固定化青霉素酰化酶晶體。
實施例7交聯固定化青霉素酰化酶的制備按照實施例4的方法和步驟，取實施例2的青霉素酰化酶晶體，制備得到50μm左右顆粒大小的交聯青霉素酰化酶晶體。
實施例8交聯固定化青霉素酰化酶的制備取大約100mg實施例2的青霉素酰化酶晶體，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀釋至10ml，20℃下100rpm緩慢攪拌過程中加入25％丙二醛溶液30μl，反應20min左右后立即1000rpm離心收集晶體，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗滌數遍，以去除未反應丙二醛，得到50μm左右顆粒大小的交聯青霉素酰化酶晶體。
實施例9交聯固定化青霉素酰化酶的制備按照實施例5的方法和步驟，取實施例1的青霉素酰化酶晶體，制備得到200μm左右顆粒大小的交聯青霉素酰化酶晶體。
實施例10交聯固定化青霉素酰化酶的制備取大約100mg實施例1的青霉素酰化酶晶體，用pH6.0、0.1mol/L PBS稀釋至10ml，4℃下100rpm緩慢攪拌過程中加入25％丁二醛溶液20μl，反應30min后立即1000rpm離心收集晶體，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗滌數遍，以去除未反應丁二醛，得到200μm左右顆粒大小的交聯青霉素酰化酶晶體。
實施例11交聯固定化青霉素酰化酶的制備取大約10mg實施例2的青霉素酰化酶晶體，用pH9.0、0.1mol/L PBS稀釋至10ml，20℃下100rpm緩慢攪拌過程中加入25％己二醛溶液40μl，反應10min后立即1000rpm離心收集晶體，并用0.05mol/L、pH7.5PBS洗滌數遍，以去除未反應己二醛，得到100μm左右顆粒大小的交聯青霉素酰化酶晶體。
應用實施例1比較實施例4、7和9不同直徑大小的用相同方法交聯固定化青霉素酰化酶晶體的相對活性(u/mg)，發現交聯青霉素酰化酶晶體顆粒直徑越小，相對活性越高，以顆粒直徑50μm左右為最佳，結果如圖1。
應用實施例2對實施例7獲得的交聯青霉素酰化酶晶體進行物理穩定性試驗，保存在pH 7.5、0.05mol/L PBS中，放置一周，無蛋白溶解出，結果表明交聯酶晶體的物理穩定性很好，結果如圖2。
應用實施例3對實施例4獲得的交聯固定化青霉素酰化酶晶體與上述現有溶液酶以及商品載體固定化青霉素酰化酶(購自德國柏林試劑公司)分別進行pH穩定性、溫度穩定性、蛋白酶穩定性、有機溶劑DMF(二甲基甲酰胺)穩定性試驗，結果表明本發明的交聯固定化青霉素酰化酶晶體對各種極端條件的穩定性方面均優于載體固定化酶及溶液酶，尤其是在對溫度和有機溶劑的穩定性方面，結果如圖3-6所示。
應用實施例4(1)用pH6.0、0.1mol/L PBS配制6-APA濃度100mmol/L、D-PGME(對羥苯基甘氨酸甲酯，sigma)濃度分別200、300mmol/L的反應液10ml，加入6ml DMF，使DMF濃度達到30％(v/v)，補充重蒸水至20ml，100rpm攪拌，加入500u實施例4得到的交聯青霉素酰化酶晶體，20℃反應2h。
(2)對反應后樣品進行HPLC分析，外標法測定產物氨芐青霉素含量，并以氨芐青霉素的產率計算底物6-APA的轉化率。
結果表明底物6-APA的轉化率分別達到82.3％、89.6％。
應用實施例5按照上述應用實施例的方法和步驟，改變6-APA濃度為200mmol/L，D-PGME濃度分別400、600mmol/L，其他條件相同，最終結果表明底物6-APA的轉化率分別達到85.9％、93.1％。
每次反應完成后，將交聯固定化青霉素酰化酶晶體1000rpm離心收集，洗凈，待重復利用，15批反應后，酶活保留85％以上。
上述實施例中未特殊說明的試劑均為市售的分析純。
權利要求
1.一種青霉素酰化酶晶體，其可采用下列批量沉淀結晶的方法制備得到將蛋白質濃度為8～12mg/ml、純度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶純化溶液，加入含有沉淀劑聚乙二醇、pH為6.0～7.0的緩沖溶液中進行結晶，其中聚乙二醇的重量占緩沖溶液體積的9～13％。
2.根據權利要求1所述的青霉素酰化酶晶體，其特征在于該沉淀劑聚乙二醇的分子量為4000～8000道爾頓。
3.根據權利要求1或2所述的青霉素酰化酶晶體，其特征在于該緩沖溶液為磷酸鹽溶液。
4.一種固定化青霉素酰化酶，其可由將權利要求1所述的青霉素酰化酶晶體加入含有雙功能交聯劑的緩沖系統中進行交聯反應制得。
5.根據權利要求4所述的固定化青霉素酰化酶，其特征在于該青霉素酰化酶晶體的直徑在50～200μm。
6.根據權利要求4所述的固定化青霉素酰化酶，其特征在于所述的雙功能交聯劑為戊二醛、丁二醛、丙二醛或己二醛。
7.根據權利要求6所述的固定化青霉素酰化酶，其特征在于所述的雙功能交聯劑為戊二醛，其在緩沖系統中的濃度為0.05～0.1％(v/v)。
8.根據權利要求4所述的固定化青霉素酰化酶，其特征在于該交聯反應的時間為10～30分鐘。
9.根據權利要求4-8任一權利要求所述的固定化青霉素酰化酶，其特征在于所述的緩沖系統為pH是6～9的磷酸鹽緩沖液。
10.根據權利要求9所述的固定化青霉素酰化酶，其特征在于所述的青霉素酰化酶晶體加入上述的磷酸鹽緩沖液中，使其濃度為1～20mg/mL。
全文摘要
本發明公開了一種青霉素酰化酶晶體和固定化青霉素酰化酶，它們可分別由下列方法制備得到將蛋白質濃度為8～12mg/ml、純度在25u/mg蛋白以上的青霉素酰化酶純化溶液，加入含有沉淀劑聚乙二醇、pH為6.0～7.0的緩沖溶液中進行結晶，其中聚乙二醇的重量占緩沖溶液體積的9～13％；將所述的青霉素酰化酶晶體加入含有雙功能交聯劑的緩沖系統中進行交聯反應制得固定化青霉素酰化酶。該固定化青霉素酰化酶具有對溫度、酸堿、有機溶劑、蛋白酶不敏感，機械強度高，酶的含量及純度高，使用方便，顆粒形狀規則等特點。
文檔編號C12N11/02GK1778909SQ200410084489
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月24日 優先權日2004年11月24日
發明者嚴惠敏, 蔣建華, 張蓓蕾 申請人:上海醫藥工業研究院