一種脂肪間充質干細胞的分離培養方法及其應用的制作方法

專利名稱：一種脂肪間充質干細胞的分離培養方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞的分離培養方法及其應用，特別是涉及一種脂肪間充質干細胞的分離和體外擴增培養方法。
背景技術：
干細胞是一種具有自我更新能力且在適合微環境下具有多系分化潛能的原始細胞。在個體發育過程中，存在各種形式的干細胞例如胚胎干細胞，能夠分化成人體各種類型的細胞，多能干細胞以及各種組織中的定向干細胞如造血干細胞、神經干細胞、肌肉干細胞等。目前，已有利用干細胞治療心肌梗塞、先天性骨發育不全、類風濕性關節炎、神經損傷的實驗報道。
成體干細胞是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種亞全能干細胞群，在特定環境下可誘導分化成多種組織細胞。脂肪來源的間充質干細胞就是一類亞全能干細胞群。
早在20世紀60年代，Rodbell首次報道了分離脂肪細胞的方法1[1.Rodell Met al.J Biol Chem 1964；239375-80]，包括將脂肪組織剪碎，膠原酶消化，梯度離心，來得到上層懸浮的成熟脂肪細胞，而血細胞、纖維母細胞、內皮細胞以及脂肪祖細胞等均位于細胞沉淀中。隨后，許多研究者對這一方法進行了改進，將吸脂術所得組織作為脂肪組織的來源2-6[2.Deslex S et al.Int J Obes 1986；1019-27；3.Hauner H et al.J Clin.Invest.1989；841663-1670；4.Van LR and Roncari AK.CellTiss Res 1977；181197-203；5.Lalikos JF et al.J Surg Res 1997；7095-100；6.Moore J et al.Aesthetic Plast Surg 1995；19，335-339]。吸出的脂肪用無菌的PBS平衡鹽溶液沖洗以去除血細胞和局麻藥，然后用□型膠原酶消化，37℃，30分鐘以去除細胞外基質，然后用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)完全培養基終止膠原酶的作用，1200g離心10分鐘，去除上清，用含10％胎牛血清的DMEM重懸細胞沉淀，然后用0.16mol/l的NH4Cl溶解剩余的紅細胞，離心洗滌后用含10％FBS的DMEM重懸細胞，接種后置入37□，5％CO2的培養箱中培養，12小時后用PBS沖洗，去除未貼壁的細胞，此后每三天半量換液，細胞達到80％融合時，用胰酶-EDTA(乙二胺四乙酸二鈉鹽)消化，傳代7-12[7.Zuk PA et al.Tissue Eng，2001，7211-228；8.Zuk PA et al.Mol BiolCell，2002，134279-4295；9.Gronthos S et al.J Cell Physiol，2001，18954-63；10.DeUgarte DA et al.Immunol Lett，2003，89267-270；11.Mizuno H et al.Plast ReconstrSurg，1999，109199-209；12.US Pat No.6,777,231]。培養的脂肪來源的MSCs呈纖維細胞樣生長。

發明內容
本發明的目的旨在提供一種脂肪間充質干細胞的分離培養方法和由此獲得的脂肪間充質干細胞的新的醫藥用途。
本發明的問世是基于這樣一個發現具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型的脂肪間充質干細胞可誘導分化為造血細胞、血管內皮細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、神經細胞和上皮細胞。
