專利名稱：植物表皮毛特異表達啟動子的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物生物工程和植物改良基因工程領域。具體地說，本發明涉及新的植物表皮毛特異表達啟動子GaRDL1的序列及其表皮毛特異表達相關的順式調控元件。本發明還公開了GaRDL1啟動子的用途，尤其在棉纖維和腺毛次生代謝基因工程中的應用。
背景技術：
植物表皮毛是單細胞水平上研究細胞分化、極性生長和形態建成的一個模式系統(Hulskamp，2004，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.5，471-480)。植物表皮毛分為腺毛和非腺毛，主要的功能是保護植物，如抵御蟲害、減少蒸發、提高抗凍力和防紫外線等(Marks等，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，137-163)。其中，棉纖維和腺毛還具有重要的經濟價值(Wilkins等，2000，Crit.Rev.Plant Sci.19，511-550；Wagner等，2004，Ann.Bot.(Lond)93，3-11)。
棉纖維是棉花種子的表皮毛，它是紡織工業最重要的天然纖維原料(Kim和Triplett，2001，Plant Physiol.1271361-1366)。E6啟動子是第一個分離到的棉纖維高表達啟動子，但是E6啟動子除了在棉纖維中優勢表達外，在子房、花和葉中也有少量表達。E6啟動子已用于改良棉纖維的基因工程(John和keller，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，12768-12773)。
我國是目前世界上最大的棉花生產和消費國家，但是我國迄今尚未在棉纖維上擁有具自主知識產權的啟動子，這阻礙了我國改良棉纖維的基因工程研究。大約三分之一的維管植物具有腺毛。植物腺毛分泌豐富的代謝產物，如萜類、糖、多糖、吲哚、煙堿和脂肪酸等，這些代謝產物可吸引昆蟲傳粉、防止動物取食和賦予植物芳香味，以及用于醫藥等用途(McCaskill和Croteau，1999，NatBiotechnol.17，31-6；Wagner等，2004，Ann.Bot.93，3-11)。
基因表達的特異性決定于它的啟動子的順式調控元件。特異表達啟動子是基因工程改良生物品質性狀的基本元件。有了啟動子，再連接上特定性狀相關的基因，可以定向改變生物的品質性狀。但是，迄今還沒有植物表皮毛(棉纖維)特異表達的順式調控元件的報道。
綜上所述，為了改良棉纖維的品質性狀和調控植物表皮毛次生代謝，本領域迫切需要開發新的更特異的植物表皮毛特異表達啟動子。
發明內容
本發明的目的就是提供一種新的植物表皮毛特異表達啟動子GaRDL1，及相關的植物表皮毛特異表達順式調控元件。
本發明的另一目的是提供產生GaRDL1啟動子的方法以及其應用，特別是在棉纖維和腺毛次生代謝基因工程中的應用。
在本發明的第一方面，提供了一種啟動子元件，它包括植物表皮毛特異表達啟動子GaRDL1的核苷酸序列。
較佳地，所述的啟動子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種用于在植物表皮毛中特異性表達的構建物，它含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的上述的GaRDL1啟動子元件。
在另一優選例中，所述的外源基因是MYB基因。
在本發明的第三方面，提供了一種載體，該載體含有上述的GaRDL1啟動子元件。較佳地，所述的載體是表達載體和質粒。
在本發明的第四方面，提供了一種在植物表皮毛中特異性表達外源基因的方法(也是一種產生轉基因植物的方法)，它包括步驟(a)提供一構建物，所述構建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的所述的GaRDL1啟動子元件，(b)將步驟(a)中的構建物導入植物細胞，獲得轉化的植物細胞；(c)將步驟(b)中轉化的植物細胞再生成植株，從而使使外源基因在植物表皮毛中表達。
在本發明的第五方面，提供了一種植物表皮毛特異表達順式調控元件，選自下組(a)L1 box調控元件，序列為SEQ ID NO1中82-89位；
(b)MYB基序調控元件，序列為SEQ ID NO1中103-108位。
在本發明的第六方面，提供了所述的GaRDL1啟動子元件或上述植物表皮毛特異表達順式調控元件的用途，它們被用于在植物表皮毛中特異性表達外源基因或用于改良棉纖維。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。
圖1顯示了GaRDL1啟動子的序列(SEQ ID NO1)。圖中下劃線的序列TGCATTTA、CAGTTG和TATAAAT分別是調控元件L1 box、MYB motif和TATA box。其中，GaRDL1啟動子位于GaRDL1基因翻譯起始位點ATG上游的-221～+81。L1 box和MYB motif的序列分別位于GaRDL1基因的-140～-133和-119～-114。
圖2顯示了GaRDL1基因在棉花中的表達特征。DPA代表開花后的天數(dayspost-anthesis)。His代表histone3基因。rRNA代表核糖體RNA。
圖3顯示了GaRDL1∷GUS在擬南芥中的表達特征。
圖4顯示了GaRDL1啟動子對擬南芥腺毛次生代謝的影響。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次從亞洲棉(Gossypium arboreum)(也稱為木本棉)中分離到一個植物表皮毛特異表達的啟動子，命名為GaRDL1啟動子。Northern雜交和RT-PCR分析的試驗結果表明，GaRDL1是一個棉纖維特異表達的基因；GaRDL1∷GUS分析表明，GaRDL1是一個擬南芥表皮毛特異表達的啟動子；接頭掃描和點突變分析表明，L1 box和MYB基序元件是決定GaRDL1啟動子在表皮毛中特異表達的順式調控元件。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，術語“GaRDL1是Gossypium arboreum RD22-like 1的縮寫。
