專利名稱：離子鈣含量測定方法及離子鈣診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種離子鈣含量測定方法，同時本發明還涉及用以實現該方法的離子鈣診斷試劑盒，屬于醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
總鈣的測定方法很多，概括起來有滴定法(包括氧化還原滴定法、絡合滴定法)，比色法(最常用又便于自動化操作的有鄰甲酚酞絡合酮法、甲基麝香草酚藍法、偶氮胂III法等)，火焰光度法、原子吸收分光光度法、同位素稀釋質譜法。國際臨床化學聯合會(IFCC)推薦的鈣測定決定性方法為同位素稀釋質譜法(IDMS)，參考方法為原子吸收分光光度法。世界衛生組織(WHO)推薦的中等實驗室用的常規方法為鄰甲酚酞絡合酮法(O-CPC)。
血清離子鈣亦稱游離鈣，是具有生理活性的鈣。它比總鈣更能反映機體內鈣的代謝狀態，對疾病具有更高的診斷價值(1)離子鈣的測定對較大的外科手術意義重大，如開胸的心臟手術，肝移植及其他需大量輸入檸檬酸鹽抗凝血的手術或術后膿毒血癥。反復測定總鈣已經沒有什么意義，而離子鈣對指導這些病人的正確治療非常重要。(2)當懷疑有新生兒患低鈣血癥時，應測定離子鈣，如果出現并發癥，更有必要經常測定。(3)腎臟疾病腎移植病人，或進行血液透析的病人，鈣代謝經常改變而且有時很激烈。因此在做血透時維持輕微的正鈣平衡對保持良好的心臟功能是重要的，而離子鈣的測定是對此監測的最好的手段。(4)原發性甲狀旁腺功能亢進的病人，90％以上的病例離子鈣升高，甲狀旁腺功能減退者離子鈣顯著偏低。
目前離子鈣的主要測定方法大致有酶比色法、生物學法、透析法、超濾法、金屬指示劑法、離子選擇性電極法。以前，受限于技術上的原因，離子鈣的測定僅限于少數研究部門，臨床實際應用很少。最近十年來的研究開發，提出采用鈣—汞合金電極的鈣離子選擇性電極法。此方法簡便、迅速、重復性好，正確和敏感性高。測定結果不受血漿蛋白質的影響，能反映機體鈣代謝的實際情況。但是成本高昂。而酶比色法測定離子鈣——比離子選擇性電極法更簡便、更迅速、更經濟、特異性專一及成本更低廉等特點。結合我國的具體實際，應以酶法測定較為實用。
檢索中國專利僅發現申請號為03131931.9、申請日為2003.06.19名稱為《三抗法快速定量測定心肌肌鈣蛋白I》之類的專利，而測定心肌肌鈣蛋白與測定鈣離子無關。這從一個側面說明，我國此方面的研究還比較欠缺。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種可以克服以上現有技術缺點的離子鈣診斷試劑盒，采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀上進行離子鈣含量測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。同時本發明還提出相應的離子鈣含量的測定方法。
本發明測定離子鈣含量的步驟如下1)、將樣品與主要由磷脂、乙醇、氧化型輔酶、磷脂酶(需鈣離子激活)、膽堿氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發生如下原理的反應磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+膽堿膽堿+2氧+水膽堿氧化酶甜菜堿+2過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應物在主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出離子鈣含量的大小。
通常步驟2)將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出離子鈣含量的大小。
以上樣品與試劑的混合比例按體積為1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規的20℃到50℃范圍，反應時間控制在常規的2-30分鐘。
本發明應用磷脂酶(一種需要鈣離子激活的酶)偶聯膽堿氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等反應比色法。最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因為還原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映離子鈣含量的大小。這個酶偶聯反應系統的優點有一、它利用測量氧化型輔酶被還原成還原性輔酶的生成量來反映離子鈣含量，氧化型輔酶在溶液中的穩定性比還原性輔酶高很多，因此這個系統的穩定性很好。
用于實現本發明方法的離子鈣診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40——200mmol/l磷脂 1——50mmol/l乙醇 1——30mmol/l氧化型輔酶 0.5——20mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 5000——500000U/l膽堿氧化酶 500——50000U/l過氧化氫酶 500——50000U/l
醛脫氫酶 500——50000U/l穩定劑 10——80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑，更有利于消除內、外源膽堿污染試劑I緩沖液 40——200mmol/l乙醇 1——30mmol/l氧化型輔酶 0.5——20mmol/l膽堿氧化酶 500——50000U/l過氧化氫酶 500——50000U/l醛脫氫酶 500——50000U/l穩定劑 10——80％(總體積)試劑II緩沖液 40——200mmol/l磷脂 1——50mmo l/l磷脂酶(需鈣離子) 5000——500000U/l穩定劑 10——80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，試劑II其中的成分，磷脂或磷脂酶等可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不在此一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑，不但更有利于消除內、外源膽堿污染，還更有利于試劑的穩定試劑I緩沖液 40——200mmol/l乙醇 1——30mmol/l氧化型輔酶 0.5——20mmol/l
