專利名稱：運用聚合酶鏈式反應技術檢測坂崎腸桿菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌檢驗技術，具體地說是運用PCR反應來檢測致病細菌，特別是坂崎腸桿菌的技術。
背景技術：
坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是革蘭氏陰性細菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬。1980年被命名為坂崎腸桿菌前，該菌被稱為產黃色素陰溝腸桿菌。它是臨床上很少見的病原菌，其引起的腦膜炎、敗血癥、壞死性小腸結腸炎在全世界范圍內均有報告，并有不斷增多的趨勢，大多數病例發生在嬰幼兒，而且病程短，有時病死率可達80％。雖然坂崎腸桿菌的傳染源不很清楚，但嬰兒配方奶粉起到了傳播媒介的作用。2002年11月26日國家質檢總局發布2002年第120號公告，其主要內容是暫停辦理美國惠氏公司生產的某些批號的配方奶粉的報檢通關和相關的檢驗檢疫手續，對已進口的相關產品進行監督銷毀處理，原因是美國食品與藥品管理局(FDA)在上述產品中檢出坂崎腸桿菌。
目前我國尚沒有食品中和臨床上檢測坂崎腸桿菌的標準方法，美國FDA 2002年8月發布的坂崎腸桿菌分離計數方法，依然沿用了“三管”增菌法檢測坂崎腸桿菌。其不足之處是需要經過前增菌、分離培養、生化鑒定等經典的檢驗方法檢測目標菌，不僅試驗時間長，而且靈敏度和特異性都相對較低。
發明內容
針對上述情況，本發明克服了現有技術中的缺點，提供一種運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的方法。本發明包括用新發現的坂崎腸桿菌種特異性DNA序列，其序列如下序列一CACCATGGGTAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCTGCAAGATACAACCCCGCGTGCTCACACACATTGTCTGATAGAAAGTAAAGAAGCAAAACCTCTACAGGCTTGTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGTGGTTCAAGTCCACTCAGGCCTACCAACTCCGCAGGAGTTGAAGAGGTTTAACTACGATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCTGCGGTTCGATCCCGCATAGCTCCACCATCACTTCGGAGTGTACTCAGTGAGTATACTGCGAAGTATTTGCTCTTTAACAATCCGGAACAAGCTGAAAATTGAAACAGACACGCTGCTGTATTTCTCCGTAATCAGGAATGCGCGGTGTGTCAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGACTTCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGAACAAGCGTACACGGTGGATGCCCTGGCAGTCAGAGGCGATGAAGGACGTGCTAATCTGCGAAAAGCGCCGGTAAGGTGATATGAACCGTTATAACCGGCGATTTCCGAACGGGGGGTACCCAA序列二GGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCTGCAAGATACAACCTCGCGTGCTCACACAGATTGTCTGATAGAAAGTAAAGAAGCAGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAAGGGACGCCACCTGCTGGTAATGAGTGAAAGGCGTTACCGATTAATATCTCAAAACTGACTGTAAAGTCACGTTTGAGATATTTGCTCTTTAACAATCCGGAACAAGCTGAAAATTGAAACAGACACGCTGCTGCATTTCTCCGTAATAAGGAATGCGCGGTGTGTCAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGACTTCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGAACAAGCGTACACGGTGGATGCCCTGGCAGTCAGAGGCGATGAAGGACGTGCTAATCTGCGAAAAGCGCCGGTAAGGTGATATGAACCGTTATAACCGGCGATTTCCGAACGGGGGGACCCAAA本發明還包括所設計篩選的四條特異性寡核苷酸引物，其序列如下第一對引物序列一GCAGGAGTTGAAGACCAAAT序列二GTGCTGCGAGTTTGAGTCTGAG第二對引物序列三GGGTTGTCTGCGAATCGCTT序列四GTCTTCGTGCTGCGTCAAAC以及由上述四條引物衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。
還包括與之配套的PCR反應條件。本發明填補了通過DNA分析檢測坂崎腸桿菌的空白。
本發明是通過以下技術方案實現的(1)擴增坂崎腸桿菌的16s和23s rRNA基因間的DNA片段，進行核苷酸序列測定；(2)設計特異性寡核苷酸引物，用于PCR檢測；(3)將該寡核苷酸序列作為引物，以坂崎腸桿菌基因組DNA為模板，進行目的DNA片段的特異性擴增；(4)擴增產物用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳，然后用溴化乙錠染色；(5)電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段，用序列一、序列二擴增可得到250bp的特異片段，用序列三、序列四擴增可得到280bp的特異片段。
本發明用坂崎腸桿菌DNA序列的特異性引物通過PCR方法產生特異性片段，在已試驗的30種不同種或同種的其它致病細菌中均未發現假陽性結果。
本發明中PCR反應體系中各組分構成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列二 10μmol/L2μLdNTPs 每種10mmol/L 0.5μLDNA樣品 2μL雙蒸水 33.2μL總體積 50μLPCR方法中擴增程序為(1)95℃ 10分鐘(2)95℃ 30秒(3)50℃至61℃間的某一特定溫度 20秒(4)72℃ 30秒(5)95℃ 30秒，重復25次(6)72℃ 2分鐘。
其PCR產物的檢驗方法如下(1)對擴增產物用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色。
