專利名稱：一種細胞因子基因型檢測芯片及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因分析檢測產品，具體地說是基因檢測芯片，更具體的說是適用于檢測腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)基因型的基因檢測芯片。本發明還涉及檢測TNF和IL-6基因型的方法。
背景技術：
本世紀80年代以來，隨著分子生物學的飛速發展，對TNF、IL-6研究不斷深入，人們發現其具有多種生物學活性，除對免疫細胞有活化、促增殖和分化等作用外，對某些非腫瘤細胞和大多數腫瘤細胞具有誘導凋亡(Apoptosis)的作用。當機體處于炎癥如病毒、細菌、寄生蟲感染，或創傷等病理狀態時，這些作用對清除受損細胞、維持機體內環境平衡，起著重要的作用。而TNF和IL-6基因型不同，腫瘤壞死因子、白介素6等細胞因子的分泌量明顯不同，這對醫學研究和新藥開發、評價以及個體化治療等具有重要意義(Anesth Analg 2003；97944-949)。因此對檢測TNF和IL-6基因型方法的研究備受關注。但目前測定TNF和IL-6基因型的方法主要采用聚合酶鏈式反應-限制性片斷長度多態性(PCR-RFLP)、手工或自動測序、序列特異性引物PCR等方法，不僅操作繁瑣，檢測周期長，而且影響檢測結果的因素多，不易控制，難以滿足實際應用的要求，使藥物研究單位和臨床至今還無法廣泛開展有關TNF和IL-6基因型的檢測。
基因芯片是近幾年在高科技領域內出現的最具時代特征的重大科技進展之一。它是將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產物等)，有序固定在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團修飾的載玻片或硅片、尼龍膜、硝酸纖維素膜)上形成陣列，通過與實際樣本(或擴增產物)進行雜交反應，只需一次實驗，就可高通量獲得所有待檢基因的信息。這種平行檢測、高信息通量的特點使其在基因表達、基因多態性檢測等方面的應用受到廣泛重視。用基因芯片檢測TNF和IL-6基因型，發揮基因芯片檢測操作簡單、結果準確的特點，對于藥物研究單位和臨床的相關應用具有重要的現實意義。
發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種用于檢測腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)基因型的基因檢測芯片。
本發明提供一種用基因檢測芯片檢測腫瘤壞死因子(TNF)、白介素6(IL-6)基因型的檢測方法本發明提供的基因芯片，包括固相支持物和有序固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包含以下序列或其互補序列中的包括TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)突變位點在內的14-20個連續核苷酸TNF-α/-308GataggttttgaggggcatgGggacggggttcagcctcca(SEQ ID NO1)TNF-α/-308AataggttttgaggggcatgAggacggggttcagcctcca(SEQ ID NO2)TNF-α/-238GcagaagacccccctcggaatcGgagcagggaggatggggagt(SEQ ID NO3)TNF-α/-238AcagaagacccccctcggaatcAgagcagggaggatggggagt(SEQ ID NO4)IL-6/-597GaactgcacgaaatttgaggGtggccaggcagttctacaac(SEQ ID NO5)IL-6/-597AaactgcacgaaatttgaggAtggccaggcagttctacaac(SEQ ID NO6)IL-6/-572GccaggcagttctacaacagccGctcacagggagagccagaac(SEQ ID NO7)IL-6/-572CccaggcagttctacaacagccCctcacagggagagccagaac(SEQ ID NO8)IL-6/-174GcttttccccctagttgtgtcttgcGatgctaaaggacgtcacatt(SEQ ID NO9)IL-6/-174CcttttccccctagttgtgtcttgcCatgctaaaggacgtcacatt(SEQ ID NO10)為了增強檢測信號的強度，提高檢測結果的準確率，所述TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)突變位點序列中大寫字母表示的堿基最好位于所述探針的中部。
所述探針還可以在其5′端包含一段氨基修飾的16聚的聚脫氧胸苷酸(聚dT)。
所述固相支持物可采用各種基因芯片領域的常用材料，如但不限于尼龍膜，經活性基團修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。
上述修飾的玻片或硅片的活性基團如但不限于醛基、氨基、異硫氰酸基等，優選醛基修飾的玻片或硅片。
本發明基因芯片的制備可按照生物芯片的常規制造方法進行。例如，如果固相支持物采用的是修飾玻片或硅片，探針的5′端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發明的基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其制備方法也可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.L.Derisi，V.R.Iyer，P.O.Brown.Exploring themetablic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997，278680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京化學工業出版社，2000，1-130。