如本文所用，術語“GaRDL1啟動子”、“GaRDL1啟動子區域”可互換使用，指具有GaRDL1啟動子序列(SEQ ID NO1)或其活性片段的多聚核苷酸。
如本文所用，術語“啟動子”是指基因轉錄起始位點上游的一段序列。
如本文所用，術語“順式調控元件”是指對基因的轉錄起始和轉錄效率起調節作用的保守堿基序列。
如本文所用，術語“特異表達”是指基因在特定的時間和特定的組織表達。
如本文所用，術語“目的基因”是指基因工程中與特定品質性狀相關的基因。
本發明涉及GaRDL1啟動子及其多核苷酸變異體。這些多核苷酸變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變該啟動子的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上至GaRDL1啟動子的全長。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離本發明的啟動子的核苷酸序列。
本發明的GaRDL1啟動子的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列來設計引物，并用棉花基因組DNA作為模板，擴增而得有關序列。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經可以完全通過化學合成來得到本發明啟動子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用于獲得本發明的啟動子元件。
本發明也涉及包含本發明啟動子元件的構建物或載體，以及用所述構建物或載體轉化或轉導的宿主細胞(尤其是植物細胞)，以及由此產生外源蛋白和將轉化的植物細胞再生成植株的方法。
適用于本發明的外源基因沒有特別限制，幾乎所有的外源基因都可用于本發明，尤其是與。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)GaRDL1基因、MYB基因、GaMYB2基因(SEQ ID NO4或6)、GFP基因等。將這些基因與本發明的GaRDL1啟動子相連，形成含外源基因的構建物，然后將所述構建物用于基因治療。
一類優選的外源基因是MYB基因。MYB基因是克隆棉纖維發育關鍵基因的焦點，一些自棉纖維中分離的MYB基因的表達特征和進化關系受到重視(Cedroni等，2003，Plant Mol.Biol.51313-325)。
一種構建物的例子就是與GaRDL1啟動子直接相連的外源基因。通常，GaRDL1啟動子應位于外源基因的上游。
本發明中，含GaRDL1啟動子元件的核苷酸序列可優選地插入到載體，例如表達載體中。術語“載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于表達載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細菌)、真核(如酵母)、植物細胞中的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。在表達載體中，除了含有含有復制起點、GaRDL1啟動子元件之外，還可含有標記基因和其他翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含GaRDL1啟動子和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地與待表達的外源基因相連接，以指導所述外源基因mRNA合成。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達外源蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
在應用本發明的啟動子時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子等。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得表皮毛改變的植物。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
本發明的顯著優點在于GaRDL1啟動子具有極高的植物表皮毛表達的特異性，因此在棉纖維和腺毛次生代謝基因工程中具廣闊的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆實驗手冊(Molecular cloningA laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物學實驗手冊(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1GaRDL1啟動子的分離棉花DNA提取采用冷酚法。2g材料(亞洲棉(Gossypium arboreum)的棉纖維)，在液氮中磨成粉末，轉移到50ml離心管中，加入8ml提取緩沖液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，震蕩混勻，冰上放置1小時，每隔10分鐘混勻一次。4℃，13000g離心20分鐘。重復酚∶氯仿∶異戊醇抽提2～4次，最后用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次。取上清夜，加入1/2體積的高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉，1.2M NaCl)和1/2體積異丙醇，混勻，-70℃放置1小時。4℃，13000g離心20分鐘。以下根據提取DNA和RNA而采取相應的操作。去上清液，用1ml 70％乙醇清洗沉淀2次，室溫吹20分鐘，沉淀溶于1ml無菌水。4℃，13000g離心10分鐘。取上清液，加5～10μl RNase(10mg/ml)，37℃，30分鐘。