(2)電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段。
與現有技術相比，本發明的有益效果是基于DNA的鑒定方法適用于直接從患者含菌體液、食品和體液培養物等臨床樣品中用PCR方法擴增靶DNA，從而檢測坂崎腸桿菌。PCR方法具有檢測準確、特異性強的特點，可以快速、準確地鑒定特異的目標細菌。用PCR的方法擴增細菌靶基因，避免了反復培養，節約時間；PCR鑒定方法不受培養條件和細菌生理狀態的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。
圖1某進口品牌嬰兒配方奶粉的PCR擴增產物圖2某品牌出口魚肉粉的PCR擴增產物圖3某品牌奶粉的PCR擴增產物圖4坂崎腸桿菌和其它細菌的對照實驗具體實施方式
下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細描述。
實施例1樣本某進口品牌嬰兒配方奶粉。用常規生理、生化方法檢測出坂崎腸桿菌疑似菌落，然后進行如下PCR方法檢測1.DNA抽提取增菌液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，補加TE緩沖液500μL，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，12000轉/分鐘，離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴增(1)PCR反應混合物成分成分濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L 2μL引物序列二 10μmol/L 2μLdNTPs 每種10mmol/L 0.5μLDNA樣品2μL雙蒸水 33.2μL總體積 50μL(2)PCR方法中擴增程序(1)95℃ 10分鐘(2)95℃ 30秒(3)51℃ 20秒(4)72℃ 30秒(5)95℃ 30秒，重復29次(6)72℃ 2分鐘。
3.被檢測樣品目的PCR擴增和電泳檢驗PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段，其中以序列一和序列二為引物擴增可得到250bp的特異片段，結果如圖1。
圖1中的各個泳道分別是
1.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC12868；2.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29004；3.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29544；4.分子量標準；5.待測樣品fps3；6.陰性對照；實驗表明樣品中含有坂崎腸桿菌。
2天后，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落98％為坂崎腸桿菌，其中一個菌株命名為fps3。PCR檢驗結果與生化檢測結果一致。
實施例2樣本某品牌出口魚肉粉，用常規生理、生化方法檢測出坂崎腸桿菌疑似菌落，然后進行PCR方法檢測1.DNA抽提取增菌液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，補加TE緩沖液500μL，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，12000轉/分鐘，離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴增(1)PCR反應混合物成分成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列三10μmol/L2μL引物序列四10μmol/L2μLdNTPs 每種10mmol/L 0.5μLDNA樣品2μL雙蒸水 33.2μL總體積 50μL(2)PCR方法中擴增程序(1)95℃ 10分鐘(2)95℃ 30秒
(3)57℃20秒(4)72℃30秒(5)95℃30秒，重復25次(6)72℃2分鐘。
3.被檢測樣品的PCR擴增和電泳檢驗將PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段，其中以序列三和序列四為引物擴增可得到280bp的特異DNA片段，結果如圖2。
圖2中各個泳道分別是1.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC12868；2.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29004；3.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29544；4.分子量標準；5.待測樣品fs3；6.陰性對照；實驗表明樣品中含有坂崎腸桿菌。
2天后，通過常規微生物培養和生化檢測證明，所檢驗的目的菌落98％為坂崎腸桿菌，其中一個菌株命名為fs3。PCR檢驗結果與生化檢測結果一致。
實施例3樣品某品牌奶粉，用常規生理、生化方法初篩檢測出坂崎腸桿菌疑似菌落，然后進行PCR方法檢測1.DNA抽提取增菌液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，補加TE緩沖液500μL，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚(pH8.0)，強烈振蕩，12000轉/分鐘，離心3分鐘，取上清液，重復酚抽提。取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加70％冷乙醇洗滌一次，室溫下12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，加入50μL TE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴增(1)PCR反應混合物成分成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL
引物序列三10μmol/L2μL引物序列四10μmol/L2μLdNTPs 每種10mmol/L 0.5μLDNA樣品2μL雙蒸水 33.2μL總體積 50μL(2)PCR方法中擴增程序(1)95℃10分鐘(2)95℃30秒(3)61℃20秒(4)72℃30秒(5)95℃30秒，重復25次(6)72℃2分鐘。