本發明還提供了一種非以診斷為目的檢測TNF-α和IL-6基因型的方法，包括以下步驟(1)制備染色體DNA；(2)用聚合酶鏈反應(PCR)方法擴增TNF和IL-6基因中包含TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)等的基因片段；(3)標記上述擴增產物；(4)將上述標記的擴增產物與基因芯片雜交；(5)檢測基因芯片的雜交信號。
制備用于PCR擴增的染色體DNA的方法有很多，可以從全血中制備、也可以從發根中制備，還可以從口腔粘膜的脫落物中制備。具體方法可參閱文獻(丁振諾，蘇明權主編.《臨床PCR基因診斷技術》，世界圖書出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法擴增染色體基因特定片段的方法已經是本領域公知技術。其中的關鍵在于引物設計，有關引物設計的方法、軟件均可以從商業途徑獲得。本發明涉及的TNF和IL-6基因的擴增引物和體系可根據以上方法及有關文獻(KB穆里斯，F.費里，R.吉布斯等主編《PCR聚合酶鏈式反應》，科學出版社)方法由使用者獨立完成。
對擴增產物進行標記可以通過采用5′端帶標記基團的引物進行擴增的方法，也可通過在擴增過程中摻入帶標記基團的單核苷酸的方法加以實現，所述標記基團包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。這些標記及其標記方法以及各標記物的檢測方法都已是本領域眾所周知的常規技術，也可以參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主編，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，1995年；馬立人，蔣中華主編，《生物芯片》，北京化學工業出版社，2000，1-130。
擴增產物的變性可采用常規變性方法如加熱至94～98℃，并保溫2～10min，然后迅速置冰上。
取適量變性的擴增產物加入雜交緩沖液中與基因芯片雜交。與基因芯片雜交時，可以先將基因芯片與預雜交緩沖液進行預雜交。
本發明擴增產物與基因芯片之間的固相雜交按照本領域的經典方法進行，本領域一般人員依據經驗容易確定有關緩沖液、探針和樣品濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。或者也可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.薩姆布魯克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主編，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，1995年。
然后根據標記信號在基因芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。本發明所述檢測基因芯片雜交信號的方法是基于與抗生物素抗體或親合素或鏈親合素或抗地高辛抗體或抗熒光素抗體復合在一起的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶催化的四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)或四甲基聯苯胺(TMB)的顯色反應。具體方法可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》。若擴增產物用熒光基團標記，也可以直接用熒光檢測設備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray3000等)獲取待測信息。
本發明還提供一種用于檢測TNF和IL-6基因型的試劑盒，該試劑盒包含本發明所說的基因芯片和使用說明書，使用說明書包含非以診斷為目的檢測TNF-α和IL-6基因型的方法及上述現有技術的相關內容。
本發明提供的基因芯片及其試劑盒，可用于檢測TNF和IL-6基因型，這對于藥物研究單位和臨床有針對性的治療等相關應用提供了一種簡便易行的解決方案。
圖1本發明基因芯片上的一種點樣列陣；圖2用本發明基因芯片檢測TNF和IL-6基因型所得結果的照片。
具體實施方式
以下實施例是對本發明的更詳細的說明，而不是對本發明范圍的限定。
實施例1基因芯片的制備(1)購置醛基修飾的載玻片(產品編號BSM03011，上海百傲科技有限公司)。人工合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)以下探針，用水溶解成(100pmol/ul)濃度，然后用2×點樣buffer(產品編號BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接著，用Affymetrix公司的GMS417點樣儀按說明書所述方法點制如圖1的陣列。然后室溫放置過夜。
其中各探針序列為TNF-α/-308GNH2-5’-tttttttttttttttt-cccgtccCcatgcc-3’ (14聚)(SEQ ID NO11)TNF-α/-308ANH2-5’-tttttttttttttttt-cccgtccTcatgccc-3’ (15聚)(SEQ ID NO12)TNF-α/-238GNH2-5’-tttttttttttttttt-cctgctcCgattccga-3 (16聚)SEQ ID NO13)TNF-α/-238ANH2-5’-tttttttttttttttt-ccctgctcTgattccga-3 (17聚)(SEQ ID NO14)IL-6/-597GNH2-5’-tttttttttttttttt-aaatttgaggGtggccag-3’ (18聚)(SEQ ID NO15)IL-6/-597ANH2-5’-tttttttttttttttt-aatttgaggAtggccagg-3’ (18聚)(SEQ ID NO16)IL-6/-572GNH2-5’-tttttttttttttttt-caacagccGctcacagg-3’(17聚)(SEQ ID NO17)IL-6/-572CNH2-5’-tttttttttttttttt-caacagccCctcacagg-3’(17聚)(SEQ ID NO18)IL-6/-174GNH2-5’-ttttttttttttttaa-tgtgtcttgcGatgctaaag-3’(20聚)(SEQ ID NO19)IL-6/-174CNH2-5’-ttttttttttttttaa-tgtgtcttgcCatgctaaag-3’(20聚)(SEQ ID NO20)實施例2染色體DNA的制備取待檢者全血500μl，用一次性無菌注射針頭抽取，收集于含50ul的2％EDTA溶液的無菌1.5ml離心管中，將管蓋蓋上，上下顛倒數次，使混勻。