本發明的技術方案為一種脂肪間充質干細胞分離和體外擴增培養方法，它包括取人體脂肪組織，用膠原酶消化，經梯度離心、過濾，隨后在體外培養體系中進行擴增培養。所述體外培養體系含有DMEM/F12、EFG和FCS；較佳地，所述體外培養體系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/mlEFG和1-10％FCS；優選含有95％DMEM/F12、5％FCS、20ng/mlEGF的培養體系。
另一方面，本發明還提供了一種脂肪間充質干細胞，所述脂肪間充質干細胞具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型。所述脂肪間充質干細胞可由上述方法獲得。更佳地，所述脂肪間充質干細胞還具有CD29+、CD105+和/或CD166+的表型。
另一方面，本發明還提供了上述脂肪間充質干細胞在制備可誘導分化為造血細胞、血管內皮細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、神經細胞、上皮細胞的藥物中的用途。
此外，本發明還提供了上述脂肪間充質干細胞在制備可用于人體其它組織工程、組織再生、修復的藥物中的用途。
本發明提供了一種脂肪間充質干細胞分離和體外擴增培養的方法，操作簡單可行；本發明還公開了人脂肪來源的間充質干細胞新的醫藥用途。此類細胞經移植體內可分化為多種組織特異的細胞，參與機體多種組織的損傷修復，其優勢在于脂肪取材方便，給患者帶來的痛苦較小，而且不容易受到惡性腫瘤的侵犯，更容易進行體外凈化，對惡性血液病和實體腫瘤的患者可以預先儲備脂肪來源的干細胞亞群，在大劑量放療和化療后可以用于重建造血。這就為組織工程、再生醫學中的種子細胞來源以及為成體干細胞群的應用提供了新的選擇。


圖1脂肪間充質干細胞的形態學觀察和瑞士染色圖2脂肪間充質干細胞生長曲線圖3脂肪間充質干細胞免疫表型流式細胞議結果圖4脂肪間充質干細胞向成骨細胞分化示鈣化小結(a)實驗組第四天 (b)實驗組第八天 (c)對照組圖5脂肪間充質干細胞向脂肪細胞分化油紅-O染色(a)實驗組為紅色呈陽性 (b)對照組陰性圖6脂肪間充質干細胞向神經細胞分化(a)誘導4小時后細胞形態 (b)NF陽性 (c)NSE陽性 (d)GFAP陰性圖7脂肪干細胞亞群向內皮細胞分化(a)誘導14天后細胞形態 (b)實驗組CD31陽性 (c)對照組CD31陰性(d)實驗組vWF陽性 (e)對照組vWF陰性(f)Western blot證實vWF (g)免疫電鏡證實vWF圖8脂肪干細胞亞群向肝上皮樣細胞分化
(a)誘導前細胞形態 (b)實驗組ALB單抗綠色熒光 (c)ALB對照組(d)實驗組CK18單抗紅色熒光 (e)CK18對照組(f)b和d結合的ALB+CK18+ (g)RT-PCR驗證ALB和CK18圖9干細胞亞群參與受體小鼠血管的新生熒光顯示鼠vWF藍色，人vWF綠色，人CD45紅色(A)小腸 (B)肝臟 (C)肺 (D)修復的創傷圖10干細胞亞群參與受體小鼠呼吸道上皮細胞損傷的修復(A)支氣管中人特異抗體pan-CK染色(B)小鼠支氣管局部顯示人pan-CK藍色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(C)RT-PCR證實支氣管中有供體來源的上皮細胞(D)肺中人特異抗體SP-B染色(E)小鼠肺局部顯示人SP-B藍色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(F)RT-PCR證實肺中有供體來源的上皮細胞(G)Western blot證實供體來源的上皮細胞圖11干細胞亞群參與受體小鼠消化道上皮細胞損傷的修復(A)小腸中人特異抗體pan-CK染色(B)小鼠小腸局部顯示人pan-CK藍色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(C)胃中人特異抗體pan-CK染色(D)小鼠胃局部顯示人pan-CK藍色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(E)和(F)RT-PCR證實受體鼠內臟中有供體來源的上皮細胞圖12干細胞亞群參與受體小鼠肝上皮細胞損傷的修復(A)人特異抗體ALB染色(B)小鼠肝臟局部顯示人ALB藍色，人CD45紅色，人Y-染色體DNA探針綠色(箭頭指示)(C)RT-PCR證實受體鼠肝臟中有供體來源的ALB+上皮細胞(D)Western blot證實有功能的供體來源肝上皮細胞具體實施方式
