專利名稱：二肽的制造方法
技術領域：
本發明涉及二肽的制造方法，具體地說涉及簡單、高產率且便宜地制造肽的方法。
背景技術：
肽應用于醫藥、食品等諸多領域。例如，由于L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺比L-谷氨酰胺穩定并且水溶性高，所以它作為輸液和無血清培養基成分被廣泛使用。
肽的制造方法，以往廣為人知的是用化學合成法，但是，此方法并不方便。例如，使用N-苯甲基氧羰基丙氨酸(以下，簡稱“Z-丙氨酸”)和保護L-谷氨酰胺的方法(非專利文獻1；Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)，非專利文獻2；Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962))，使用Z-丙氨酸和保護L-谷氨酸-γ-甲酯的方法(非專利文獻3；Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964))，使用Z-丙氨酸酯和無保護谷氨酸的方法(專利文獻1；特開平1-96194A)，以2-取代-丙酰鹵作為原料，N-(2-取代)-丙酰谷氨酰胺衍生物作為中間體生成的方法(專利文獻2；特開平6-234715A)等廣為人知。
但是，無論哪一種方法，都需要保護基的導入除去，或者使用光學活性中間體，所以還不是在工業上非常令人滿意的制造方法。
另一方面，作為使用酶的肽的代表性制造方法，利用N保護、C無保護的羧基成分和N無保護、C保護的氨基成分的縮合反應(反應1)，以及N保護、C保護的羧基成分和N無保護、C保護的胺成分的取代反應(反應2)廣為人知。作為(反應1)的例子，可舉出由Z-天冬氨酸和苯丙氨酸甲酯制備Z-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法(專利文獻3；特開昭53-92729A)。作為(反應2)的例子，可舉出由乙酰苯丙氨酸乙酯和亮氨酰胺制備乙酰苯丙氨酰亮氨酰胺的方法(非專利文獻4；Biochemical J.，163，531(1977))。使用N無保護、C保護的羧基成分的方法的發表研究實例很少，作為使用N無保護、C保護的羧基成分和N無保護、C保護的胺成分的取代反應(反應3)的例子有WO 90/01555(專利文獻4)，例如，可舉出由精氨酸乙酯和亮氨酰胺制備精氨酰亮氨酰胺的方法。作為使用N無保護、C保護的羧基成分和N無保護、C無保護的胺成分的取代反應(反應4)的例子有EP 278787A1(專利文獻5)和EP 359399B1(專利文獻6)，例如，可舉出由酪氨酸乙酯和丙氨酸制備酪氨酰丙氨酸的方法。
專利文獻1特開平1-96194A專利文獻2特開平6-234715A專利文獻3特開昭53-92729A專利文獻4WO 90/01555公開小冊子專利文獻5EP 278787說明書專利文獻6EP 359399說明書非專利文獻1Bull.Chem.Soc.Jpn.，34，739(1961)非專利文獻2Bull.Chem.Soc.Jpn.，35，1966(1962)非專利文獻3Bull.Chem.Soc.Jpn.，37，200(1964)非專利文獻4Biochemical J.，163，531(1977)
發明內容發明所要解決的課題上述的(反應1)-(反應4)的方法中，能成為最便宜的制造方法應該是歸于保護基的數量最少的(反應4)的范疇的反應。
但是，(反應4)的先例(專利EP 278787A1)存在如下重要問題。(1)肽生成速度極慢，(2)肽生成產率低，(3)可生產的肽限于含有疏水性較高的氨基酸，(4)添加酶量極大，(5)得自霉、酵母、植物的價格較高的羧肽酶制品是必要的。
在(反應4)中，完全不知道使用來自于細菌及酵母菌(Saccharomyces)屬以外的酵母的酶的方法，并且連親水性高的丙氨酰谷氨酰胺等的肽的制造方法也完全不知道。在這樣的背景下，期望開發一種便宜的肽的工業制造方法。