穩定劑 10——50mmol/l試劑II緩沖液 40——200mmol/l膽堿氧化酶 500——50000U/l過氧化氫酶 500——50000U/l醛脫氫酶 500——50000U/l穩定劑 10——80％(總體積)試劑III緩沖液 40——200mmol/l磷脂 1——50mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 5000——500000U/l穩定劑 10——80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，乙醇、氧化型輔酶等可以放在試劑II中。試劑II其中的成分，膽堿氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等也可以放在試劑I中，試劑III其中的成分，磷脂或磷脂酶等也可以放在試劑I或試劑II中，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑的pH范圍可以是6.0～11.0。緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液、咪唑(Imidazole)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等，但不僅限于這些緩沖液。
以上氧化型輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+等氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩定性，以便長期儲存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩定劑10～80％或者10～50mmol/l，穩定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關系的本發明離子鈣診斷試劑盒較為理想緩沖液 80——120mmol/l磷脂 4——10mmol/l乙醇 2——10mmol/l氧化型輔酶 1——5mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 12000——100000U/l膽堿氧化酶 1000——10000U/l過氧化氫酶 1000——10000U/l醛脫氫酶 1000——10000U/l穩定劑 20——50％(總體積)由于本發明是完全利用酶學方法，酶解反應具有特異性高的特點，不易受到內、外源其他物質的干擾。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應的特異性促使測試結果精確。酶解反應都是在緩沖液條件下進行，沒有污染環境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準確性，更便于推廣應用。
此外，本發明的顯著特色之一是可以消除內、外源膽堿的污染，消除內、外源膽堿的作用發生在整個反應時間段的前半部分，在后半段時間受污染的內、外源膽堿已經被消耗殆盡，而在后半段時間測試離子鈣含量所需要的膽堿都是產生于離子鈣的含量。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一(單劑)本實施例的離子鈣診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l磷脂 4mmol/l乙醇 2mmol/l氧化型輔酶 1mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 12000U/l膽堿氧化酶 1000U/l過氧化氫酶 1000U/l醛脫氫酶 1000U/l穩定劑 50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發生以下反應磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+膽堿膽堿+2氧+水膽堿氧化酶甜菜堿+2過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出離子鈣的含量。
本實施例應用磷脂酶(一種需要鈣離子激活的酶)偶聯膽堿氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶等反應比色法。最終將氧化型輔酶還原成還原性輔酶，因為還原性輔酶在波長340nm有吸收峰，因此測試波長340nm吸收峰的增加程度可以直接反映離子鈣含量的大小。這個酶偶聯反應系統的優點有一、它利用測量氧化型輔酶被還原成還原性輔酶的生成量來反映離子鈣含量，氧化型輔酶在溶液中的穩定性比還原性輔酶高很多，因此這個系統的穩定性很好。
實施例二(雙劑)本實施例的離子鈣診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l乙醇 6mmol/l氧化型輔酶 3mmol/l膽堿氧化酶 5500U/l過氧化氫酶 5500U/l醛脫氫酶 5500U/l穩定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l磷脂 7mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 60000U/l穩定劑 50％(總體積)測定離子鈣含量時，溫度控制在30℃，反應時間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
具體測定步驟為磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+膽堿膽堿+2氧+水膽堿氧化酶甜菜堿+2過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出離子鈣的含量。
各反應步驟的反應時間控制在15分鐘。