取無菌的1.5ml離心管，向其中加入混勻的待檢全血100μl和純水300μl，充分混勻，室溫靜置8分鐘；將離心管置離心機中，6000g離心1分鐘；取出離心管，傾去上清液，離心管底部可見少量白色沉淀；向離心管中加入抽提液(產品編號BST01010，上海百傲科技有限公司)60μl，充分振蕩使沉淀溶解；沸水浴中15分鐘；取出離心管，置離心機中，12,000g離心15分鐘。離心后上清液可直接用于PCR擴增。
實施例3用PCR方法擴增HLA-B基因片段委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成以下引物TNF上游引物 Biotin-5’-tccctccaaccccgttttct-3’TNF下游引物 5’-catctggaggaagcggtagtgg-3’IL-6上游引物5’-cacactccacctggagacgcc-3’IL-6下游引物5’-Biotin-agcgggtggggctgattgga 3’然后用水溶解并稀釋至10pmol/μl。將購置的Taq酶(產品編號Lot，CE1101-1，TaKaRa)、10×緩沖液(產品編號Lot，A2401-2，TaKaRa)、dNTP(產品編號D0056，上海生工生物工程技術服務有限公司)、純水以及實施例2獲得的PCR擴增模板按以下配方配制PCR擴增體系
用PCR擴增儀Tc-25/H(杭州大和熱磁電子有限公司)按以下程序擴增94℃，5min，然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40個循環，最后72℃5min。
實施例4PCR產物與基因芯片的雜交采用上海百傲科技有限公司的芯片雜交試劑盒與芯片顯色試劑盒進行此雜交試驗。所述芯片雜交試劑盒(產品編號BST05010，上海百傲科技有限公司)包含預雜交液，雜交緩沖液，洗液1，反應艙。所述芯片顯色試劑盒(產品編號BST06010，上海百傲科技有限公司)包含抗體液，洗液2，洗液3，顯色液。
(1)將實施例1的基因芯片用預雜交液預雜交5min，然后除去預雜交液。芯片的預雜交溫度為39℃。
(2)將實施例3獲得的PCR擴增產物混合后先98℃變性5min，然后取10μl加至190μl雜交緩沖液中混勻，與預雜交完畢的基因芯片進行30分鐘雜交反應，雜交溫度為39℃。
(3)將雜交完畢的基因芯片用已預熱至雜交溫度的洗液1洗兩次，每次10分鐘；(4)然后用洗液2室溫洗2分鐘；(5)將基因芯片與抗體液室溫反應20分鐘；(6)然后將基因芯片用洗液2室溫洗5分鐘，再重復此步驟一次；再用洗液3室溫洗2分鐘。
(7)在基因芯片上加顯色液200μl，39℃放置40分鐘。然后用水沖洗干凈，晾干。
實施例5基因芯片雜交信號的檢測將雜交并洗滌完畢的基因芯片置于Baio BE3.0生物芯片識讀儀(BSE01021，上海百傲科技有限公司)上掃描后得到如圖2所示的檢測結果。結果表明受檢者的TNF和IL-6基因型為TNF-α/-238 G/A，TNF-α/-308G，IL-6/-174C，IL-6/-572G，IL-6/-597G。檢測結果經測序結果驗證完全符合。
序列表<110>濟南市中心醫院<120>一種細胞因子基因型檢測芯片及其用途<140>
<141>
<160>20<170>Patent In3.1<210>1<211>39<212>DNATNF-α/-308Gataggttttg aggggcatgg ggacggggtt cagcctcca 39<210>2<211>39<212>DNATNF-α/-308Aataggttttg aggggcatga ggacggggtt cagcctcca 39<210>3<211>42<212>DNATNF-α/-238Gcagaagaccc ccctcggaat cggagcaggg aggatgggga gt 42<210>4<211>42<212>DNATNF-α/-238Acagaagaccc ccctcggaat cagagcaggg aggatgggga gt 42<210>5<211>40<212>DNAIL-6/-597Gaactgcacga aatttgaggg tggccaggca gttctacaac 40<210>6<211>40<212>DNAIL-6/-597Aaactgcacga aatttgagga tggccaggca gttctacaac 40<210>7<211>42<212>DNAIL-6/-572Gccaggcagtt ctacaacagc cgctcacagg gagagccaga ac42<210>8<211>42<212>DNA