本發明涉及一種脂肪間充質干細胞及其分離和體外擴增培養的方法及由該方法獲得的脂肪間充質干細胞。本發明還涉及所述脂肪間充質干細胞在制備可誘導分化為造血細胞、血管內皮細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、神經細胞、上皮細胞的藥物中的用途。
具體地說，本發明的方法可包括如下步驟取人脂肪組織，用膠原酶消化，經梯度離心、過濾，隨后在體外培養體系中進行擴增培養，其中所述體外培養體系含有DMEM/F12、EFG和FCS；較佳地，所述體外培養體系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/ml EFG和1-10％FCS；優選含有95％DMEM/F12、5％FCS20ng/ml EGF的培養體系。此外，在所述培養體系中還可以加入100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素等，本領域的普通技術人員應知如何選擇合適的成分、配比以使所述培養體系達到最佳效果。
細胞形態學觀察和生長特點取上述1、3、6代脂肪間充質干細胞亞群，置于有小玻片的3.5cm直徑平皿中，37℃，飽和濕度，5％CO2培養12天后取出空氣風干，瑞士染色，油鏡下觀察細胞形態。倒置顯微鏡下，培養細胞大部分于24小時內即貼壁，細胞成圓形，有小的胞漿突起。72小時后，大多數細胞有胞漿突起。一周后以梭形細胞為主，胞漿豐富，核大，核染色質細，核仁明顯。瑞士染色后，于光鏡下可見成纖維樣細胞形態，細胞成平行排列生長或漩渦狀生長(圖1)。種入96孔板的單個細胞呈克隆樣生長。
細胞生長曲線的測定取各代細胞，消化計數，接種于24孔板內(5×103細胞/孔)，37□，飽和濕度，5％CO2培養，每天取兩孔細胞進行計數，計算均值，繪制生長曲線(圖2)。在細胞生長的對數期，脂肪干細胞亞群倍增時間為25小時。
流式細胞儀鑒定脂肪間充質干細胞的表型、細胞周期以及免疫組化分析細胞表型測定用間接免疫熒光法檢測。一抗為小鼠抗人的單克隆抗體CD105、CD11a、CD29、CD34、CD31、CD44、CD166、CD45。為檢測細胞內抗原Flk1，細胞與一抗孵育之前，用2％多聚甲醛4℃固定15min，并在室溫下用0.1％的皂角素透膜1h。細胞用洗液PBS洗過后，加入FITC標記的二抗4℃孵育30min。細胞洗兩次，并懸浮在500ul的PBS中，置于冰上待流式細胞儀檢測。結果表明細胞表面CD11a、CD31、CD34、CD45、HLA-DR為陰性，流式結果基本在1％以下；CD29、CD44、CD105、CD166、Flk-1為陽性，流式結果在98％以上(圖3)。
細胞周期分析用流式細胞儀(FACSVantage型)檢測，ModFIT軟件分析結果，發現超過80％的細胞都處于G0/G1期。
免疫組化分析采用SA法檢測I型膠原的表達為陽性、vWF因子的表達為陰性。
體外向三個胚層多系誘導分化取上述所得的單克隆來源擴增細胞，以5×103/cm2接種于25cm2培養瓶和6cm直徑的培養皿。
1.成骨分化體系含10-7M地塞米松、10mMβ-磷酸甘油、0.05mM維生素C和10％FCS的IMDM；在第4天、第8天、第12天和第16天分別von Kossa染色法檢測鈣化小結及骨鈣蛋白基因的表達檢測。結果顯示成骨培養中細胞形態由原來的梭形變成了立方形，隨著細胞生長密度的增長形成多層的結節結構，而對照中細胞仍是梭形且呈單層生長；von Kossa染色發現第四天細胞分泌的鈣化基質，在第八天有明顯的鈣化基質沉積，而對照中未見到此現象(圖4)；RT-PCR分析表明干細胞亞群經誘導分化培養后表達骨鈣蛋白基因。說明干細胞亞群可在體外誘導分化為成骨細胞。
