專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備凝血酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是以動(dòng)物血液為原料制備凝血酶的方法。
背景技術(shù)：
目前國(guó)內(nèi)外主要從動(dòng)物血漿及人血漿中制備凝血酶原，再經(jīng)激活物激活而成為凝血酶。它可催化血纖維蛋白原中血纖維肽A和B的斷裂，轉(zhuǎn)變成不溶性血纖維蛋白凝塊。凝血酶在臨床上應(yīng)用廣泛，常以干粉或溶液局部涂于傷口及手術(shù)處，控制毛細(xì)血管血液滲出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙時(shí)出血等。有時(shí)也可口服，用于胃和十二指腸出血。凝血酶局部止血效果好，且無(wú)副作用。目前凝血酶的應(yīng)用范圍正日漸擴(kuò)大，由單純的局部外敷發(fā)展到外科手術(shù)、耳鼻喉、口腔、婦產(chǎn)、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作為多種外用止血藥物的重要原料，其止血效果優(yōu)于“對(duì)氨基苯甲酸”、“止血環(huán)酸”、“止血敏”等通過(guò)注射后須經(jīng)血管收縮而起止血作用的藥物。
凝血酶是一種蛋白質(zhì)，其制備方法一般包括三個(gè)基本步驟，即提取、純化和凍干(或制劑)。我國(guó)專(zhuān)利ZL92112188、ZL93110426和ZL96103650分別提出了從豬血或者牛血中提取凝血酶的方法，但這些方法都存在著工藝流程復(fù)雜、生產(chǎn)周期長(zhǎng)和收率低等問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝流程簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短和收率高的制備凝血酶的方法。
本發(fā)明制備凝血酶的方法包括以下幾個(gè)步驟(1)、向血液中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血漿；(2)、將收集所得的上清抗凝血漿上陰離子層析柱層析，用洗脫劑對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫液即為凝血酶原溶液；(3)、如洗脫劑中使用了檸檬酸三鈉，在進(jìn)行活化之前對(duì)凝血酶原溶液進(jìn)行超濾脫鹽；(4)、在常溫常壓下活化凝血酶原，得凝血酶溶液；(5)、將凝血酶溶液進(jìn)行超濾濃縮，得凝血酶濃縮液；(6)、將凝血酶濃縮液凍干，即得白色的粉狀凝血酶成品。
本發(fā)明制備凝血酶的方法中，所述的血液是豬血、牛血等動(dòng)物血液或人血液。
所述抗凝劑可以是檸檬酸三鈉溶液或者草酸鉀溶液。使用檸檬酸三鈉抗凝劑，濃度為0.109mol/L的檸檬酸三鈉溶液與血液的體積比為1∶7-1∶9。使用草酸鉀抗凝劑，濃度為0.125mol/L的草酸鉀溶液與血液的體積比為1∶7-1∶9。
所述的洗脫劑可以是pH值為6-9的氨基酸或者檸檬酸三鈉溶液。氨基酸或者檸檬酸三鈉溶液的濃度是0.01-0.3mol/L。所述的洗脫劑也可以是調(diào)節(jié)pH值為6-9，以氨基酸為保護(hù)劑，以檸檬酸三鈉溶液為緩沖液，以氯化鈉或者其它無(wú)機(jī)鹽為離子增強(qiáng)劑組成的混合溶液。
所述的活化凝血酶原，是使用CaCl2為活化劑，直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，在常溫常壓下活化1-3小時(shí)得凝血酶溶液。加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca2+的終濃度為0.05-0.15mol/L。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、本發(fā)明提供的凝血酶提取純化方法在常溫常壓下進(jìn)行；2、凝血酶提取效率高。一般每升血漿能提取5萬(wàn)IU以上的凝血酶產(chǎn)品；3、操作簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制。工藝僅需5～6個(gè)步驟，包括離心、上樣層析、超濾脫鹽、活化、超濾濃縮和凍干等幾個(gè)步驟，這些過(guò)程均易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制；4、本發(fā)明環(huán)保。工藝徹底摒棄了以往的有機(jī)溶劑提純方法，操作過(guò)程中對(duì)人員和周?chē)h(huán)境不產(chǎn)生危害，工藝末段采取了適當(dāng)?shù)膹U物處理措施，廢物排放符合國(guó)家的環(huán)保要求；5、工藝周期短，整個(gè)工藝生產(chǎn)僅需3天(包括凍干)左右。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 采集羊血液2800ml，加入0.109mol/L的檸檬酸三鈉抗凝劑400ml，離心分離。取上清抗凝血漿1000ml。將上述血漿上已平衡好的陰離子層析柱，用調(diào)節(jié)pH為8，濃度為0.2mol/L的氨基酸洗脫劑對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，得凝血酶原的洗脫液883.2ml，加入1mol/L的CaCl2溶液76.8ml，使得凝血酶原溶液中Ca2+的終濃度為0.08mol/L，常溫常壓下活化凝血酶原3小時(shí)，得凝血酶溶液960ml，標(biāo)記為A1。采用超濾機(jī)對(duì)凝血酶溶液進(jìn)行濃縮，濃縮約5倍左右，得凝血酶濃液190ml。凍干上述凝血酶濃液，即得白色的粉狀凝血酶成品。
實(shí)施例2采集豬血液4300ml，加入0.109mol/L的檸檬酸三鈉抗凝劑500ml，離心分離。取上清抗凝血漿1000ml。將上述血漿上已平衡好的陰離子層析柱，用調(diào)節(jié)pH為7，濃度為0.1mol/L的檸檬酸三鈉洗脫劑對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，得凝血酶原的洗脫液1590ml。對(duì)洗脫液進(jìn)行超濾脫鹽，得到凝血酶原溶液1832.1ml。加入1mol/L的CaCl2溶液137.9ml，使得凝血酶原溶液中Ca2+的終濃度為0.07mol/L，常溫常壓下活化凝血酶原3小時(shí)，得凝血酶溶液1970ml，標(biāo)記為A2。采用超濾機(jī)對(duì)凝血酶溶液進(jìn)行濃縮，濃縮約9倍左右，得凝血酶濃液200ml。凍干上述凝血酶濃液，即得白色的粉狀凝血酶成品。
