專利名稱：一種提取木瓜凝乳蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及酶制劑領域中酶的提取方法，特別是涉及一種木瓜凝乳蛋白酶的提取方法。
背景技術：
“木瓜酶”來源于番木瓜(Carica Papaya)幼果的果漿中，是一種含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜蛋白酶III(Papaya Proteinase III)、木瓜蛋白酶IV(PapayaProteinase IV)、木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain)和木瓜溶菌酶(Papaya Lysozyme)的混合巰基酶。不同季節收獲、以及經不同工藝生產的“木瓜酶”制劑，所含有的各種巰基酶的比例漂移較大，酶反應動力學為一非固定常數。
應用“木瓜酶”進行體外血型血清學檢定實驗已有近六十年的歷史，進期的研究表明，酶試劑溶液中的木瓜蛋白酶III在使用與保存條件下發生了自我水解，產生了具有較高水解活力的酶分子片斷，造成酶試劑溶液活力效價的不穩定；紅細胞凝集實驗表明，對偶氮化白蛋白未表現出水解活性的木瓜溶菌酶對紅細胞產生了水解修飾作用。受上述酶學質量因素的影響，“木瓜酶”檢定實驗存在產生“試劑型——假陽性”檢定結果的幾率。
目前尚無一種具有明確酶反應動力學特征，適應細胞生理學、免疫化學需要的蛋白酶制劑。
發明內容
本發明的目的是提供一種有效提取木瓜凝乳蛋白酶的方法。
本發明所提供的提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括如下步驟1)向番木瓜幼果果漿原料中加入殼聚糖溶液，沉淀后去除沉淀物，保留清液；2)向清液中加入硫酸銨到溶液硫酸銨飽和度為30-40％，去除沉淀，保留上清液；3)向上清液中加入過量酒石酸，絮凝沉淀后，去除沉淀物，保留上清液；4)向上清液中加入硫酸銨到溶液硫酸銨飽和度為65-70％，收集沉淀物；5)用純水溶解沉淀物，以截留1-2萬分子量的超濾膜濃縮溶液，收集濃縮液；6)用弱酸陽離子纖維素CM-C92層析柱分離木瓜凝乳蛋白酶，收集pH5.5的0.7mol/L磷酸鈉緩沖液洗脫液；7)以截留1-2萬分子量的超濾膜濃縮木瓜凝乳蛋白酶的洗脫液，得到木瓜凝乳蛋白酶濃縮液。
為了使分離的效果更好，在所述步驟2)的上清液中，加入過量酒石酸之前，先加入硫酸銨至40-50％飽和度，去除沉淀，保留上清液。所述過量酒石酸溶液的pH應調節至＜2.5。
在超濾濃縮結束后，在木瓜凝乳蛋白酶濃縮液中加入普魯蘭和半胱氨酸作為保護劑，經冷凍干燥，制備木瓜凝乳蛋白酶干燥物。
步驟1)所述加入的殼聚糖溶液終濃度為0.05-0.1％。
本發明由于采用了以上技術方案，具有以下優點1、利用殼聚糖去除果膠、鞣質等雜質，可顯著提高溶液透光度，去除溶液中的重金屬，降低溶液色度。
2、利用酒石酸作為絮凝劑，顯著提高對雜蛋白的絮凝—沉淀的分離效果。
3、利用硫酸銨30-40％、40-50％飽和度兩次鹽析工藝，可顯著降低蛋白質的共沉淀效應，提高木瓜凝乳蛋白酶得率。
4、廢除傳統的堿中和、透析等工藝，利用截留1-2W分子的聚砜中空纖維超濾器，對酶溶液直接進行脫酸、脫鹽、去除小分子雜質、濃縮，可有效地降低工藝成本，保護酶活性。
5、采用弱酸陽離子纖維素CM-C92作為層析材料，具有吸附容量大、洗脫方便等特點，可顯著提高工藝效果。
6、利用普魯蘭(一種直線型大分子物質)作為酶制劑的輔料，可提高酶制劑在加工、儲存過程的穩定性。
本發明采用復合工藝方法，提高產品的生產工藝穩定，適合于木瓜凝乳蛋白酶試劑原料的規模化生產，制備的木瓜凝乳蛋白酶符合體外血型血清檢定實驗所需要的質量特征。
具體實施例方式
實施例1、酶活力效價分析方法與條件一、試劑1)酶激活—穩定劑配方L-半胱氨酸 0.025mol乙二胺四乙酸二鉀 0.03mol甘露醇0.3mol普魯蘭(10W) 0.05mmol
磷酸二氫鉀 0.064mol磷酸氫二鈉 0.003mol配制方法將上述溶質溶解于適量純水中，用純水稀釋至1000ml定容。
2)樣品溶液稱取木瓜凝乳蛋白酶30mg，用酶激活—穩定劑溶解，稀釋至100ml定容。
