專利名稱：一種新型Kunin型多肽及其制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種新型Kunin型多肽，稱之為M1型Kunin型多肽(M1 type Kunin polypeptide，M1KP)。具體地說，本發明涉及M1PK的氨基酸序列和基因序列、基因密碼子優化、蛋白質表達、蛋白質純化以及功能測定。
背景技術：
Kunin蛋白家族(Kunins)是抑肽酶(aprotinin)的類似物，又稱為胰蛋白酶抑制物或Kunitz蛋白酶抑制物，常由1-3個Kunin型結構域組成。與Kunitz型蛋白酶抑制物不同的是，Kunin型蛋白僅存在于動物中。
每個Kunin型結構域大約有58個左右的氨基酸殘基，比絲氨酸蛋白酶抑制物要小許多。不同Kunin型蛋白或多肽的同源性較小，最低達20％。Kunin型蛋白最顯著的特點是其絲氨酸殘基的組成和由此形成的二硫鍵。每個Kunin型結構域均含有6個絲氨酸，組成3對二硫鍵，以保持結構的穩定性。不同的Kunin蛋白或多肽由于氨基酸殘基數量和種類的差異，絲氨酸殘基和二硫鍵的部位亦有所不同，這種序列和結構的差異導致了它們功能的區別。
目前已發現人體內存在多種Kunin型蛋白，包括雙Kunin蛋白(bikunin)、內α抑制物(inter-α-inhibitor)、前α抑制物(pre-α-inhibitor)、組織因子途徑抑制物-1(TFPI-1)和組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)等。不同的Kunin型蛋白含有數量不等的Kunin結構域，功能也有差別，甚至差別很大。例如，TFPI-1由3個串聯的Kunin結構域組成，每個Kunin結構域含有50個氨基酸殘基，結構域1抑制組織因子和因子VIIa，結構域2抑制因子Xa，結構域3與肝素及CD14結合，發揮抗凝和抗炎作用。TFPI-2的結構與TFPI-1類似，但第二結構域的氨基酸殘基數量為54個，其結構與功能的關系尚不清楚。
發明內容
本發明的目的是提供一種新型Kunin型多肽及其制備方法。所述多肽，為M1型Kunin型多肽(M1 type Kunin polypeptide，M1KP)，M1KP具有序列5的氨基酸序列，由68個氨基酸殘基組成，其中有6個半胱氨酸殘基(C)，組成3對二硫鍵。
所述6個半胱氨酸殘基組成的3對二硫鍵，其第1個半胱氨酸殘基以前的氨基酸殘基數量和最后一個半胱氨酸殘基以后的氨基酸殘基數量可以發生任何數量上的變動。
所述6個半胱氨酸殘基的位置分別是C1/14、C2/23、C3/39、C4/47、C5/60和C6/64，所述位置可以隨前13個氨基酸殘基數量的多寡而相應變化。
所述6個半胱氨酸殘基組成3對二硫鍵的配對關系是C1-C6、C2-C4和C3-C5。
本發明多肽M1KP經密碼子偏好設計后，利用PCR方法合成經過優化后的M1KP的基因片段，然后與表達載體重組，轉化相應的表達細胞，篩選高表達工程菌或工程細胞。工程菌或工程細胞經擴增，收集表達相，應用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。
所述編碼M1KP的密碼子，其中真核細胞中編碼M1KP的密碼子具有序列1的核苷酸序列，酵母中編碼M1KP的密碼子具有序列2的核苷酸序列，其它細胞中編碼M1KP的密碼子序列是能編碼相應氨基酸殘基的任何密碼子。
將本發明的M1KPcDNA片斷與表達載體重組，形成重組表達質粒。本發明所述的表達載體是原核或真核表達載體。在一優選實施方案中，本發明使用真核表達載體，例如pPIC9K等。
上述重組表達載體可按常規方法導入適宜宿主細胞。本發明所述的表達細胞是原核或真核表達細胞，能夠表達所述重組表達載體。在一優選實施方案中，本發明使用畢赤酵母菌GS115等。
本發明的表達產物以具有活性的可溶性形式存在于培養基上清中，培養基上清經超濾濃縮、分子篩、離子交換后進行純化即獲得有活性的M1KP。
本發明從人cDNA文庫中或人胎盤組織中獲取M1KP基因。為了實現M1KP的高效表達，本發明對其cDNA序列進行優化，從而實現了M1KP在不同表達系統中的高效表達。純化后的M1KP顯示出良好的抗纖溶酶、抗胰蛋白酶、抗基質金屬蛋白酶和抗惡性腫瘤侵襲轉移等作用。本發明新型kunin型多肽還可用于防止動脈粥樣硬化斑塊破裂。
以上技術方案中所有基本分子生物學操作均參照《分子克隆實驗指南》。
圖1是M1KP的二級結構，其中，共68個氨基酸殘基，方向如箭頭所指，半胱氨酸殘基的順序按C1-C6排列。
圖2是胎盤總RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3是M1KP對纖溶酶和胰蛋白酶活性的影響，M1KP明顯抑制胰蛋白酶和纖溶酶活性。
圖4顯示M1KP能夠明顯抑制MMP2和MMP9的活性。
圖5顯示M1KP明顯抑制HT-1080纖維肉瘤轉移。
具體實施例方式
實施例1 M1KP基因的獲取(1)胎盤總RNA的提取利用invitrogen公司組織RNA提取試劑提取人胎盤組織總RNA，經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳證明所提總RNA符合逆轉錄要求，結果見圖2。