實(shí)施例3采集牛血液3200ml，加入0.125mol/L的草酸鉀溶液抗凝劑400ml，離心分離。取上清抗凝血漿1500ml。將上述血漿上已平衡好的陰離子層析柱，采用以檸檬酸三鈉為緩沖液，以氨基酸為保護(hù)劑，以氯化鈉為離子增強(qiáng)劑等所組成的洗脫劑，調(diào)節(jié)pH為7，對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，得凝血酶原的洗脫液1146ml。對(duì)洗脫液進(jìn)行超濾脫鹽，得到凝血酶原溶液1440ml。加入1mol/L的CaCl2溶液160ml，使得凝血酶原溶液中Ca2+的終濃度為0.1mol/L，常溫常壓下活化凝血酶原3小時(shí)，得凝血酶溶液1600ml，標(biāo)記為A3。采用超濾機(jī)對(duì)凝血酶溶液進(jìn)行濃縮，濃縮約8倍，得凝血酶濃液200ml。凍干上述凝血酶濃液，即得白色的粉狀凝血酶成品。
實(shí)施例4 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2000版二部第1056～1057頁(yè)的有關(guān)凝血酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)上述凝血酶產(chǎn)品A1、A2和A3進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，采用紫外260nm/280nm檢測(cè)法進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。根據(jù)凝血酶效價(jià)檢測(cè)結(jié)果以及相應(yīng)的蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算凝血酶比活和得率(IU/L血漿)，其結(jié)果如下表所示。
凝血酶質(zhì)量檢測(cè)及分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種制備凝血酶的方法，該方法包括以下幾個(gè)步驟(1)、向血液中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血漿；(2)、將收集所得的上清抗凝血漿上陰離子層析柱層析，用洗脫劑對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，洗脫液即為凝血酶原溶液；(3)、如洗脫劑中使用了檸檬酸三鈉，在進(jìn)行活化之前對(duì)凝血酶原溶液進(jìn)行超濾脫鹽；(4)、在常溫常壓下活化凝血酶原，得凝血酶溶液；(5)、將凝血酶溶液進(jìn)行超濾濃縮，得凝血酶濃縮液；(6)、將凝血酶濃縮液凍干，即得白色的粉狀凝血酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備凝血酶的方法，其特征在于所述的血液是豬血、牛血等動(dòng)物血液或人血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備凝血酶的方法，其特征在于所述抗凝劑是檸檬酸三鈉或者草酸鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備凝血酶的方法，其特征在于使用檸檬酸三鈉抗凝劑，濃度為0.109mol/L的檸檬酸三鈉溶液與血液的體積比為1∶7-1∶9。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備凝血酶的方法，其特征在于使用草酸鉀抗凝劑，濃度為0.125mol/L的草酸鉀溶液與血液的體積比為1∶7-1∶9。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備凝血酶的方法，其特征在于所述的洗脫劑是pH值為6-9的氨基酸或者檸檬酸三鈉溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備凝血酶的方法，其特征在于氨基酸或者檸檬酸三鈉溶液的濃度是0.01-0.3mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備凝血酶的方法，其特征在于所述的洗脫劑是調(diào)節(jié)pH值為6-9，以氨基酸為保護(hù)劑，以檸檬酸三鈉溶液為緩沖液，以氯化鈉或者其它無(wú)機(jī)鹽為離子增強(qiáng)劑組成的混合溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備凝血酶的方法，其特征在于所述的活化凝血酶原，是使用CaCl2為活化劑，直接向凝血酶原溶液中加入CaCl2溶液，在常溫常壓下活化1-3小時(shí)得凝血酶溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備凝血酶的方法，其特征在于加入CaCl2溶液后的凝血酶原溶液中所含Ca2+的終濃度為0.05-0.15mol/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從動(dòng)物血液以及人血液中提取凝血酶的方法。該方法是利用層析介質(zhì)從血漿中吸附凝血酶原，對(duì)層析柱進(jìn)行洗脫，活化凝血酶原，得凝血酶溶液，經(jīng)超濾濃縮，最后凍干得凝血酶成品。該方法在常溫常壓下進(jìn)行，工藝環(huán)保，生產(chǎn)周期短，凝血酶提取效率高，一般每升血漿能提取5萬(wàn)IU以上的凝血酶產(chǎn)品；操作簡(jiǎn)單，本發(fā)明僅需離心、上樣層析、超濾和凍干等幾個(gè)步驟，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/74GK1587401SQ20041007475
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者王永成, 黃耀江, 裴靖, 荊強(qiáng) 申請(qǐng)人:黃耀江