3)底物溶液稱取磷酸氫二鈉0.93mol，磷酸二氫鈉0.06mol，用蒸餾水溶解，稀釋至1000ml定容。
稱取偶氮化白蛋白2.0g，溶解于上述100ml磷酸鹽溶液中。
二、酶活力效價測定方法1、將樣品溶液，底物溶液預熱至37℃±0.5℃。
2、用加樣器吸收底物溶液1.0ml，樣品溶液100μl注入試管中，置37℃±0.5℃水浴箱反應10分鐘。
3、加入5％三氯乙酸溶液1ml，混合。
4、1000×g離心5分鐘，吸取上清液1ml。
5、加入0.5mol/L氫氧化鈉溶液1ml，混合。
6、測定樣品430nm OD值。
7、酶活力定義在上述條件下，水解產物在430nm產生0.002的吸光值的改變為一個酶活力單位(PU)。
8、活力效價標示方法活力效價標示方法IPU/min/mg＝每毫克酶樣品1/10分鐘所具有的相對酶活力效價。
活力效價標示方法IIPU/mg＝每毫克酶樣品10分鐘所具有的相對酶活力效價。
實施例2、木瓜凝乳蛋白酶的提取1、取1000g的番木瓜幼果漿冰凍物，用微波加熱融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)，在勻漿器中勻漿。
2、加入1％殼聚糖溶液100ml，勻漿攪拌，室溫靜置2小時后過濾，去除沉淀，保留濾液。
3、向濾液中加入硫酸銨至30％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉淀；向離心上清液中加入硫酸銨至50％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉淀物，保留上清液。
4、向上清液加入過量酒石酸溶液，調節pH至＜2.5，室溫靜置60分鐘，出現絮凝沉淀后，10000×g離心20分鐘，棄去沉淀物，向上清液中加入硫酸銨至70％飽和度，室溫靜置60分鐘，10000×g離心20分鐘，收集沉淀物。
5、將沉淀物用500ml純水溶解，然后用截留分子量為2萬的聚砜中空纖維超濾膜超濾組件，在超濾過程中分次加入2-8℃純水，在0.1兆帕的條件下循環超濾1h，得到超濾濃縮液。
6、向上述溶液中加入等量的0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)，混勻。用該磷酸鈉緩沖液預先平衡顆粒型弱酸陽離子CM-C92層析柱，然后以5ml/min的速度，將溶液上柱，以0.7mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)為洗脫液，收集該洗脫液，用截留分子量為1萬的聚砜中空纖維超濾膜濃縮洗脫液。
7、向濃縮液加入普魯蘭(10W)0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷凍干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物30g。
8、用實施例1中測定方法測定產品酶活力。
用活力效價標示方法I得出的酶活力效價為1500PU/mg；用活力效價標示方法II得出的酶活力效價為15000PU/mg。
實施例3、木瓜凝乳蛋白酶的提取取番木瓜幼果的果漿干燥物600g，溶于0.3mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5)2L，加入3％殼聚糖水溶液100ml，室溫靜置2小時后過濾，去除沉淀，保留濾液。
向濾液中加入硫酸銨至40％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉淀；向離心上清液中加入硫酸銨至50％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉淀物，保留上清液。
向上清液加入過量酒石酸溶液，調節pH至＜2.5，室溫靜置60分鐘，出現絮凝沉淀后，10000×g離心20分鐘，棄去沉淀物；向上清液中加入硫酸銨至65％飽和度，室溫靜置60分鐘，10000×g離心20分鐘，收集沉淀物。
將沉淀物用500ml純水溶解，然后用截留分子量為2萬的聚砜中空纖維超濾膜超濾組件，在超濾過程中分次加入2-8℃純水，在0.1兆帕的條件下循環超濾1h，得到超濾濃縮液。