本發明將提供不經過復雜的合成方法，簡便、高產率且便宜地制造肽的新的酶作為課題。更詳細地說是提供關于催化由羧基成分和胺成分的肽生成反應的新的酶，生產這個酶的微生物，以及使用這個酶或者微生物的便宜的肽的制造方法的課題。
解決課題的方法經過對上述課題的潛心研究，本發明人從屬于醋桿菌(Acetobacter)屬的細菌中新發現了具有水解氨基酸酯活性的酶，并且是高效地合成肽的酶。而且，本發明人利用這個酶，發現了可解決上述課題的方法，最終完成了本發明。另外，在本說明書中，具有水解氨基酸酯活性的酶也稱之為“氨基酸酯水解酶”，而且該酶的活性也稱之為“氨基酸酯水解酶活性”。
氨基酸酯水解酶是水解酶，水解按下列通式1所示的反應進行。
...通式1(在通式1中，“A-B”是表示“A”和“B”物質結合而成的化合物。)以往，完全不知道氨基酸酯水解酶也具有催化羧基成分和胺成分合成肽的反應的活性這一事實。
本發明如下所述。
(1)一種二肽的制造方法，在有水解氨基酸酯活性的酶存在下，由羧基成分和胺成分生成二肽。
(2)如上述(1)所述的二肽的制造方法，上述的酶是通過選自由生產有水解氨基酸酯活性酶的微生物培養物、該培養物分離的微生物菌體以及該微生物的菌體處理物組成的組中的1種或2種以上提供的。
(3)如上述(2)所述的二肽的制造方法，上述的生產有水解氨基酸酯活性的酶的微生物是可表達上述水解氨基酸酯的水解酶的轉化體。
(4)如上述(1)-(3)任一項所述的二肽的制造方法，上述的羧基成分是L-丙氨酸甲酯。
(5)如上述(1)-(4)任一項所述的二肽的制造方法，上述的胺成分是L-谷氨酰胺。
發明效果本發明簡化了保護基導入，除去等復雜的合成方法，新提供了簡便且高產率，便宜的制造肽的酶，通過使用這個酶，能夠提供高效的肽的制造方法。
實施發明的最佳方式以下，關于本發明的實施方式，按(1)生產在本發明的制法中所使用的酶的微生物，(2)微生物的培養，(3)酶的精制，(4)二肽的制造方法，(5)編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA的分離等的順序詳細說明。
(1)生產在本發明的制法中所用的酶的微生物本發明中所用的酶具有氨基酸酯水解酶活性，并且可以是具有由羧基成分和胺成分生成肽的能力的蛋白質，對生產這樣的酶的微生物并沒有特別的限定。在本說明書中，羧基成分是提供肽鍵(-CONH-)中的羰基(CO)位點的成分，胺成分是提供肽鏈中的氨基(NH)位點的成分。另外，在本說明書中，單說“肽”且無特殊說明時，是指有至少1個以上的肽鍵的聚合物。另外，在本說明書中，所說的“二肽”是指有1個肽鍵的肽。
作為生產在本發明中所用的酶的微生物，可舉出象屬于醋桿菌屬的細菌等，更具體地說，可舉出巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteureanus)ATCC9325株等。帶有ATCC序號的菌株委托美國典型菌種收集中心(P.O.Box 1549 Manassas，VA20110，the United State of America)保藏，參照序號能夠被提供。
本發明中所用的酶可由如上所述的屬于醋桿菌屬的細菌等菌體經分離，精制所得。另外，將分離的酶作為模板，用基因工程的方法，也可以獲得在本發明中所用的酶及生產該酶的微生物。也就是說，將分離、精制的酶作為模板，分離編碼本發明所用酶的DNA，將其導入適當的宿主，使其表達，也能夠制備本發明的酶及微生物。并且，也可以將編碼從巴氏醋桿菌等獲得的本發明中所用的酶的多核苷酸等作為模板，制備探針，從其它微生物中獲得具有由羧基成分和胺成分生成肽能力的酶。各種基因重組方法在Molecular Cloning，2ndedition，Cold Spring Harbor press(1989)等中有記載。
(2)微生物的培養為了獲得生產在本發明中所用的酶的微生物的培養菌體，可將此微生物在適當的培養基中培養增殖。因此只要能夠使該微生物增殖，培養基沒有特別的限制，通常使用含有碳源、氮源、磷源、硫源、無機離子的培養基，必要的話也可使用含有機營養源的普通培養基。