3.被檢測樣品的PCR擴增和電泳檢驗將PCR產物在0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色。電泳結果在紫外分析儀下觀察，未發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段，結果如圖3。
圖3中的各個泳道分別是1.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC12868；2.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29004；3.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29544；4.分子量標準；5.待測樣品dot1；6.陰性對照；表明樣品中不含坂崎腸桿菌。
2天后，經常規微生物培養和生化檢測表明，所檢驗目的菌落100％為團聚腸桿菌，其中一個菌株命名為dot1。這表明PCR檢驗的陰性結果是可信的。
實施例4樣品坂崎腸桿菌標準菌株ATCC12868，坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29004，坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29544，坂崎腸桿菌野生菌株fps3，坂崎腸桿菌野生菌株fs3，坂崎腸桿菌野生菌株ds1，坂崎腸桿菌野生菌株dps6；陰性對照菌為產氣腸桿菌、團聚腸桿菌、陰溝腸桿菌、蜂房哈夫尼亞氏菌、普通變形桿菌、奇異變形桿菌、宋內氏志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、河流弧菌、副溶血弧菌、大腸桿菌和大腸桿菌O157 H7株。
模板DNA提取，PCR擴增方法和引物，以及PCR產物的電泳觀察，同實施例3。結果表明，所有坂崎腸桿菌菌株都能擴增出280bp的DNA片段，而非坂崎腸桿菌菌株都不能擴增出280bp的DNA片段。見圖4。
圖4中的各個泳道分別是1.分子量標準；2.陰性對照；3.產氣腸桿菌；4.團聚腸桿菌；5.陰溝腸桿菌；6.蜂房哈夫尼亞氏菌；7.普通變形桿菌；8.奇異變形桿菌；9.宋內氏志賀氏菌；10.腸炎沙門氏菌；11.河流弧菌；12.分子量標準；13.副溶血弧菌；14.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC12868；15.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29004；16.坂崎腸桿菌標準菌株ATCC29544；17.坂崎腸桿菌野生菌株fps3；18.坂崎腸桿菌野生菌株fs3；19.坂崎腸桿菌野生菌株ds1；20.坂崎腸桿菌野生菌株dps6；21.大腸桿菌；22.大腸桿菌O157 H7株；以上結果證明用本發明進行坂崎腸桿菌PCR目的基因擴增法檢驗結果是可靠的。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南開大學<120>運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法<130>041016<160>6
<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>690<212>DNA<213>坂崎腸桿菌<220>
<221>rRNA<222>(1)..(690)<400>1caccatgggt agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 60actttgtgat tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta accgtagggg aacctgcggt120tggatcacct ccttacctgc aagatacaac cccgcgtgct cacacacatt gtctgataga180aagtaaagaa gcaaaacctc tacaggcttg tagctcaggt ggttagagcg cacccctgat240aagggtgagg tcggtggttc aagtccactc aggcctacca actccgcagg agttgaagag300gtttaactac gatggggcta tagctcagct gggagagcgc ctgctttgca cgcaggaggt360ctgcggttcg atcccgcata gctccaccat cacttcggag tgtactcagt gagtatactg420cgaagtattt gctctttaac aatccggaac aagctgaaaa ttgaaacaga cacgctgctg480tatttctccg taatcaggaa tgcgcggtgt gtcagagtct ctcaaactcg cagcacgaag540acttcttcgg gttgtgaggt taagcgaaca agcgtacacg gtggatgccc tggcagtcag600aggcgatgaa ggacgtgcta atctgcgaaa agcgccggta aggtgatatg aaccgttata660accggcgatt tccgaacggg gggtacccaa 690<210>2<211>615<212>DNA<213>坂崎腸桿菌<220>
<221>rRNA
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<220>
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<221>primer_bind<222>(1)..(20)<400>6gtcttcgtgc tgcgtcaaac 20
權利要求