用以下引物RDL1-P-F5’-AATTAGTTATGTTTGGTAAATGAATTTG-3’(SEQ ID NO2)和RDL1-P-R5’-CTAGAACAG GAGTGACTAATTCTA-3’(SEQ ID NO3)。PCR反應條件94℃預變性5分鐘；然后94℃預變性30秒鐘，60℃復性30秒鐘，72℃延伸30秒鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。亞克隆后經測序確認序列是否正確。
測序結果如SEQ ID NO1和圖1所示，它包含的多核苷酸序列全長為302個堿基，其中下劃線的序列TGCATTTA、CAGTTG和TATAAAT分別是調控元件L1 box(L1盒)、MYB motif(MYB基序)和TATA box(TATA盒)。
用上述相同方法抽提棉花的各種組織的DNA，用相同引物進行常規的RT-PCR。還用基于SEQ ID NO1的探針進行Northern雜交分析。結果表明GaRDL1是一個棉纖維特異表達的基因(圖2)。
實施例2載體構建和農桿菌轉化根據載體多克隆區域、GaRDL1啟動子和目的基因的限制性酶切位點的分布情況，確定融合片段插入載體的酶切位點，然后采用PCR方法將酶切位點引入GaRDL1啟動子和目的基因。經酶切和連接，熱激法轉化大腸桿菌，PCR法鑒定陽性克隆，測序驗證。
根據外源基因GUS基因的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(對應于最前20bp和最后20bp)，經PCR擴增后得到GUS序列，然后與GaRDL1啟動子直接相連(位于啟動子下游)。然后將該DNA序列(GaRDL1∷GUS序列)克隆至中間載體pBluescript(購自Stratagene公司)，進一步克隆到雙元表達載體pBI121(購自Clontech公司)，在保證閱讀框的前提下鑒定好的表達載體，在將其轉入農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，獲得陽性克隆，用于轉化棉花和擬南芥等植物。
根癌農桿菌的轉化采用凍融法。單菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mlLB培養基(25μg/ml利福霉素Rif和50μg/ml卡拉霉素Kan或慶大霉素Gen)，28℃，220rpm，過夜培養。2ml菌液，50ml LB培養基(25μg/ml Rif和50μg/mlGen)，28℃，220rpm，培養到OD600＝0.5(約6小時)。在冰上放置30分鐘，4℃，5000g離心5分鐘。重懸于10ml 0.15M NaCl。4℃，5000g離心5分鐘。重懸于1ml 20mM CaCl2，50μl/管分裝，液氮速凍，-70℃保存感受態細胞。混合含目的基因雙元載體和50μl/管感受態細胞，在冰上放置30分鐘，液氮速凍1分鐘。在37℃水浴中5分鐘使菌液融化，加1ml LB培養基，28℃，220rpm，培養2～4小時。取50～100μl涂LB培養基平板(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml卡拉霉素Kan或潮霉素Hyg)。
實施例3植物轉化以及轉基因后代的篩選在本實施例中，以棉花和擬南芥的轉基因為例，其他植物的轉化可以此為參照。
a.棉花的轉基因采用農桿菌介導的方法轉化棉花。
取5日齡的無菌苗下胚軸上部切段(0.5cm)預培養36小時。培養基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L。
下胚軸切段于農桿菌菌液(SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L)中浸泡20分鐘。
共培養3天。培養基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L。
愈傷組織起始誘導25～30天。培養基SH+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+Km50mg/L+頭孢霉素(cef)300mg/L或MSB+2，4-D 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L+ZT0.1mg/L+Km 50mg/L+cef 300mg/L。
胚性愈傷組織誘導及繼代篩選，每15天增殖一次。挑選松軟、淡綠色或灰色的愈傷組織用于胚性愈傷的誘導；挑選新鮮、黃色、致密、顆粒狀的胚性愈傷組織繼代增殖。培養基SH或MSB(NH4NO3為0.3mg/L)+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。
胚狀體形成和成熟。培養基MSB(KNO3加倍無激素)+Km 75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體(萌發)伸長、生長。培養基MSB(無激素)+活性炭250mg/L+Km75mg/L+Cef 300mg/L。
胚狀體真葉生長。培養基MSB+IBA0.4mg/L+KT0.1mg/L+Km75mg/L+Cef300mg/L。部分成正常小植株；部分采取嫁接。
b.擬南芥的轉基因擬南芥植物的轉化采用花芽浸泡法(floral dip)(方法按Clough和Bent，1998，Plant J.16，735-743進行)。含雙元載體的單菌落GV3101(Invitrogen公司)，3ml LB培養基(25μg/ml Rif、50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時。2ml菌液，50ml LB培養基(25μg/ml Rif、50μg/mlGen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時。50ml菌液，250ml LB培養基(50μg/ml Gen和50μg/ml Kan或Hyg)，28℃，220rpm，12小時。4200rpm(2900g)，15分鐘。菌體重懸于500ml含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5sec，平放于塑料盆內，保濕，避光，16～24小時。T0代種子在4℃春化2～4d，用20％漂水處理15分鐘，無菌水清洗3～4遍。懸于0.5％的瓊脂糖(55℃)，鋪在0.6％瓊脂的LB培養基(50μg/ml Kan或Hyg)，22℃，連續光照，約一周后，綠色抗性苗移栽到營養土(泥炭∶蛭石∶珍珠巖1∶1∶1)中生長。