例如，作為碳源，上述微生物只要能夠利用，任何一個都能使用，具體地說，可使用葡萄糖，果糖，麥芽糖，直鏈淀粉等糖類，山梨糖醇，乙醇，甘油等醇類，延胡索酸，檸檬酸，醋酸，丙酸等有機酸類及其鹽類，石蠟等碳水化合物或者它們的混合物等。
作為氮源，可使用硫酸銨，氯化銨等無機銨鹽，延胡索酸銨，檸檬酸銨等有機酸銨鹽，硝酸鈉，硝酸鉀等的硝酸鹽，蛋白胨，酵母提取物，肉提取物，玉米漿等有機氮化合物或者它們的混合物。
其它的無機鹽類、微量金屬鹽、維生素類等、培養基中常用的營養源可以適當混合使用。
培養條件沒有特殊的限制，例如，在有氧的條件下適當地控制pH及溫度在pH5～8，溫度15～40℃的范圍內，培養12～48小時左右即可。
(3)酶的精制以分離或精制具有氨基酸酯水解酶活性，并且有肽生成能力的蛋白質的方法的實施方式例為例來說明。首先，培養能夠生產有氨基酸酯水解酶活性，有肽生成能力的蛋白質的微生物。獲得的培養菌體，用超聲波破碎法等物理方法，或使用細胞壁溶解酶等酶法，破菌，用離心分離等除去不溶性成分，制備菌體萃取液。
如上所述獲得的菌體萃取液，經過通常的蛋白質的精制法，陰離子交換層析，陽離子交換層析，凝膠過濾層析等結合來分離成分，能夠精制出具有上述特定能力的蛋白質。
作為陰離子交換層析所用的載體，可舉出象Q-Sepharose HP(Amersham公司制)等。作為陽離子交換層析所用的載體，可舉出象Mono S HR(Amersham公司制)等。使萃取液通過充填著上述載體的層析柱，目的蛋白質吸附于層析柱上，洗凈層析柱以后，用高鹽濃度的緩沖液溶出目的蛋白質。此時，可以逐步提高鹽濃度，也可以形成濃度梯度。
上述精制的蛋白質，再用凝膠過濾層析等均一地精制。凝膠過濾層析所用的載體，可舉出象Sephadex 200pg(Amersham公司制)等。
經過上述的精制操作，含有本發明所用的酶的組分，可通過后面所述的方法測定各組分肽的生成活性，加以確認。
(4)二肽的制造方法本發明的二肽的制造方法是，在有水解氨基酸酯活性的酶存在下，由羧基成分和胺成分生成二肽。也就是說，本發明的二肽的制造方法是用水解氨基酸酯的酶和/或含酶物，由羧基成分和胺成分生成二肽。
作為本發明所使用的酶或含酶物作用于羧基成分和胺成分的方法，將此酶或含酶物與羧基成分和胺成分混合即可。更具體地說，是可以使用將此酶或含酶物添加于含有羧基成分和胺成分的溶液中使其反應的方法，在使用生產此酶的微生物的情況下，也可以用培養生產此酶的微生物，在微生物或微生物的培養液中精制累積此酶，然后向培養液中添加羧基成分和胺成分的方法等等。生產的二肽按規定的方法回收，可以根據要求精制。上述的酶或含酶物也可以2種以上的形式一起使用。
所謂“含酶物”是指含有此酶的物質，具體的形式包括生產此酶的微生物的培養物，從此培養物分離的微生物菌體，菌體處理物等。所謂微生物的培養物是指培養微生物所獲得的物質，更具體地說是微生物菌體，以及培養該微生物的培養基及由培養的微生物生成的物質的混合物等。微生物菌體是經洗凈，作為洗凈菌體被使用。另外，菌體處理物包含有破碎菌體，溶菌，冷凍干燥的物質，處理菌體等回收的粗酶，經精制的精制酶等。作為被精制處理的酶，可以使用由各種精制法所得的部分精制酶等，也可以使用將上述酶通過共價鍵法，吸附法，包埋法等方法固定化的固定化酶。并且，依所使用的微生物，培養過程中會有一部分溶菌物質，這種情況下，培養物上清液也可以作為含酶物利用。
另外，作為含有此酶的微生物可以使用野生菌株，也可以使用表達此酶的基因重組菌株。此微生物，不限于產酶微生物菌體，也可以使用丙酮處理菌體，冷凍干燥菌體等菌體處理物，可以使用將上述菌體通過共價鍵法，吸附法，包埋法等方法固定化的固定化菌體，固定化菌體處理物。
另外，在使用培養物、培養菌體或菌體處理物的情況下，存在著很多與肽的生成無關但能分解生成的肽的酶的情形，在這種情況下，優選添加象乙二胺四乙酸(EDTA)那樣的金屬蛋白酶抑制劑。添加量在0.1mM至300mM的范圍，優選1mM至100mM。
酶或含酶物的使用量可以是能達到目標效果的量(有效量)，本領域技術人員通過簡單的預備實驗就可以獲得該有效量，例如使用酶的情況下為0.01-100單位(U)左右，使用洗凈菌體的情況下為1～500g/L左右。
