專利名稱：重組人超氧化物歧化酶的提取方法
技術領域：
本發明涉及生物技術基因工程生命技術，是一種重組人超氧化物歧化酶的提取方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶的英文縮寫為SOD，它的研究和應用，始于美國巴爾的摩老年醫學研究中心卡泰勒等人，發現哺乳動物(狐、猴及人類)血中SOD含量與其壽命呈正比。到現在為止，大量的實驗研究證明，它是一種廣泛存在于動、植物及微生物中的一種金屬酶，具有抗炎、抗病毒感染，延緩人體衰老，防止色斑形成等功能，不僅用于醫藥，而且已被廣泛地應用于日用化學工業。添加了SOD的化妝護膚品，具有顯著的抗衰老、去褐斑的功能，因而倍受消費者的青睞。我國的大寶、紫羅藍、奧琪、康舒達、永芳等高級化妝護膚品，都添加了SOD。
值得注意的是，近來報道SOD還具有抗癌活性。我國海軍總醫院分子生物研究室等單位發現，肺癌、血液病、冠心病患者的血液中，SOD的活力大大低于健康人。國外也證明，一些致癌劑的致癌活力可為外源低計量SOD所抑制。
貴州農學院生化教研室對刺梨的SOD的提純、性質等進行的廣泛的研究。結果指出SOD分子是由兩個相同的亞基組成的，分子量為34000，等電點(PI)是5.6，作用最適ph為5，最適溫度為55度。它對熱比較穩定，在80度經過5min才明顯失活，其粗提液在室溫存放2個月還保留一定催化活力。對ph也不太敏感，ph3.5-9.5對活力影響不大。
目前，利用動物血生產SOD最為理想，SOD對ph和溫度不很敏感有利于生產控制。現在我國上海、內蒙古利用血為原料生產SOD。但動物血液中含有大量的疾病病毒或病毒基因，從而給SOD的使用帶隱患，另外傳統提取SOD的方法為硫酸銨鹽析法，提取工藝復雜，提取率低。
發明內容
本發明的目的是提供一種重組人超氧化物歧化酶的提取方法，采用生物基因復制技術，克服超氧化物歧化酶帶有病毒的隱患，使其具有簡單的工藝，較低的加工成本，提取時間短和提取率高的優點。為此，本發明采用下述方法(1)將含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌接種子培養基中，在32℃的溫度下，發酵培養24小時，再加入占發酵液重量1％的硫酸銅清液，再向發酵液加入3倍體積的去離子水，用震動式破碎機劇烈震動破碎30min，靜置20min，置入每分鐘2000轉的離心機中，離心分離，除去沉淀雜質，得清澈透明粗酶液；(2)將粗酶液置入純酶儀中分離，去雜質，再加入4℃的等量體積的去離子水，超濾濃縮，得等量體積50％的SOD的粗抽提液，再向粗抽提液中加入等量4℃的冷丙酮，分級沉淀，去除底部雜質，得SOD濃縮液；(3)將SOD濃縮液用2倍體積的去離子水溶解，再次置入每分鐘2000轉的離心機中，離心分離，除去沉淀雜質，得SOD濃縮清液，將濃縮清液4℃冷凍48小時靜止后，除去沉淀雜質，超濾濃縮，冷凍干燥，即得藥用SOD凍干品，該產品酶活性為8000U～15000U/mg。
本發明的優點是采用生物基因復制技術，克服了超氧化物歧化酶帶有病毒的隱患，還具有簡單的工藝，較低的加工成本，其加工成本比傳統提取SOD的方法降低30～40％，提取時間比傳統提取SOD的方法短35％，提取率比傳統提取SOD的方法高50％，且該方法提取的產品活力高，有工藝利于掌握的優點。
具體實施例方式
一種重組人超氧化物歧化酶的提取方法，該方法包括下列步驟；將含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌接種子培養基中，在32℃的溫度下，發酵培養24小時，再加入占發酵液重量1％的硫酸銅清液，再向發酵液加入3倍體積的去離子水，用震動式破碎機劇烈震動破碎30min，靜置20min，置入每分鐘2000轉的離心機中，離心分離，除去沉淀雜質，得清澈透明粗酶液。將粗酶液置入純酶儀中分離，去雜質，再加入4℃的等量體積的去離子水，超濾濃縮，得等量體積50％的SOD的粗抽提液，再向粗抽提液中加入等量4℃的冷丙酮，分級沉淀，去除底部雜質，得SOD濃縮液。將SOD濃縮液用2倍體積的去離子水溶解，再次置入每分鐘2000轉的離心機中，離心分離，除去沉淀雜質，得SOD濃縮清液，將濃縮清液4℃冷凍48小時靜止后，除去沉淀雜質，超濾濃縮，冷凍干燥，即得藥用SOD凍干品，該產品酶活性為8000U～15000U/mg。
所述的超濾濃縮為孔徑0.8μm和0.22μm的微濾膜進行微濾。含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌為己有產品。
權利要求
1.一種重組人超氧化物歧化酶的提取方法， 其特征在于該方法包括下列步驟；(1)將含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌接種子培養基中，在32℃的溫度下，發酵培養24小時，再加入占發酵液重量1％的硫酸銅清液，再向發酵液加入3倍體積的去離子水，用震動式破碎機劇烈震動破碎30min，靜置20min，置入每分鐘2000轉的離心機中，離心分離，除去沉淀雜質，得清澈透明粗酶液；(2)將粗酶液置入純酶儀中分離，去雜質，再加入4℃的等量體積的去離子水，超濾濃縮，得等量體積50％的SOD的粗抽提液，再向粗抽提液中加入等量4℃的冷丙酮，分級沉淀，去除底部雜質，得SOD濃縮液；(3)將SOD濃縮液用2倍體積的去離子水溶解，再次置入每分鐘2000轉的離心機中，離心分離，除去沉淀雜質，得SOD濃縮清液，將濃縮清液4℃冷凍48小時靜止后，除去沉淀雜質，超濾濃縮，冷凍干燥，即得藥用SOD凍干品，該產品酶活性為8000U～15000U/mg。
全文摘要
本發明屬于一種重組人超氧化物歧化酶的提取方法，該方法將含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌接種子培養基中，發酵培養，再向發酵液加入去離子水，用震動破碎，離心分離，除去沉淀雜質，超濾濃縮，再向粗抽提液中加入冷丙酮，分級沉淀，再次離心分離，除去沉淀雜質，超濾濃縮，冷凍干燥，即得藥用SOD凍干品，該產品酶活性為8000U～15000U/mg，本發明采用生物基因復制技術，克服超氧化物歧化酶帶有病毒的隱患，使其具有簡單的工藝，較低的加工成本，提取時間短和提取率高的優點。
文檔編號C12N9/02GK1706940SQ200410046398
公開日2005年12月14日 申請日期2004年6月9日 優先權日2004年6月9日
發明者唐志泉, 侯偉文, 李如華 申請人:唐志泉