結果表明，外源的GUS基因特異地在葉片和莖的表皮毛表達，使表皮毛呈現出藍色(圖3)。
實施例4轉基因植物的分子生物學鑒定在本實施例中，選取實施例3獲得的擬南芥T3代純合株系，采用抗生素篩選、PCR、GUS染色和Southern雜交分析等方法對轉基因植株進行驗證。
a.PCR分析DNA提取方法和PCR反應條件見實施例1。引物為SEQ ID NO2和3。
b.GUS染色分析GUS染色液浸泡植物材料，37℃，12～24小時。70％乙醇脫色，樣品在70％乙醇中保存。GUS染色液(100mM pH7.0磷酸緩沖液，50mM K3[Fe(CN)6]，50mMK4[Fe(CN)6]，10mM EDTA，1mM X-gluc，0.1％Triton X-100)。
結果表明，外源的GUS基因特異地在葉片和莖的表皮毛表達(圖3)。
c.Southern雜交分析10μg DNA，選3～5種限制酶，完全酶切(過夜)。0.7％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束后切去凝膠的無用部分。在變性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡45分鐘，溫和搖動。去離子水漂洗，在中和液(1.5M NaCl，1M Tris·HCl，pH7.4)中浸泡45分鐘，溫和搖動。
采用毛細管轉移法將DNA轉移到尼龍膜Hybond-XL(Amersham-PharmaciaBiotech)，轉移緩沖液為20XSSC(3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉)，轉移時間為12-18小時。用6XSSC漂洗尼龍膜，夾在濾紙中間，壓在玻璃板之間，80℃烘2小時。
25ng經割膠醇化的PCR產物，采用Primer-a-Gene Labeling System(Promega)標記探針。α-32P-dCTP，50μl反應體系，37℃，1小時。采用QIAquick NucleotideRemoval Kit(QIAGEN)純化探針。沸水浴中10分鐘，放置冰上。
將尼龍膜放入雜交管中，加10ml預雜交液(50％甲酰胺，5XSSC，5XDenhardt，1％SDS，100μg/ml變性魚精DNA)，42℃，2～4小時。加入變性的探針，雜交16～24小時。
去雜交液，在室溫用含0.1％SDS的2XSSC洗膜2次，每次5分鐘。在室溫用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次5分鐘。在42℃用含0.1％SDS的0.2XSSC洗膜2次，每次15分鐘。在室溫用2XSSC洗膜2次。取出尼龍膜，滴干雜交液，用保鮮膜包裹，膠帶固定，壓增感屏和X-ray膠片，-70℃，2d。膠片用D-72液顯影。
試驗結果表明，轉基因的擬南芥植株中的確轉入了GaRDL1啟動子序列，而對照的擬南芥植株則不含GaRDL1啟動子序列。
實施例5對擬南芥表皮毛的植物基因工程改造在本實施例中，按實施例3b中相同的方法轉化擬南芥。不同點在于用植物表皮毛調控蛋白GaMYB2(一種棉花的MYB蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO5所示，基因組DNA序列如SEQ ID NO4所示，cDNA序列如SEQ ID NO5所示)的基因組序列(SEQ ID NO4)替換GUS基因序列。
結果見圖4。圖4表明，轉入擬南芥后，GaRDL1∷GaMYB2使野生型表皮毛減少。此外，GaRDL1∷GaMYB2完全互補擬南芥gl1突變體，使gl1無毛突變體的體毛恢復(圖中GaRDL1簡寫為GL1)。這些結果表明，GaRDL1能用于在植物表皮毛中特異性表達外源基因或用于改良植物腺毛次生代謝。
實施例5表皮毛中特異表達的順式調控元件的確定用常規方法(Molecular cloningA laboratory manual，3rd ed.，Sambrook)進行接頭掃描和點突變分析，然后按實施例3b的相同方法測定突變后的GaRDL1啟動子能夠在擬南芥的表皮毛中表達GUS蛋白。
實驗結果表明，(a)L1 box調控元件(序列為SEQ ID NO1中82-89位)和(b)MYB基序調控元件(序列為SEQ ID NO1中103-108位。)是決定GaRDL1啟動子在表皮毛中特異表達的順式調控元件。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院<120>植物表皮毛特異表達啟動子<130>044447<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>302<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>1aattagttat gtttggtaaa tgaatttgaa tacatgcacc accactctca atgctcaccc60acctaagccc atgacataaa ctgcatttaa gtgaaccagt ggcagttgga gccattatgt120tggttgaaaa atattgttgg cagtgttatt cagcagtact tgttctaagg ctcctactac180atttctcatt ataaatgtgg agaaatcttg ttctactttc cattccatgc aacactaact240tttagattcc ctttccattg cactgctctt tctttctata gaattagtca ctcctgttct300ag 302<210>2<211>28<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>2aattagttat gtttggtaaa tgaatttg 28<210>3<211>24<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>3ctagaacagg agtgactaat tcta 24<210>4<211>818<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<220>