作為羧基成分，只要能夠與和作為另一基質的胺成分縮合生成肽的物質，都可以使用。作為羧基成分，可舉出象L-丙氨酸甲酯等。
作為胺成分，只要能夠與作為另一基質的羧基成分縮合生成肽的物質，都可以使用。作為胺成分，可舉出象L-谷氨酰胺等。
起始原料的羧基成分和胺成分的濃度各自為1mM～10M，優選0.05M～2M，相對羧基成分，胺成分優選添加等量以上。另外，基質濃度高時抑制反應的情況下，應在不抑制反應的濃度下逐步添加到反應中。
反應溫度在0～60℃范圍內可以生成肽，優選5～40℃。反應的pH在pH6.5～10.5范圍內可以生成肽，優選pH7.0～10.0。
(5)編碼具有肽生成活性的蛋白質的DNA的分離(5-1)DNA的分離本發明所用的微生物具有將氨基酸酯和氨基酸生成二肽的能力，從上述的微生物群等使用基因工程的方法，通過分離編碼將氨基酸酯和氨基酸生成二肽的蛋白質的DNA，制備轉化體，獲得將氨基酸酯和氨基酸生成二肽的蛋白質(肽合成酶)。以下，作為例子，來說明從微生物中分離編碼由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的蛋白質的DNA，及制備轉化體的方法的實施方式。
首先，從上述的微生物中獲得象上述的(3)欄中說明的精制酶，測定被精制的肽合成酶的氨基酸序列。使用埃德曼法(Edman，P.，Acta Chem.Scand.4，227(1950))可以測定氨基酸序列。另外，使用Applied Biosystems公司的測序儀也能夠測定氨基酸序列。關于被精制的肽合成酶，測定從N末端開始30個殘基的氨基酸序列，基于測定了的氨基酸序列，可推導出編碼它的DNA堿基序列。DNA堿基序列的推導，采用通用密碼子。
基于推導出的堿基序列，合成30個堿基對左右的DNA分子。該DNA分子的合成方法，在Tetrahedron Letters，22，1859(1981)有所記載。另外，使用Applied Biosystems公司生產的合成儀能夠合成此DNA分子。從微生物菌體的染色體基因文庫中，分離編碼肽合成酶的DNA全長時，此DNA分子可以作為探針使用。或者，將編碼肽合成酶的DNA用PCR法擴增時，作為引物使用。但是，由于使用PCR法擴增的DNA，不包括編碼肽合成酶的DNA的全長，所以要將PCR法擴增的DNA用做探針，從微生物的染色體基因文庫中，分離編碼肽合成酶的DNA全長。
關于PCR法的操作，在White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989)等有所記載。關于制備染色體DNA的方法，及使用DNA分子作為探針，從基因文庫中分離目標DNA分子的方法，在Molecular Cloning，2ndedition，Cold SpringHarbor press(1989)等有所記載。
測定分離的編碼肽合成酶的DNA的堿基序列的方法，在A Practical Guideto Molecular Cloning，John Wiley & Sons，Inc.(1985)中有所記載。另外，使用Applied Biosystems公司生產的DNA測序儀能夠測定堿基序列。
在本發明中所用的DNA，不僅僅是如上所述得到的DNA。將從某一特定的菌體的染色體DNA分離的編碼肽合成酶的DNA經人工加以變異的DNA，只要能編碼肽合成酶，也是本發明中所用的DNA。作為人工加以變異的方法，常用的有在Method in Enzymol.，154(1987)中記載的定點誘變導入法。
而且，如上所述有與從染色體DNA等分離的DNA堿基序列互補的堿基序列的多核苷酸(DNA或RNA)在嚴格條件下能夠雜交的堿基序列，并且是編碼有肽合成酶活性的蛋白質的DNA，也是本發明中所能用的DNA。