2.脂肪分化體系含10-6M地塞米松、0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.1mM維生素C和10％FCS的IMDM。在第4天、第8天、第12天和第16天分別油紅-O染色及脂蛋白脂酶基因的表達檢測。結果顯示培養8天可見到折光度增加的液泡充滿整個細胞；油紅-O染色發現培養中約90％細胞富含脂肪滴，而對照體系中的細胞脂肪滴很少(圖5)；RT-PCR分析表明經誘導分化培養后表達脂蛋白脂酶基因，而對照體系不表達或只有微量表達。說明干細胞亞群可在體外誘導分化成脂肪細胞。
3.成軟骨分化體系含DMEM-HG、MCDB、2％FCS、地塞米松10-7M、TGF-β10ng/ml的IMDM。在第4天、第8天、第12天和第16天分別阿爾新藍染色，免疫組化法檢測II型膠原，RT-PCR法檢測II型膠原基因表達。結果顯示培養四天即可通過免疫組化檢測到II型膠原的表達，而對照組中陽性細胞較少；RT-PCR分析表明細胞經軟骨誘導分化培養后表達II型膠原基因，而對照體系不表達或只有微量表達；培養八天后，通過阿爾新藍染色可檢測到蛋白多糖，對照組只有微量表達。從而鑒定干細胞亞群成軟骨分化潛能。
4.成神經誘導分化體系用含有1mM巰基乙醇和20％FCS的DMEM培養液預誘導24小時，再用含有10mM巰基乙醇的DMEM培養液誘導5小時。免疫組化法檢測NSE(神經特異烯醇化酶)，NF(神經絲蛋白)，GFAP(神經膠質蛋白)。結果顯示預誘導過程中細胞形態無明顯變化，誘導4小時后，細胞形態明顯改變。一部分細胞呈神經樣，所有的誘導后細胞NF，NSE陽性，GFAP陰性(圖6)。
5.內皮細胞誘導分化體系含30ng/mL VEGF，10nng/mL bFGF的內皮誘導培養基。向內皮誘導的分化情況用免疫熒光、免疫電鏡及免疫印跡鑒定。定向誘導14天后，未加內皮誘導培養基的對照組細胞倒置顯微鏡下未見有形態上的變化，而實驗組細胞則見形成典型的鵝卵石樣的細胞區(見圖7a)，免疫組化顯示實驗組細胞表達CD31(見圖7b、c)及vWF(見圖7d、e)，免疫電鏡及免疫印跡結果進一步證實上述結果(圖7f、g)。
6.上皮細胞誘導分化體系擴增培養基中不含EGF，培養12小時后，將培養基改為含30ng/mL HGF，20ng/mL bFGF的上皮細胞誘導培養基。向上皮樣細胞誘導的結果用免疫熒光、免疫印跡及RT-PCR鑒定。向肝上皮樣細胞定向誘導14天后，免疫熒光檢測結果顯示實驗組細胞ALB及CK18陽性，RT-PCR進一步證實上述結果(圖8)。
體內多向分化研究，治療機體多組織損傷1.干細胞亞群體內移植以接受亞致死量照射的非肥胖型糖尿病及嚴重聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠為損傷模型，將受體雌性NOD/SCID小鼠(6-8周鼠齡)預先經銫源全身照射300cGy后在4小時內從尾靜脈輸入脂肪來源干細胞亞群細胞，對照組小鼠則注射等體積RPMI 1640。
2.血管新生模型建立雌性NOD/SCID小鼠(6-8周鼠齡)，移植細胞4小時前，剪去背部毛發(直徑約6cm)，碘酒消毒，使用微型打孔機在此區域造成一創傷，使該皮膚創傷的傷口深達真皮層。移植細胞(106/只)后7天，在麻醉狀態下活檢創傷部位，三色免疫熒光法檢測細胞參與受體小鼠皮膚受損部位血管新生的情況。
3.細胞體內植入及分化檢測結果于移植后2月，取受體小鼠的骨髓及脾細胞，應用人特異性抗體，通過流式細胞術、免疫組化和RT-PCR的方法，檢測受體小鼠中人造血細胞表面標志(CD34，CD45，CD2，CD7，CD10，CD13，CD14，CD19，CD33，CD38等)的表達情況；取受體小鼠的各種組織(受損皮膚愈合部位，氣管，肺，肝，小腸，胃等)制備切片，利用抗人角蛋白(pan-cytokeratin，pan-CK)、白蛋白(ALB)或表面活性物質B(surfactant B，SP-B)的特異性抗體，通過組化、免疫熒光以及Y染色體熒光原位雜交(Y-FISH)、RT-PCR和Western Blot等方法檢測受體小鼠不同組織中人源細胞的植入及分化情況。取受體小鼠血清，用抗人ALB特異性抗體行Western Blot檢測；為了解供體來源細胞在受體鼠體內是否也能夠向血管內皮分化并避免與人源造血細胞相混淆，我們利用不同顏色熒光標記的抗鼠vWF多克隆抗體(Cy5)、抗人vWF單抗(FITC)和抗人CD45單抗(PE)對組織切片進行了三色免疫熒光組化。