向上述超濾濃縮液中加入等量的0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)，混勻。用該磷酸鈉緩沖液預先平衡顆粒型弱酸陽離子CM-C92層析柱，然后以5ml/min的速度，將溶液上柱，以0.7mol/L磷酸鈉緩沖液(pH5.5)為洗脫液，收集該洗脫液。
用截留分子量為1萬的巨砜中空纖維超濾膜濃縮洗脫液。向濃縮液加入普魯蘭0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷凍干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物20g。
用實施例1中測定方法測定產品活力效價。
用實施例1活力效價標示方法I得出的相對酶活力為1300PU/mg；用實施例1活力效價標示方法II得出的相對酶活力為13000PU/mg。
實施例4、木瓜凝乳蛋白酶的應用用上述制造方法的木瓜凝乳蛋白酶干燥物，作為原料，用于生產專用型的木瓜凝乳蛋白酶試劑，用于體外血型血清學檢定實驗。其工藝過程如下。
一、木瓜凝乳蛋白酶制劑1、配方普魯蘭0.05mmol甘露醇0.3mol海藻糖0.02mol抗壞血酸鈉0.02molL-半胱氨酸0.05mol木瓜凝乳蛋白酶200000PU2、制備工藝及過程定量稱取上述溶質，溶解于純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然后按每瓶10ml分裝至潔凈西林瓶。用冷凍干燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然后啟動干燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓干燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到成品木瓜凝乳蛋白酶制劑。
二、木瓜凝乳蛋白酶溶劑磷酸二氫鉀0.064mol磷酸氫二鈉0.003mol用純水溶解上述溶質，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然后按每瓶10ml分裝至至聚乙烯瓶內，密封。
使用前用木瓜凝乳蛋白酶溶劑溶解木瓜凝乳蛋白酶制劑，形成木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液，用2％偶蛋化白蛋白—磷酸鹽溶液檢測木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液的活力效價。
按照下述的活力效價標識方法I，每瓶木瓜凝乳蛋白酶制劑的活力效價為2000PU/瓶；按體外血型血清學實驗檢定靈敏度的評價標準，每50μl木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液應具備的活力效價為10-16PU。
按照下述的活力效價標識方法II，每瓶木瓜凝乳蛋白酶制劑的活力效價為20000PU/瓶；按體外血型血清學實驗檢定靈敏度的評價標準，每50μl木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液應具備的活力效價為100-160PU。
活力效價標識方法IPU＝每50μl試劑溶液1/10分鐘所具有的活力效價。
活力效價標識方法IIPU＝每50μl試劑溶液10分鐘所具有的活力效價。
利用上述試劑進行血型抗體特異性鑒定實驗的步驟為1、取試管，標記I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI，依次置試管架排列。
2、向上述試管加入與其標記相符合的3％血型譜細胞懸液50μl，木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
3、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
4、向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向全部試管各加入血清標本50μl，或紅細胞放散液100μl，混合均勻。
5、將試管移入37±0.5℃水浴孵育7分鐘。