在這里，“嚴格條件”是指所有形成特異的雜交，不形成非特異的雜交的條件。這一條件明確數值化有困難，舉一例說明的話，同源性高的DNA之間，比如說有50％以上，再優選80％以上，更優選90％以上同源性的DNA之間雜交，反之其同源性低的DNA之間不雜交的條件，或者通常的Southern雜交的洗滌條件60℃，1×SSC，0.1％SDS，優選60℃，0.1×SSC，0.1％SDS，更優選65℃，0.1×SSC，0.1％SDS相當的鹽濃度的雜交條件。關于肽合成酶的活性都按照上述說明。但是與互補的堿基序列在嚴格條件下雜交的堿基序列的情況下，在50℃，pH8的條件下期望有原始氨基酸序列的蛋白質的一半左右以上，再優選80％以上，更優選90％以上保持酶的活性。
而且，和被分離的DNA所編碼的蛋白質實質上相同的蛋白質也是本發明所能用的。因此，在分離的DNA所編碼的氨基酸序列中，具有含1個或者數個氨基酸的置換、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列，并且，編碼催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應的具有肽合成酶活性的蛋白質的DNA也可以在本發明中使用。這里的“數個”是指氨基酸殘基的蛋白質的立體結構，以及肽合成酶活性損失不太大的范圍內，具體地說，是2～50個，優選2～30個，更優選2～10個。另外，關于肽合成酶的活性，按照前面的說明。但是，在氨基酸序列中，含有1個或者數個氨基酸殘基的置換、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列的情況下，在50℃，pH8的條件下期望有原始氨基酸序列的蛋白質的一半左右以上，再優選80％以上，更優選90％以上保持酶的活性。
如上所述，從微生物分離DNA的情況下，在本發明中可以適宜地使用下述的DNA。另外，作為例子，分離的DNA的特異的堿基序列稱為堿基序列y，此堿基序列編碼的氨基酸序列稱為氨基酸序列Y。
(i)含有堿基序列y的DNA。
(ii)含有與堿基序列y互補的堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交，并編碼具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應的具有肽合成酶活性的蛋白質的DNA。
(iii)編碼具有氨基酸序列Y的蛋白質的DNA。
(iv)在氨基酸序列Y中，具有含1個或數個氨基酸的置換、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列，并且，編碼催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應的具有肽合成酶活性的蛋白質的DNA。
(5-2)轉化體的制備接下來，說明關于表達具有肽合成酶活性的蛋白質的轉化體的制備。利用重組DNA技術制備酶及具有生理活性物質等有用蛋白質的例子已知有很多，使用重組DNA技術，能夠大量生產天然微量存在的有用蛋白質。
作為能夠用于本發明方法的轉化體，作為合適的，可舉出如下列(A)、(B)或(C)等的能夠表達蛋白質的轉化體。
(A)具有氨基酸序列Y的蛋白質(B)在氨基酸序列Y中，具有含1個或數個氨基酸的置換、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列，并且，催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應的具有肽合成酶活性的蛋白質。
(C)含有與堿基序列y互補的堿基序列的多核苷酸在嚴格條件下雜交，并由編碼具有催化由L-氨基酸酯和L-氨基酸生成二肽的反應的具有肽合成酶活性的蛋白質的DNA編碼的蛋白質。
為制備上述(A)～(C)的表達具有肽合成酶活性的蛋白質的轉化體，將上述(5-1)欄所示的(i)-(iv)的DNA導入宿主細胞即可。也就是說，(i)、(ii)、(iii)或(iv)的DNA整合入在宿主細胞能夠表達的表達載體，再將載體導入宿主細胞。