(2)RT-PCR總RNA用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷做引物經MMLV逆轉錄后，PCR方法擴增M1KP的目的基因。PCR所用引物為sense primer5’-GCC GAA TTC GAT GCT GCT CAG GAG CCA ACA-3’antisense primer5’-AGG TGC GGC CGC TTA TTC TAT CCT CCA GCA AGC-3’反應條件為94℃4min，94℃30sec、46℃30sec、72℃30sec 8cycles，94℃30sec、55℃30sec、72℃30sec 22cycles，72℃7min。PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，并測序驗證PCR產物的序列，人體內M1KP的基因序列見序列表。
MMLV、oligodT購自TAKARA公司。
實施例2 M1KP基因的優化和制備(1)M1KP基因的優化及真核表達質粒rpPIC9K/M1KP的構建M1KP基因的優化方法為按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性將M1KP的cDNA進行優化改造。采用PCR方法，利用兩條長引物以野生性M1KP的cDNA為模板擴增出優化后的M1KP編碼序列。優化后的基因與真核表達載體pPIC9K重組，核苷酸序列分析證實基因序列與預期相符。
M1KP基因優化方法如下采用長引物擴增法，根據酵母密碼子使用的偏好性，合成下列兩條長引物Forward5’……GCTAGAA TTCGAT GCT GCT CAA GAA CCA ACT GGT AAT AACGCT GAG ATC TGT TTG TTG CCA TTG GAT TAC GGT CCT TGT AGA GCT CTT TTG TTGAGA TAC TAC TAC GAC AGA TA……3’；Rewards5’……ATTGCG GCC GCT TAT TCA ATT CTC CAA CAA GCA TCG TCACAA GCT TCC CAA GTG TAG AAG TTG TTA GCG TTA CCC TCA CAA CCA CCG TAC AAGAAC TGT CTG CAA GAC TGA GTG……3’上面兩條引物中劃橫線的序列為限制性內切酶EcoRI和NotI的識別位點。以野生性M1KP的cDNA序列為模板，上游引物與下游引物配對，進行PCR。PCR產物即為經過優化的M1KP的編碼基因。優化后的編碼基因經EcoRI和NotI酶切后與pPIC9K重組。
限制性內切酶購自NEB公司，大腸桿菌DH5α、質粒pPIC9K、酵母菌GS115為Invitrogen公司產品。
(2)篩選高拷貝高效表達細胞株將質粒rpPIC9KM1KP電轉化畢赤酵母GS115，使其與酵母菌染色體發生重組，G418篩選高效表達細胞株。
篩選方法按照invitrogen說明書進行。
挑取上述陽性克隆接種于10ml低營養培養基BMGY〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗中，30℃快速振遙(250 RPM)，培養過夜。次日測定光密度OD600，離心棄BMGY培液，用無菌水洗滌后用BMMY培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇，1％酵母提取物，2％蛋白胨〗稀釋至OD600＝1。每天補加體積百分數為1％的甲醇兩次，誘導培養3天，離心棄沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清與2x上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳。考馬斯亮藍R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS掃描定純度、分子量。可見誘導后上清液在分子量約8kd處有一濃集的條帶，經掃描，目的蛋白約占上清總蛋白的60％；上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進行。
(3)發酵表達工程細胞株按上述篩選高表達細胞株作為工程細胞株，然后以30L發酵罐進行高密度發酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養室100級潔凈度條件下劃YPD平板，30℃溫箱培養2-3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級潔凈度條件下接種于10ml BMGY培養液中，30℃培養過夜，此為一級種子液。再將一級種子液加入1000ml培養液中，30℃培養6-8小時，直至OD600＝6，此為二級種子液。種子菌接入后，自然擴增，待基礎培養基中預加的甘油被耗盡以后，開始補充甘油，補充速度16ml/L/h，待OD600達到120左右，停止補加甘油。待培養液中甘油全部耗盡后，開始甲醇誘導。甲醇補料速度從1ml/L/h逐漸升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發明的發酵技術是用低鹽培養基擴增工程菌，誘導前用含微量元素的甘油溶液進行補料，到達一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進行誘導表達。