1.一種運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，用PCR技術擴增出的兩條包含坂崎腸桿菌所特有的DNA序列如下序列一CACCATGGGTAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCTGCAAGATACAACCCCGCGTGCTCACACACATTGTCTGATAGAAAGTAAAGAAGCAAAACCTCTACAGGCTTGTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGTGGTTCAAGTCCACTCAGGCCTACCAACTCCGCAGGAGTTGAAGAGGTTTAACTACGATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCTGCGGTTCGATCCCGCATAGCTCCACCATCACTTCGGAGTGTACTCAGTGAGTATACTGCGAAGTATTTGCTCTTTAACAATCCGGAACAAGCTGAAAATTGAAACAGACACGCTGCTGTATTTCTCCGTAATCAGGAATGCGCGGTGTGTCAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGACTTCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGAACAAGCGTACACGGTGGATGCCCTGGCAGTCAGAGGCGATGAAGGACGTGCTAATCTGCGAAAAGCGCCGGTAAGGTGATATGAACCGTTATAACCGGCGATTTCCGAACGGGGGGTACCCAA序列二GGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCTGCAAGATACAACCTCGCGTGCTCACACAGATTGTCTGATAGAAAGTAAAGAAGCAGGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAAGGGACGCCACCTGCTGGTAATGAGTGAAAGGCGTTACCGATTAATATCTCAAAACTGACTGTAAAGTCACGTTTGAGATATTTGCTCTTTAACAATCCGGAACAAGCTGAAAATTGAAACAGACACGCTGCTGCATTTCTCCGTAATAAGGAATGCGCGGTGTGTCAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGACTTCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGAACAAGCGTACACGGTGGATGCCCTGGCAGTCAGAGGCGATGAAGGACGTGCTAATCTGCGAAAAGCGCCGGTAAGGTGATATGAACCGTTATAACCGGCGATTTCCGAACGGGGGGACCCAAA
2.根據權利要求1所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，用PCR技術擴增出的兩條坂崎腸桿菌DNA序列，從中選取任何為坂崎腸桿菌菌種所特有的序列，還包括由上述序列衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。
3.根據權利要求1所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)擴增坂崎腸桿菌的16s和23srRNA基因間的DNA片段，進行核苷酸序列測定；(2)設計特異性寡核苷酸引物，用于PCR檢測；(3)將該寡核苷酸序列作為引物，以坂崎腸桿菌基因組DNA為模板，進行目的DNA片段的特異性擴增；(4)擴增產物用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳，然后用溴化乙錠染色；(5)電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段。
4.根據權利要求3所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，所設計的特異性寡核苷酸引物序列如下第一對引物序列一GCAGGAGTTGAAGACCAAAT序列二GTGCTGCGAGTTTGAGTCTGAG第二對引物序列三GGGTTGTCTGCGAATCGCTT序列四GTCTTCGTGCTGCGTCAAAC
5.根據權利要求4所設計的特異性寡核苷酸引物序列，其特征在于，還包括由上述四條引物衍生出來的、差別不大于8個堿基的寡核苷酸序列以及每個序列的反義互補序列，或它們的變體，或它們的部分序列。
6.根據權利要求3所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，PCR反應體系中各組分構成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL 0.3μL引物序列一 10μmol/L2μL引物序列二 10μmol/L2μLdNTPs 每種10mmol/L 0.5μLDNA樣品 2μL雙蒸水 33.2μL總體積 50μL
7.根據權利要求3所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，PCR方法中擴增程序為(1)95℃10分鐘(2)95℃30秒(3)50℃至61℃間的某一溫度 20秒(4)72℃30秒(5)95℃30秒，重復25次(6)72℃2分鐘
8.根據權利要求7所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，PCR方法中擴增程序為(1)95℃10分鐘(2)95℃30秒(3)57℃20秒(4)72℃30秒(5)95℃30秒，重復25次(6)72℃2分鐘
9.根據權利要求3所述的運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌的方法，其特征在于，其PCR產物熒光檢驗方法如下(1)對擴增產物用0.8％瓊脂糖凝膠進行電泳后用溴化乙錠染色。(2)電泳結果在紫外分析儀下觀察，可發現對坂崎腸桿菌進行特異性擴增產生的DNA片段。
全文摘要
本發明公開了一種運用PCR技術檢測坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的方法，屬于細菌檢驗技術，特別是運用PCR反應來檢測致病細菌的技術。其技術方案是利用新發現的坂崎腸桿菌種特異性DNA序列，用生物信息學方法設計特異性引物，用PCR方法直接從樣本中擴增細菌靶基因。本發明包括新發現的坂崎腸桿菌種特異性DNA序列和由此設計篩選的PCR引物的四條寡核苷酸序列以及與之配套的PCR反應條件。本發明解決了從食品和臨床樣本中檢測坂崎腸桿菌的標準方法的問題。它用PCR的方法擴增細菌靶基因，省去了細菌培養篩選環節，節約時間；而且不受培養條件和細菌生理狀態的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。
文檔編號C12Q1/68GK1664112SQ20041007270
公開日2005年9月7日 申請日期2004年11月11日 優先權日2004年11月11日
發明者黃熙泰, 高旗立, 劉寅, 張霞, 侯艷梅 申請人:南開大學, 中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局