上述(B)所示的變異，例如根據定點誘變法，本酶基因的特定位點的氨基酸是被置換、缺失、插入、添加以改變堿基序列而獲得。而且，如上所述被改變的DNA也可以通過以往已知的突變處理獲得。所謂的突變處理是將編碼本酶的DNA用羥胺等在體外處理的方法，以及攜帶有編碼此酶的DNA的大腸桿菌屬細菌，用紫外線照射或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者亞硝酸等的常規人工突變用的變異劑處理的方法。
利用重組DNA技術大量生產蛋白質時，例如也優選在生產此蛋白質的轉化體內該蛋白質集合，形成蛋白質內含體(inclusion body)的形式作為一個實施方式。這個表達生產方法的優點是保護目的蛋白質不被在菌體內存在的蛋白酶消化以及在接下來的破碎菌體離心分離操作中利于簡單精制目的蛋白，等等。
如此獲得的蛋白質內含體，用蛋白質變性劑溶解，主要經過去除變性劑，復性操作之后，轉化為正確折疊的具有生理活性的蛋白質。例如，人的白細胞介素-2的復性(JP 61-257931A)等有很多例子。
為了從蛋白質內含體獲得具有活性的蛋白質，溶解、復性等一系列操作是必要的，比直接生產有活性的蛋白質的操作復雜。但是，在菌體內大量生產影響菌體生長的蛋白質時，作為無活性的蛋白質內含體在菌體內蓄積，可以抑制那種影響。
作為大量生產目的蛋白質作為內含體的方法，除在強啟動子的調控下，單獨表達目的蛋白質的方法外，還有已知的可大量表達的蛋白質作為融合蛋白質表達的方法。
進而，作為融合蛋白表達以后，為了切除目的蛋白，將限制蛋白酶的識別序列安放于適當的位置是必要的。
用重組DNA技術大量生產蛋白質的時候，作為被轉化的宿主細胞，可以使用細菌細胞，放線菌細胞，酵母細胞，真菌細胞，植物細胞，動物細胞等，但是一般使用大腸桿菌等腸道細菌，優選大腸桿菌(大腸桿菌，Escherichia coli)。因為關于用大腸桿菌等腸道細菌大量生產蛋白質的技術已經有很多的了解。以下，描述用轉化的大腸桿菌制造肽合成酶的方法的一種形式。
作為表達編碼肽合成酶的DNA的啟動子，通常可以使用用于大腸桿菌的異種蛋白質生產的啟動子，例如，可以列舉T7啟動子，lac啟動子，trp啟動子，trc啟動子，tac啟動子，λ噬菌體的PR啟動子，PL啟動子等強啟動子。
為了將肽合成酶作為融合蛋白內含體生產，將肽合成酶基因的上游或下游連接上編碼其它的蛋白質，優選親水性的肽的基因，構成融合蛋白基因。作為編碼象這樣的其它蛋白質的基因，只要能增加融合蛋白的蓄積量，變性、復性后提高融合蛋白的溶解性就可以，例如，T7gene 10，β-半乳糖苷酶基因，脫氫葉酸還原酶基因，干擾素γ基因，白細胞介素-2基因，凝乳酶原基因等可作為候補。
將這些基因與編碼肽合成酶的基因連接時，密碼子讀框要一致。在適當的限制酶位點連接，或者利用適當序列的合成DNA也可以。
另外，為提高生產量，有時侯，優選在融合蛋白基因的下游連接一個轉錄終止序列，即終止子。作為這個終止子，可舉出T7終止子、fd噬菌體終止子、T4終止子、四環素抗性基因的終止子，大腸桿菌trp A基因的終止子等。
作為將肽合成酶，或者，編碼肽合成酶與其他蛋白質的融合蛋白的基因導入大腸桿菌的載體，優選所謂多復制型，有來自ColE1的復制起點的質粒，例如，可以例舉pUC系列的質粒和pBR322系列的質粒或其衍生物。在這里，所說的“衍生物”是指由于堿基的置換、缺失、插入、添加和/或倒位等對質粒加以改變的物質。另外，在這里所說的改變，是用變性劑和UV照射等變性處理，也包括由于自然變異等的改變。更具體地說，作為載體，可以使用象pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等。也能利用其他的噬菌體DNA，轉座子DNA的載體。
另外，為了篩選轉化體，優選該載體具有青霉素抗性基因等的標記。作為這樣的質粒，攜帶強啟動子的表達載體，市場有售(pUC系列(寶酒造(股分公司)制造)，pPROK系列(Clontech公司制)，pKK233-2(Clontech公司制)等)。
將按啟動子、肽合成酶或者編碼肽合成酶與其他蛋白質的融合蛋白的基因、終止子的順序連接的DNA片段與載體DNA連接，獲得重組DNA。