<221>CDS<222>(74)..(209)
<223>
<220>
<221>CDS<222>(288)..(745)<223>
<400>4ccttcccttg tttctcacta atcatctctg tcttcccttc tcactctttg cctcttctca 60ctgtcggcta ata atg gct cca aag aag gat gga gtg agc aaa agg gtt 109Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val1 5 10ttt aac aaa ggt tct tgg aca gct gag gaa gat aga aga ttg gct aaa157Phe Asn Lys Gly Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys15 20 25tat att gag att cat ggc gca aag aga tgg aaa aca atc gcc att aaa205Tvr Ile Glu Ile His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys30 35 40tca g gtaatttact ttctgttgaa gagaaactcc attttttgga gcattggaat 259Ser45taacgggtta ttttgttttg atgtatag gt ttg aat cga tgc ggc aag agt 310Gly Leu Asn Arg Cys Gly Lys Ser50tgc agg ttg aga tgg ttg aac tac ttg aga cct aac att aag aga ggc358Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro Asn Ile Lys Arg Gly55 60 65aac ata tca gat gaa gaa gag gac tta att att agg ctt cat aaa ctg406Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Lys Leu70 75 80 85ctg ggg aac agg tgg tct ttg att gct ggg aga ctt cca ggg cga aca454Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr90 95 100gac aat gaa att aag aac tac tgg aat tcc cat ttg agc aag aaa ata502Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu Ser Lys Lys Ile105 110115ata aac cat gat gtc aga aca gaa caa act tcc tcc tcg gaa caa att550Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser Ser Ser Glu Gln Ile120 125130gtg cct cac aaa gca tgg gaa act gtc cat atg gaa gaa gaa gag gta598Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met Glu Glu Glu Glu Val135 140145gta aaa gga agt gat gaa att gaa aac tct gaa ttc agc att gat gtg646Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu Phe Ser Ile Asp Val150 155160 165gac gaa ttc ttt gac ttc aca acg gaa ggt tgc ttt act ttg gat tgg694Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys Phe Thr Leu Asp Trp170175 180gtg aat aag ttc ctt gaa ctt gat gat caa cag gat cca tta gca atg742
Val Asn Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Gln Gln Asp Pro Leu Ala Met185 190195gta taataagttt gtaattaaca tgtttccttg gataaataaa taaagagatg 795Valttctgagtct aaaaatggaa gat 818<210>5<211>198<212>PRT<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>5Met Ala Pro Lys Lys Asp Gly Val Ser Lys Arg Val Phe Asn Lys Gly1 5 10 15Ser Trp Thr Ala Glu Glu Asp Arg Arg Leu Ala Lys Tyr Ile Glu