研究結果表明□脂肪來源干細胞亞群參與受體小鼠的造血重建。接受移植后2月，在受體NOD/SCID小鼠體內即可檢測到高水平的、表達人造血細胞表面標志的細胞。流式細胞術顯示受體骨髓中人CD45+細胞比例可高達40％，其中既有淋巴細胞，也含有髓系細胞。RT-PCR證實受體鼠骨髓中有人特異性基因的表達(人GADPH及CD45、CD34、CD19、CD33)。另外，免疫熒光顯示受體鼠脾中存在人CD45+和CD19+細胞，而未接受細胞移植的對照鼠脾細胞，染色則為陰性。因此，正是植入的人脂肪來源干細胞亞群參與了受體小鼠的造血重建；□向血管內皮分化。通過三色免疫熒光組化發現，如圖9所示，在大多數(高達80％)受體鼠體內(小腸、肝、肺及皮膚損傷模型等組織)，都能檢測到表達人內皮細胞表面標志vWF的細胞，它們參與受體照射后微血管損傷的修復；在血管新生模型中，也可檢測到人源內皮細胞參與血管新生。通過對人CD45染色，證實這些人vWF+細胞并不表達CD45，從而排除了是造血細胞的可能；□皮膚組織再生。在受體鼠皮膚受損部位明顯可見創傷愈合，生成正常皮膚組織和毛發，免疫組化檢測到供體來源的皮膚細胞(pan-CK+CD45-Y-chromosome+)，RT-PCR和Western Blot均證實再生的皮膚組織來源于人脂肪來源的干細胞亞群，從而證明了該干細胞亞群在體內可分化為有功能的正常皮膚組織。
□供體來源的上皮細胞。在受體鼠的氣管、肺、消化道和肝中，檢測到供體來源的上皮細胞(pan-CK+CD45-Y-chromosome+或SP-B+CD45-Y-chromosome+)或肝細胞(ALB+CD45-Y-chromosome+)，而未接受細胞移植的對照鼠則為陰性。這一結果亦得到RT-PCR的證實。Westem Blot示受體小鼠血清中含有人ALB，RT-PCR證實其肝臟中有人ALB mRNA表達。這些都說明，移植的細胞能夠在受體體內分化為消化道上皮細胞及有功能的肝細胞(圖10，11，12)。
□二次移植。取已移植成功(RT-PCR、FACS及免疫熒光證實)的首次移植小鼠(3只)的骨髓細胞，以2×107/只尾靜脈輸注給另三只預先經銫源全身照射300cGy的雌性NOD/SCID小鼠(6-8周鼠齡)，二次移植3個月后，在受體小鼠的骨髓、脾、氣管、肺、肝和消化道中，同樣也檢測到人源細胞，分布與第一次移植相似，分別表達造血、內皮、上皮以及肝細胞的特征性表型(表1)。更進一步提示人脂肪來源干細胞亞群屬于一類亞全能干細胞群體，很可能成為一種理想的種子細胞，可作為造血干細胞移植中CD34+造血干細胞的替代品及用于治療一些遺傳及退行性疾病。
表1脂肪間充質干細胞在受體鼠內分化為造血細胞

以下結合具體實施例對本發明做進一步說明。但并不意味著本發明僅限于此。
實施例1人脂肪來源的間充質干細胞(MSC)的分離和體外擴增培養取人脂肪組織，用D-Hank’s液沖洗，剪碎，0.2％II型膠原酶37℃消化2小時，用D-Hank’s液洗滌中止II型膠原酶的作用，離心1000r/m，10min后，用200目的濾網過濾，并用移液管反復吹打，使之成為單細胞懸液，在體外培養體系(含95％DMEM/F12、5％FCS20ng/ml EGF、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素)。中置37℃，5％CO2培養箱培養，1天后換液，棄去非貼壁細胞，以后每三天半量換液。第一代細胞以0.6細胞/孔的密度種入96孔板，24小時后顯微鏡下挑選并記錄只有一個細胞的孔，當細胞達80-90％融合時，0.25％胰酶常規消化傳代，做單克隆細胞培養。