使用獲得的重組DNA，例如轉化大腸桿菌，培養此大腸桿菌，即可表達且生產肽合成酶或者肽合成酶與其他蛋白質的融合蛋白。轉化的宿主，可以使用通常所用表達外源基因的菌株，但是例如優選大腸桿菌JM 109菌株。進行轉化的方法及轉化體篩選的方法在Molecular Cloning，2ndedition，Cold SpringHarbor press(1989)等中有記載。
作為融合蛋白被表達時，可以用象凝血因子Xa，激肽釋放酶等的，在肽合成酶內不存在的序列作為識別序列的限制蛋白酶切除肽合成酶。
作為生產培養基，使用M9-酪蛋白氨基酸培養基、LB培養基等常用的培養大腸桿菌的培養基。而且可以根據使用的載體的標記、啟動子、宿主菌等種類適當選擇培養條件、生產誘導條件。
回收肽合成酶或肽合成酶與其他蛋白質的融合蛋白時，有以下的方法等。如果肽合成酶或其融合蛋白在菌體內可以溶解，那么可以在回收菌體后，破碎菌體或者溶菌，作為粗酶液使用。進而，根據需要，可以用常規的沉淀、過濾、柱層析等方法對肽合成酶或其融合蛋白精制后使用。這時，也可以利用肽合成酶或其融合蛋白的抗體進行精制。
在形成蛋白質內含體時，用變性劑來溶解蛋白。可以與菌體蛋白質一起溶解，但是考慮到后來的精制操作，優選將內含體取出后再溶解。從菌體回收內含體時，可以用以往公知的方法。例如，通過破壞菌體，離心分離等操作回收內含體。作為溶解蛋白內含體的變性劑，有鹽酸胍(例如，6M，pH5～8)、尿素(例如8M)等。
這些變性劑用透析法等除去，復性使其成為有活性的蛋白質。用作透析用的透析溶液，可以使用三羥甲基氨基甲烷(トリス)鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液等，濃度為20mM～0.5M，pH5～8。
復性過程時的蛋白質濃度優選控制在500μg/ml左右以下。為了防止復性的肽合成酶自體交連，透析溫度優選在5℃以下。而且，去除變性劑的方法，除透析法以外，還有稀釋法，超濾法等，無論哪種方法都可使其復性。
另外，關于基因工程的技術，可按照Molecular Cloning，2ndedition，ColdSpring Harbor press(1989)等文獻中記載的技術操作。以下，通過實施例更詳細地說明，但本發明并不限于此。另外，生成物的檢測，用薄層層析的水合茚滿三酮顯色確認(定性)，定量用以下所示的高效液相色譜法定量。
色譜柱InertsiL ODS-2(GL Science公司制備)，洗脫液5.0mM含1-辛烷磺酸鈉的磷酸水溶液(pH2.1)∶甲醇＝100∶15～50，流速1.0mL/min，檢測波長210nm。
1.得自巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteureanus)ATCC9325的氨基酸酯水解酶在大腸桿菌中的表達1L中含有葡萄糖50g、硫酸銨5g、磷酸一鉀1g、磷酸二鉀3g、硫酸鎂0.5g、酵母膏5g、蛋白胨5g(pH7.0)的培養基每50mL分別注入500mL的搖瓶中，115℃滅菌15分鐘。在這個培養基上接種1白金圈的在30℃下培養16小時的巴氏醋桿菌ATCC9325菌株，在30℃、120往復/分下振蕩培養16小時。
離心分離50ml培養液(12000rpm，4℃，15分鐘)，收集菌體。使用QIAGENGenomic-tip System(Qiagen公司)，按照說明書的方法從該菌體中提取染色體DNA。
大腸桿菌(Escherichia coli)W3110染色體DNA上的trp操縱子的啟動區以序列號1、2所示的寡核苷酸作為引物，用PCR方法擴增目的基因區域，將獲得的DNA片段連接于pGEM_Teasy載體(普洛麥格制)。用此連接溶液轉化大腸桿菌JM109，在青霉素抗性菌株中，篩選trp啟動子的方向與lac啟動子方向反向插入的含有目的質粒的菌株。接下來，這個質粒用EcoO109I/EcoRI處理所獲得的含有trp啟動子的DNA片斷，與pUC19(Takara制)的EcoO109I/EcoRI處理物連接。用這個連接溶液再轉化大腸桿菌JM109中，在青霉素抗性菌株中，篩選出有trp啟動區的質粒的菌株，接著，將這個質粒用HindIII/PvuII處理獲得的DNA片段與pKK223-3(安法瑪西亞制)用HindIII/HincII處理，與所得的含有rrnB終止子的DNA片段連接。用此連接液轉化大腸桿菌JM109，在青霉素抗性菌株中，篩選有trp啟動區并且含有rrnB終止子的質粒的菌株，將此質粒命名為pTrpT。