甲醇誘導40h以后，停止發酵，從發酵罐中立即放出菌液進行離心，分離沉淀菌體，收集上清進行純化。發酵參數為溫度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清經Millipore超濾裝置(NMWL3000，Millipore公司)超濾濃縮至0.4L。
(5)凝膠過濾Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH6.0)平衡后，將超濾濃縮液上樣，加樣時注意勿攪動Sephadex G-50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集蛋白峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析以10倍體積的20mmol/L PB(pH6.0)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝膠過濾后收集的目的蛋白峰以50ml/min的速率將其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280達0.00，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB pH6.0)線性梯度洗脫，收集蛋白峰，分裝，冷凍干燥，-40℃保存。
(7)純度鑒定及分子量測定樣品進行15％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS掃描測定純度、分子量。同時HPLC進一步鑒定純度。所得產品純度96％以上，分子量約8kD。
實施例3 M1KP的性質測定(1)抗胰蛋白酶與纖溶酶活性測定使用發色底物法測定，方法如下。
50nM的胰蛋白酶或30nM纖溶酶在15mM Tris-HCl(pH7.4)，100mM NaCl，5mM CaCl2，0.01％Tween 80中和不同濃度的M1KP 37℃孵育15分鐘，加入終濃度為10mM的發色底物S-2251，37℃保溫，測定405nm的吸光度。根據OD405判斷剩余胰蛋白酶或纖溶酶的活性。結果見圖3，可見M1KP具有明顯的抑制胰蛋白酶和纖溶酶的活性(2)抗MMP-2和MMP-9活性的測定使用明膠酶譜法，方法如下。
配制含2mg/ml明膠的丙烯酰胺(15％)膠，乳腺癌細胞MDA-MB-435的培養基上清與2×的上樣緩沖液等體積混合后在上述丙烯酰胺膠中電泳。電泳完畢用2.5％的TritonX-100/50mM Tris-HCl，pH7.5漂洗凝膠兩次，每次30min。之后凝膠放在含不同濃度M1KP的0.15M NaCl，10mM CaCl2，50mM Tris-HCl，pH7.5，0.05％NaN3中37℃孵育16小時。取出凝膠后用SDS-PAGE染色液和脫色液分別進行染色和脫色。根據凝膠中產生的透明帶的亮度判斷培養基中剩余MMP-2和MMP-9的活性。結果見圖4，可見M1KP具有明顯的抑制MMP-2和MMP-9的作用。
(3)抗HT-1080纖維肉瘤侵襲活性的測定使用人工基底膜法測定，方法如下。200mg/filter的metrigel鋪在Transwell小孔的上層，37℃保溫使其凝固。不同濃度的M1KP溶于DMEM中，取100μL加入transwell的上層。纖維肉瘤細胞HT-1080用EDTA消化，取100μL(6×105細胞/ml)加入Transwell上層小孔中。下層加入600μL的無血清的HT-1080細胞培養液作為趨化劑。37℃培養20小時，取下小孔中的膜，用HE法染色。顯微鏡下觀察穿到膜下層的細胞數。記數18個視野中的細胞總數，取平均數比較。結果見圖5，表明M1KP具有良好的抑制纖維肉瘤侵襲的作用。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內容，本領域技術人員可最大限度地應用本發明。因此，前面的優選具體實施方案應被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
從以上描述，本領域技術人員可很容易地明了本發明的本質特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發明進行各種變更和改進。
SEQUENCE LISTING<110>復旦大學<120>一種新型Kunin型多肽及其制備方法<130>Fudan-20041116<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>207<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>1gat gct gct cag gag cca aca gga aat aac gcg gag atc tgt ctc ctg 48Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15ccc cta gac tac gga ccc tgc cgg gcc cta ctt ctc cgt tac tac tac 96Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30gac agg tac acg cag agc tgc cgc cag ttc ctg tac ggg ggc tgc gag 144Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45ggc aac gcc aac aat ttc tac acc tgg gag gct tgc gac gat gct tgc 192Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60tgg agg ata gaa taa 207Trp Arg Ile Glu65