實施例2人脂肪來源的間充質干細胞體內重建造血1.干細胞亞群體內移植NOD/SCID鼠8-10周，預先經Cs137全身照射300rad隨機分為2組，每組4只，照射后4小時內從尾靜脈輸入細胞。□對照組輸入0.4ml/只生理鹽水；□輸入2×106/0.4ml/只人脂肪來源的干細胞亞群(實施例1制備)。輸入的干細胞亞群預先經PKH26染色，染色步驟按照Sigma的說明書進行。移植24小時后實驗組和對照組NOD/SCID鼠皮下注射G-CSF2400ng/只。對照組小鼠在經Cs137全身照射后在7-14天死亡，實驗組小鼠全部存活1個月以上。
2.受體小鼠骨髓和脾臟的細胞的流式細胞儀分析NOD/SCID小鼠移植一個月和兩個月后，分別斷頸處死，收集骨髓和脾臟細胞，用0.016M的NH4CL溶解紅細胞，D-Hanks液洗滌中止，用含0.5％的牛血清白蛋白的PBS沖洗，加入一抗4℃孵育30min，一抗為人特異性的FITC標記的CD3，CD14，CD19，CD33，CD34，CD45。細胞洗兩次，并懸浮在500ul的PBS中，置于冰上待流式細胞儀檢測。移植后的小鼠在一個月的時候，流式細胞儀分析小鼠骨髓PKH26陽性的細胞為22.6％，脾臟PKH26陽性的細胞為21.5％。移植后的小鼠在兩個月的時候，流式細胞儀分析小鼠骨髓和脾臟人血液細胞特異性抗體陽性的細胞，骨髓CD344.14％，CD1444.36％，CD1941.32％，CD3351.08％，CD3444.66％，CD4541.84％；脾臟CD314.84％，CD1428.99％，CD1914.82％，CD3320.23％，CD3417.30％，CD4513.31％。
3.受體小鼠骨髓和脾臟細胞RT-PCR分析NOD/SCID小鼠移植兩個月后，斷頸處死，收集骨髓和脾臟細胞，檢測人源干細胞亞群分化為CD19，CD33，CD34，CD45陽性的細胞。小鼠骨髓和脾臟細胞用Dynabeads mRNA direct kit(Dynal，Oslo，Norway)提取總RNA，逆轉錄為cDNA。引物序列為CD19(594bp)，5′-CGA GTT CTA TGA GAA CGA CTC-3′and 5′-ACTGGA AGT GTC ACT GGC ATG-3′；CD34(647bp)，5′-GTC TTG ACA ACA ACGGTA CTG C-3′and 5′-CAA GAC CAG CAG TAG ACA CTG A-3′；CD45(418bp)，5′-CAG GCA TGG TTT CCA CAT TC-3′and 5′-CTA CAA ATA TTG GTT CGCTGC-3′；CD33(640bp)，5′-AAC CTT ACC TGC TCT GTG TCC TGG GC-3′and 5′-GCC TGA TGC TCT TGA GGG TTC CTC AC-3′；PCR的反應條件是96℃變性5min后，94℃變性1min，58℃退火50sec，72℃延伸1min共35個循環，最后72℃延伸10min。RT-PCR分析結果為CD19，CD33，CD34，CD45人特異性片段的表達均為陽性，而對照組則均為陰性。
4.受體小鼠和對照組小鼠CFU-CM培養的比較分析取實驗組和陰性對照組NOD/SCID小鼠骨髓組織制成單細胞懸液，用白細胞稀釋液計數有核細胞數量。正常成人的骨髓5ml，用Ficoll(1.077g/cm3)分離液分離單個核細胞，1200r/m離心20min，取白環以上的細胞1000r/m離心10min，計數。在含30％胎牛血清，40ng/mlGM-CSF(分別為人和小鼠的)和0.3％瓊脂的IMDM培養基的六空板中接種5×104個單個核細胞，培養皿置于37℃，5％CO2的飽和濕箱中培養10天，在倒置光學顯微鏡下計數含有多于50個細胞的集落的數目。實驗結果見表2，實驗組小鼠有CFU-GM，CFU-G，CFU-M的生長，而未移植的小鼠則沒有集落生長，從而證實人脂肪來源的間充質干細胞具有重建造血的能力，并可以分化為成熟的粒細胞，單核細胞和淋巴細胞。