實施例三(三劑)本實施例的離子鈣診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l乙醇 10mmol/l氧化型輔酶 5mmol/l穩定劑 20mmol/l試劑II緩沖液 120mmol/l膽堿氧化酶 10000U/l過氧化氫酶 10000U/l醛脫氫酶 10000U/l穩定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l磷脂 10mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 100000U/l穩定劑 50％(總體積)在全自動生化分析儀上設定溫度25℃，反應時間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
具體測定步驟為磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+膽堿膽堿+2氧+水膽堿氧化酶甜菜堿+2過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出離子鈣的含量。
各反應步驟的反應時間控制在20分鐘。
實施例四本實施例的離子鈣診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l磷脂 5mmol/l乙醇 5mmol/l氧化型輔酶 2mmol/l膽堿氧化酶 8000U/l過氧化氫酶 8000U/l醛脫氫酶 8000U/l穩定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 20000U/l穩定劑 50％(總體積)
在生化分析儀上設定溫度37℃，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測離子鈣樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應。
加入樣品和試劑后，使之混合，發生以下反應磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+膽堿膽堿+2氧+水膽堿氧化酶甜菜堿+2過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子將最終反應物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度上升的幅度，從而測算出離子鈣的含量。
總之，實驗證明，采用本發明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內、外源物質的污染。
權利要求
1.一種離子鈣含量測定方法，步驟如下1)、將樣品與主要由磷脂、乙醇、氧化型輔酶、磷脂酶(需鈣離子激活)、膽堿氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成的試劑混合，使之發生如下原理的反應磷脂+水磷脂酶-D/Ca++磷脂酸+膽堿膽堿+2氧+水膽堿氧化酶甜菜堿+2過氧化氫過氧化氫+乙醇過氧化氫酶乙醛+水乙醛+氧化型輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原性輔酶+氫離子2)、檢測最終反應物在主波長340nm處吸光度下降的速度，測算出離子鈣含量的大小。
2.根據權利要求1所述離子鈣含量測定方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速(程)度，測算出離子鈣的含量。
3.根據權利要求1或2所述離子鈣含量測定方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應時間控制在2-30分鐘。
4.根據權利要求1或2所述離子鈣含量測定方法，其特征在于被測離子鈣樣品與試劑的比例控制在1/10到1/500。
5.一種離子鈣診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液40——200mmol/l磷脂 1——50mmol/l乙醇 1——30mmol/l氧化型輔酶0.5——20mmol/l磷脂酶(需鈣離子) 5000——500000U/l膽堿氧化酶 500——50000U/l過氧化氫酶 500——50000U/l醛脫氫酶 500——50000U/l穩定劑 10——80％(總體積)
6.根據權利要求5所述離子鈣診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據權利要求5或6所述離子鈣診斷試劑盒，其特征在于所述穩定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據權利要求5或6所述離子鈣診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑的pH范圍是6.0～11.0，所述緩沖劑是三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液、咪唑緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據權利要求5或6所述離子鈣診斷試劑盒，其特征在于所述氧化型輔酶是NADP+、NAD+、thio-NAD+氧化型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種測定離子鈣含量的方法，同時本發明還涉及離子鈣診斷試劑盒，屬于醫學檢驗測定技術領域。該試劑盒包括緩沖液、磷脂、乙醇、氧化型輔酶、磷脂酶(需鈣離子)、膽堿氧化酶、過氧化氫酶、醛脫氫酶、穩定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶偶聯反應，再將最終反應物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出離子鈣的含量。采用本發明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質的污染，便于推廣應用。
文檔編號C12Q1/32GK1763218SQ20041006505
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月20日 優先權日2004年10月20日
發明者王爾中 申請人:王爾中