將巴氏醋桿菌ATCC9325菌株的染色體DNA作為模板，將上述序列號3、4所示的寡核苷酸作為引物，用PCR法擴增含有氨基酸酯水解酶基因的目的基因，將此DNA片段用AseI/BamHI處理，將獲得的DNA片段與pTrpT的NdeI/BamHI處理物連接。用此連接液轉化大腸桿菌JM109，在青霉素抗性菌株中，篩選含有編碼表達氨基酸酯水解酶的蛋白質的堿基序列的質粒的菌株，將這個質粒命名為pTrpT_Ap_aehA。
將一白金圈的具有pTrpT_Ap_aetA的大腸桿菌JM109接菌入裝有3ml培養基(2g/l葡萄糖，10g/l酵母膏，10g/l酪蛋白氨基酸，5g/l硫酸銨，3g/l磷酸二氫鉀，1g/l磷酸氫二鉀，0.5g/l硫酸鎂七水合物，100mg/l青霉素)的貼標的普通試管中，25℃下培養20小時。添加L-丙氨酸甲酯與L-谷氨酰胺培養之后，培養液1ml具有相當于0.02U的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生成活性，確認α-氨基酸酯水解酶具有肽生成活性。另外，作為對照只導入pTrpT的轉化體中，沒有檢測出活性。
工業實用性本發明在肽的工業化生產上非常有用。
序列表<110>味之素株式會社<120>二肽的制造方法<130>PAMA-15502<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>發明人原誠一發明人橫關健三<220>
<223>PCR引物<400>1gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gteggtgatc 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>2ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40<210>3<211>35<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>3ccgccgccga ttaatggtgg gacagattac ccttt 35<210>4<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>PCR引物<400>4acccatactg ga tccttact gtttcacaac cgggag3權利要求
1.一種二肽的制造方法，在有水解氨基酸酯活性的酶存在下，由羧基成分和胺成分生成二肽。
2.按照權利要求1的二肽的制造方法，上述的酶是通過選自由生產有水解氨基酸酯活性酶的微生物培養物、該培養物分離的微生物菌體以及該微生物的菌體處理物組成的組中的1種或2種以上提供的。
3.按照權利要求2的二肽的制造方法，上述的生產有水解氨基酸酯活性的酶的微生物是可表達上述水解氨基酸酯的水解酶的轉化體。
4.按照權利要求1-3任一項的二肽的制造方法，上述的羧基成分是L-丙氨酸甲酯。
5.按照權利要求1-4任一項的二肽的制造方法，上述的胺成分是L-谷氨酰胺。
全文摘要
本發明涉及不經過復雜的合成方法，就能簡便、高產率且便宜地制造肽的新的酶。更詳細地說，是提供催化由羧基成分和胺成分生成肽的反應的新的酶，生產這種酶的微生物，以及使用這種酶或微生物的便宜的肽的制造方法。從細菌中獲得的酶中發現了氨基酸酯水解酶具有肽生成活性。此酶是有效的肽合成酶，將此酶作用于羧基成分和胺成分可便宜并簡便地制造肽。
文檔編號C12P21/02GK1661034SQ20041004716
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月10日 優先權日2003年12月11日
發明者原誠一, 橫關健三 申請人:味之素株式會社