Ile20 25 30His Gly Ala Lys Arg Trp Lys Thr Ile Ala Ile Lys Ser Gly Leu Asn35 40 45Arg Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Arg Pro50 55 60Asn Ile Lys Arg Gly Asn Ile Ser Asp Glu Glu Glu Asp Leu Ile Ile65 70 75 80Arg Leu His Lys Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg85 90 95Leu Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His100 105110Leu Ser Lys Lys lle Ile Asn His Asp Val Arg Thr Glu Gln Thr Ser115120 125Ser Ser Glu Gln Ile Val Pro His Lys Ala Trp Glu Thr Val His Met130 135140Glu Glu Glu Glu Val Val Lys Gly Ser Asp Glu Ile Glu Asn Ser Glu145 150155 160Phe Ser Ile Asp Val Asp Glu Phe Phe Asp Phe Thr Thr Glu Gly Cys165170 175Phe Thr Leu Asp Trp Val Asn Lys Phe Leu Glu Leu Asp Asp Gln Gln180 185190Asp Pro Leu Ala Met Val195<210>6<211>597<212>DNA<213>棉花(Gossypium arboreum)<400>6atggctccaa agaaggatgg agtgagcaaa agggttttta acaaaggttc ttggacagct60gaggaagata gaagattggc taaatatatt gagattcatg gcgcaaagag atggaaaaca120
atcgccatta aatcaggttt gaatcgatgc ggcaagagtt gcaggttgag atggttgaac180tacttgagac ctaacattaa gagaggcaac atatcagatg aagaagagga cttaattatt240aggcttcata aactgctggg gaacaggtgg tctttgattg ctgggagact tccagggcga300acagacaatg aaattaagaa ctactggaat tcccatttga gcaagaaaat aataaaccat360gatgtcagaa cagaacaaac ttcctcctcg gaacaaattg tgcctcacaa agcatgggaa420actgtccata tggaagaaga agaggtagta aaaggaagtg atgaaattga aaactctgaa480ttcagcattg atgtggacga attctttgac ttcacaacgg aaggttgctt tactttggat540tgggtgaata agttccttga acttgatgat caacaggatc cattagcaat ggtataa 59權利要求
1.一種啟動子元件，其特征在于，它包括植物表皮毛特異表達啟動子GaRDL1的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的啟動子元件，其特征在于，它包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
3.一種用于在植物表皮毛中特異性表達的構建物，其特征在于，它含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權利要求1所述的啟動子元件。
4.如權利要求3所述的構建物，其特征在于，所述的啟動子元件包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
5.如權利要求3所述的構建物，其特征在于，所述的外源基因是MYB基因。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的啟動子元件。
7.一種在植物表皮毛中特異性表達外源基因的方法，其特征在于，它包括步驟(a)提供一構建物，所述構建物含有外源基因以及與該外源基因可操作地連接的權利要求1所述的啟動子元件，(b)將步驟(a)中的構建物導入植物細胞，獲得轉化的植物細胞；(c)將步驟(b)中轉化的植物細胞再生成植株，從而使使外源基因在植物表皮毛中表達。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的啟動子元件包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
9.一種植物表皮毛特異表達順式調控元件，其特征在于，選自下組(a)L1 box調控元件，序列為SEQ ID NO1中82-89位；(b)MYB基序調控元件，序列為SEQ ID NO1中103-108位。
10.如權利要求1所述的啟動子元件或權利要求9所述的植物表皮毛特異表達順式調控元件的用途，其特征在于，用于在植物表皮毛中特異性表達外源基因或用于改良棉纖維。
全文摘要
本發明提供了植物表皮毛特異表達啟動子元件－棉花GaRDL1啟動子，含GaRDL1啟動子元件的構建物和載體，以及它們的用途。本發明的GaRDL1啟動子可用于棉纖維和腺毛次生代謝基因工程。
文檔編號C12N15/82GK1778925SQ200410084398
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月22日 優先權日2004年11月22日
發明者陳曉亞, 王水, 李春紅, 王凌健 申請人:中國科學院上海生命科學研究院