表2受體小鼠和對照組小鼠CFU-CM培養的比較分析
實施例3人脂肪來源的間充質干細胞體內分化為血管內皮細胞我們設計了以下實驗先損傷NOD/SCID小鼠的皮膚，然后再經尾靜脈注射PKH26染色的細胞，7-9天后在肉芽腫最明顯的時候手術切除肉芽腫組織，熒光顯微鏡下觀察PKH26陽性的細胞的分布，并用人特異性血管內皮抗體免疫熒光染色。NOD/SCID小鼠在損傷后第8天左右，肉芽腫最明顯，切下的肉芽腫組織經冰凍切片，免疫熒光染色，熒光顯微鏡下可以見到(圖9)(1)冰凍切片可見到PKH26的紅色熒光，證明存在人源性的細胞存在；(2)CD31，vWF的冰凍切片中可見到FITC的綠色熒光，證明為人來源的血管內皮細胞；(3)比較紅色熒光和綠色熒光的照片，可以見到有些細胞同時有紅色熒光，和綠色熒光，證明其為人脂肪來源的MSC在NOD/SCID小鼠的損傷部位分化為血管內皮細胞。
本發明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應理解的是，在不偏離本發明精神之前提下，本領域技術人員可對其進行等同變換和修飾。它們的范圍也包括在所附的權利要求中。
權利要求
1.一種脂肪間充質干細胞分離和體外擴增培養方法，它包括取人體脂肪組織，用膠原酶消化，經梯度離心、過濾，隨后在體外培養體系中進行擴增培養；其特征在于，由該方法分離、培養獲得的脂肪間充質干細胞具有CD11a-、CD31-、CD34-、CD45-和HLA-DR-，且CD44+或Flk-1+的表型；所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為造血細胞、血管內皮細胞、成骨細胞、成軟骨細胞、神經細胞、上皮細胞。
2.權利要求1的脂肪間充質干細胞，其中所述體外培養體系含有90％-99％DMEM/F12、10-30ng/mlEFG和1-10％FCS；所述脂肪間充質干細胞還具有CD29+、CD105+和/或CD166+的表型。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為造血細胞的藥物的用途。
4.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為血管內皮細胞的藥物中的用途。
5.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為成骨細胞的藥物中的用途。
6.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為成軟骨細胞的藥物中的用途。
7.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為神經細胞的藥物中的用途。
8.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞經制備可分化為上皮細胞的藥物中的用途。
9.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述脂肪間充質干細胞作為種子細胞經制備可為人體其它組織工程、組織再生、修復的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及細胞的分離培養方法及其應用，具體涉及一種脂肪間充質干細胞的分離培養方法及其應用。它包括取人體脂肪組織，用膠原酶消化，經梯度離心、過濾，隨后在體外培養體系中進行擴增培養，其中所述體外培養體系含有DMEM/F12、EFG和FCS。本發明的脂肪間充質干細胞具有CD11a
文檔編號C12N5/08GK1778905SQ20041008440
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月22日 優先權日2004年11月22日
發明者趙春華 申請人:趙春華