6、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
7、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察實驗鑒定結果。依據受檢血清在不同血型譜細胞產生的凝集與否，判定受檢血清的血型抗體特異性。
經采用室溫鹽水實驗、37鹽水實驗、間接抗人球蛋白實驗等血型抗體特異性鑒定實驗方法與本發明的實驗方法作為平行試驗，對產自Immucor的人源型Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗體血清，以及臨床樣本血清進行抗體特異性鑒定。實驗結果表明，本實驗方法對上述血型抗體的實驗鑒定準確率為100％。
權利要求
1.一種提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，包括如下步驟1)向番木瓜幼果果漿原料中加入殼聚糖溶液，沉淀后去除沉淀物，保留清液；2)向清液中加入硫酸銨到溶液硫酸銨飽和度為30-40％，去除沉淀，保留上清液；3)向上清液中加入過量酒石酸，絮凝沉淀后，去除沉淀物，保留上清液；4)向上清液中加入硫酸銨到溶液硫酸銨飽和度為65-70％，收集沉淀物；5)用純水溶解沉淀物，以截留分子量為0.9-1.1萬道爾頓的超濾膜濃縮溶液，收集濃縮液；6)用陽離子纖維素CM-C92層析柱分離木瓜凝乳蛋白酶，收集pH5.5的0.7mol/L磷酸鈉緩沖液洗脫液；7)以截留分子量為1-2萬的超濾膜濃縮木瓜凝乳蛋白酶的洗脫液，得到木瓜凝乳蛋白酶濃縮液。
2.根據權利要求1所述的提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，其特征在于在所述步驟2)的上清液中，加入過量酒石酸之前，先加入硫酸銨到溶液硫酸銨飽和度為40-50％，去除沉淀，保留上清液。
3.根據權利要求1或2所述的提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，其特征在于所述過量酒石酸溶液的pH調節至＜2.5。
4.根據權利要求1或2或3所述的提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，其特征在于還需在木瓜凝乳蛋白酶濃縮液中加入普魯蘭和半胱氨酸作為保護劑，經冷凍干燥得到木瓜凝乳蛋白酶干燥物。
5.根據權利要求4所述的提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，其特征在于所述加入的普魯蘭濃度為0.05-0.1mmol；所述加入的半胱氨酸的濃度為0.025-0.05mol。
6.根據權利要求1或2或3所述的提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，其特征在于步驟1)所述加入的殼聚糖溶液終濃度為0.05-0.1％。
7.根據權利要求1或2或3所述的提取木瓜蛋白凝乳酶的方法，其特征在于所述木瓜凝乳蛋白酶的活力效價為1/10分鐘10-16PU/50μl，或10分鐘100-160PU/50μl。
全文摘要
本發明公開了一種提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，涉及酶制劑領域。本發明所提供的提取木瓜凝乳蛋白酶的方法，包括如下步驟1)向原料中加入殼聚糖，沉淀后保留清液；2)飽和度為30％的硫酸銨鹽析，去除沉淀，保留上清液；3)再用飽和度為50％的硫酸銨鹽析，去除沉淀，保留上清液；4)過量酒石酸絮凝上清液，去除沉淀保留上清液；5)飽和度為70％的硫酸銨鹽析清液，收集沉淀物；6)用純水溶解沉淀物，以截留分子量為2萬的超濾膜濃縮溶液，收集濃縮液；7)用弱酸性陽離子纖維素－92分離濃縮液，收集洗脫液；8)以截留分子量為1萬的超濾膜濃縮洗脫液，得到木瓜凝乳蛋白酶濃縮液。本發明的方法木瓜凝乳蛋白酶酶活和回收率高。
文檔編號C12N9/50GK1584025SQ20041004610
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月31日 優先權日2004年5月31日
發明者盧世昌, 劉俊鳳 申請人:廣州偉仕科技有限公司