<210>2<211>68<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu65<210>3<211>207<212>DNA<213>畢赤酵母(Pichia pastoris)<220>
<221>CDS<222>(1)..(207)<400>3gat gct gct caa gaa cca act ggt aat aac gct gag atc tgt ttg ttg 48Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15cca ttg gat tac ggt cct tgt aga gct ctt ttg ttg aga tac tac tac 96Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr
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<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu Ile Cys Leu Leu1 5 10 15Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr20 25 30Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu35 40 45Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys50 55 60Trp Arg Ile Glu6權利要求
1.一種新型kunin型多肽，命名為M1型kunin多肽，M1KP，其特征在于所述M1KP具有序列5的氨基酸序列，由68個氨基酸殘基組成，其中有6個半胱氨酸殘基(C)，組成3對二硫鍵。
2.根據權利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6個半胱氨酸殘基組成的3對二硫鍵，其第1個半胱氨酸殘基以前的氨基酸殘基數量和最后一個半胱氨酸殘基以后的氨基酸殘基數量可以發生任何數量上的變動。
3.根據權利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6個半胱氨酸殘基的位置分別是C1/14、C2/23、C3/39、C4/47、C5/60和C6/64，所述位置可以隨前13個氨基酸殘基數量的多寡而相應變化。
4.根據權利要求1所述的新型kunin型多肽，其特征在于所述6個半胱氨酸殘基組成3對二硫鍵的配對關系是C1-C6、C2-C4和C3-C5。
5.權利要求1所述的新型kunin型多肽的制備方法，其特征是包括下述步驟，M1KP經密碼子偏好設計后，利用PCR方法合成經過優化后的M1KP的基因片段，然后與表達載體重組，轉化相應的表達細胞，篩選高表達工程菌或工程細胞，工程菌或工程細胞經擴增，收集表達相，用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。
6.根據權利要求5所述的新型kunin型多肽的制備方法，其特征在于所述編碼M1KP的密碼子，其中真核細胞中編碼M1KP的密碼子具有序列1的核苷酸序列，酵母中編碼M1KP的密碼子具有序列2的核苷酸序列，其它細胞中編碼M1KP的密碼子序列是能編碼相應氨基酸殘基的任何密碼子。
7.根據權利要求5的制備方法，其中所述的表達載體是原核或真核表達載體。
8.根據權利要求5的制備方法，其中所述的表達載體是pPIC9K。
9.根據權利要求5的制備方法，其中所述的表達細胞是原核或真核表達細胞。
10.根據權利要求5的制備方法，其中所述的表達細胞是畢赤酵母GS115。
11.根據權利要求5的制備方法，其中所述的分離純化方式是超濾后，進行分子篩和離子交換層析。
12.權利要求1的新型kunin型多肽在制備抑制纖溶酶或胰蛋白酶或基質金屬蛋白酶或組織因子藥物中的用途。
13.權利要求1的新型kunin型多肽在制備抑制惡性腫瘤轉移藥物中的用途。
14.權利要求1的新型kunin型多肽在制備防止動脈粥樣硬化斑塊破裂藥物中的用途。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，具體涉及一種新型kunin型多肽，命名為M1型kunin多肽，M1KP，本發明M1KP由68個氨基酸殘基組成，其中有6個半胱氨酸殘基(C)，組成3對二硫鍵。M1KP經密碼子偏好設計后，利用PCR方法合成經過優化后的M1KP的基因片段，然后與表達載體重組，轉化相應的表達細胞，篩選高表達工程菌或工程細胞。工程菌或工程細胞經擴增，收集表達相，應用分離純化方法獲得高純度目的蛋白。獲得的M1KP具有良好的抗纖溶酶、抗胰蛋白酶、抗基質金屬蛋白酶和抗惡性腫瘤侵襲轉移等作用。
文檔編號C12N15/81GK1634986SQ200410084289
公開日2005年7月6日 申請日期2004年11月18日 優先權日2004年11月18日
發明者馬端, 孔德升, 宋后燕 申請人:復旦大學