IL-6/-572Cccaggcagtt ctacaacagc ccctcacagg gagagccaga ac 42<210>9<211>45<212>DNAIL-6/-174Gcttttccccc tagttgtgtc ttgcgatgct aaaggacgtc acatt 45<210>10<211>45<212>DNAIL-6/-174Ccttttccccc tagttgtgtc ttgccatgct aaaggacgtc acatt 45<210>11<211>30<212>DNATNF-α/-308GNH2-5’-tttttttttt ttttttcccg tccccatgcc-3’<210>12<211>31<212>DNATNF-α/-308ANH2-5’-tttttttttt ttttttcccg tcctcatgcc c-3’<210>13<211>32<212>DNATNF-α/-238GNH2-5’-tttttttttt ttttttcctg ctccgattcc ga-3<210>14<211>33<212>DNATNF-α/-238ANH2-5’-tttttttttt ttttttccct gctctgattc cga-3<210>15<211>34<212>DNAIL-6/-597GNH2-5’-tttttttttt ttttttaaat ttgagggtgg ccag-3’<210>16<211>34<212>DNAIL-6/-597ANH2-5’-tttttttttt ttttttaatt tgaggatggc cagg-3’<210>17<211>33<212>DNAIL-6/-572GNH2-5’-tttttttttt ttttttcaac agccgctcac agg-3’<210>18<211>33<212>DNA
IL-6/-572CNH2-5’-tttttttttt ttttttcaac agcccctcac agg-3’<210>19<211>36<212>DNAIL-6′-174GNH2-5’-tttttttttt ttttaatgtg tcttgcgatg ctaaag-3’<210>20<211>36<212>DNAIL-6/-174CNH2-5’ -tttttttttt ttttaatgtg tcttgccatg ctaaag-3’
權利要求
1.一種用于檢測腫瘤壞死因子TNF-α、白介素IL-6基因型的基因芯片，包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的寡核苷酸探針，其特征在于所述寡核苷酸探針包含以下序列或其互補序列中的包括TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)突變位點在內的14-20個連續核苷酸TNF-α/-308GataggttttgaggggcatgGggacggggttcagcctccaTNF-α/-308AataggttttgaggggcatgAggacggggttcagcctccaTNF-α/-238GcagaagacccccctcggaatcGgagcagggaggatggggagtTNF-α/-238AcagaagacccccctcggaatcAgagcagggaggatggggagtIL-6/-597GaactgcacgaaatttgaggGtggccaggcagttctacaacIL-6/-597AaactgcacgaaatttgaggAtggccaggcagttctacaacIL-6/-572GccaggcagttctacaacagccGctcacagggagagccagaacIL-6/-572CccaggcagttctacaacagccCctcacagggagagccagaacIL-6/-174GcttttccccctagttgtgtcttgcGatgctaaaggacgtcacattIL-6/-174CcttttccccctagttgtgtcttgcCatgctaaaggacgtcacatt。
2.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述TNF-α/-308(G/A)、TNF-α/-238(G/A)、IL-6/-597(G/A)、IL-6/-572(G/C)和IL-6/-174(G/C)突變位點序列中大寫字母表示的堿基位于所述探針的中部。
3.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述探針的5′端還包含一段氨基修飾的16聚的聚脫氧胸苷酸。
4.如權利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述固相支持物是醛基修飾的玻片或硅片。
5.一種非以診斷為目的檢測腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-6基因型的方法，包括以下步驟(1)制備染色體DNA；(2)用聚合酶鏈反應方法擴增TNF-α和IL-6基因中包含TNF-α/-308(G/A)，TNF-α/-238(G/A)，IL-6/-597(G/A)，IL-6/-572(G/C)，IL-6/-174(G/C)的基因片段；(3)標記上述擴增產物；(4)將上述標記的擴增產物與基因芯片雜交；(5)檢測基因芯片的雜交信號。
6.如權利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟(5)中檢測雜交信號的方法選自堿性磷酸酶催化的四氮唑藍顯色反應，辣根過氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽顯色反應或辣根過氧化物酶催化的四甲基聯苯胺顯色反應。
7.一種用于檢測腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-6基因型的試劑盒，該試劑盒包含權利要求1所述的基因芯片和包含權利要求5所述方法的使用說明書。
全文摘要
本發明提供了一種用于檢測TNF和IL－6基因型的基因芯片，包含該基因芯片的試劑盒和使用該芯片或試劑盒檢測TNF和IL－6基因型的方法。本發明的產品和方法可用于檢測上述基因的基因型，為預測與上述基因有關的疾病發生危險提供必要信息，同時也為相關藥物的開發和評價提供必要手段。
文檔編號C12Q1/68GK1661086SQ200410036479
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月10日 優先權日2004年12月10日
發明者汪運山, 賈堂宏, 朱濱, 孫悅, 張雨 申請人:濟南市中心醫院, 上海百傲科技有限公司