一種防治土壤病蟲害的復合菌劑與有機菌肥的發酵與制備的制作方法

專利名稱：一種防治土壤病蟲害的復合菌劑與有機菌肥的發酵與制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及防治植物土傳真菌與細菌性病害及根部線蟲與蛆類，能夠抗重茬并促進植物生長的復合共生的“功能菌液-SS”及生物有機的“功能菌肥-SS”的制備與發酵工藝。
植物的土傳病蟲害(包括真菌、細菌、線蟲、韭蛆等)一直是農業生產中比較難防治的種類，如枯黃萎病的危害使得大豆、西瓜等不能夠重茬或迎茬種植，溫室種植黃瓜、番茄3-5年以后由于線蟲的嚴重危害只好廢棄。由于缺乏能夠有效地防治韭蛆的藥劑，劇毒化學農藥在韭菜、蔥蒜類上的施用屢禁不止，不僅污染生態環境，更危害人類自身的健康。根據自然生態系統中生物間相生相克的平衡理論，在植物土傳病蟲害發生比較嚴重的農田生態系統中，可能存在能夠相抗并抑制該類土傳病蟲害的復合共生的“功能菌群”。
本發明的目的在于以植物根際微生物生態系統理論為基礎，以現有的3個菌株〔分別為蠟狀芽胞桿菌ACCC11077(中國科學院微生物所AS1.0230)、地衣芽胞桿菌ACCC11106(中國科學院微生物所AS1.1216)、枯草芽胞桿菌ACCC11088(中國科學院微生物所AS1.0933)，保藏于中國微生物菌種管理委員會農業微生物中心，中國農業菌種目錄，2001年版，中國農業科技出版社，4～7頁〕為基礎，經過實驗室的生物測定與田間的實際應用，配制出防治植物土傳真菌與細菌性病害及根部線蟲與蛆類，能夠抗重茬并促進植物生長的復合共生的“功能菌液-SS”，再以有機載體(腐殖酸銨、草炭粉、污泥粉)為吸附劑制成生物有機的“功能菌肥-SS”，并提供這種菌肥的配制與發酵工藝。
復合共生的“功能菌群”可以是真菌、細菌等各式各樣的共生菌群，由于考慮到這些菌抗逆境的生物學特性，以及產品生產、保藏、運輸的便利性，本發明所采用的為抗逆性較強的芽孢桿菌類(Bacillus)菌株。
本發明的特征在于包括復合共生的“功能菌液-SS”及生物有機的“功能菌肥-SS”的制備與發酵工藝。
一、復合共生的“功能菌液-SS”的培養方法1、速生營養肉汁培養基的制備培養基配方蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈創木酚鈉(促進菌落快速良好生長)-1毫升；MgSO4·7H2O-0.2克；KCl-0.2克；(NH4)H2PO4-1克；酒石酸鈉-0.09克；鉬酸銨-0.035克；FeCl2-0.098克；ZnSO4-0.8克；MnCl2-0.07克；CaCl2-0.3克；CuSO4-0.2克；NaHCO3-20毫克；MnSO4-5毫克；營養瓊脂-20克；添加蒸餾水至1000毫升；PH值6.5-7.5；121℃高壓滅菌30分鐘。取出冷卻至60℃左右，在超潔凈工作臺上，于無菌條件下倒入滅過菌的培養皿中，分別將蠟狀芽胞桿菌ACCC、地衣芽胞桿菌ACCC、枯草芽胞桿菌ACCC轉到速生營養肉汁培養基中培養，于30℃培養箱中培養72小時，然后進行生物測定。
2、生物測定將培養好的蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088分別制成濃度為100萬/毫升的菌液100毫升，然后各取25毫升以1∶1∶1的比例配成混合菌液。將配好的上述菌液，分別接種于涂有濃度適中的不同病原指示菌培養基上培養，測定對各種作物土傳病害的抑菌活性。將從田間采集到的鮮活線蟲與韭蛆，分別于配好的上述3種菌液及混合菌液中浸蘸3秒鐘，然后在30℃室溫中飼養，測定對線蟲與韭蛆的殺蟲效果。(抑菌活性與殺蟲效果見表1)。
表1、ACCC、ACCC、ACCC的抗菌活性與殺蟲效果病蟲名稱 ACCC11077 ACCC11106 ACCC11088 混合菌液大豆枯、黃萎病Fusarium oxysporum ++++ +++++++ +++++F.graminearum +++++++ +++ ++++Pythium ultimum ++++ ++++ +++++ +++++Rhizoctonia solani ++++++++ +++ ++++西瓜枯、黃萎病F.oxysporium f.sp niveum+++++++ +++ +++++F.oxysporium f.sp melom ++++ +++++++ ++++F.bulbigenum var.nireum ++++ ++++ +++ +++++番茄枯、黃萎病F.oxysporum f.sp Lycopersici++++ ++++ ++++ +++++Verticillium alb-atrum +++++++++ ++++辣椒疫病Colletotrichum capasici +++++++ ++++ +++++蘋果根腐病Helicobasidium mompa++++ ++++ +++ +++++大豆胞囊線蟲Heterodera glycines 83.5％ 75.3％ 78.2％98.2％黃瓜根結線蟲Meloidogyne Goeld 82.2％ 71.2％ 76.5％96.7％小麥粒線蟲Anguina tritici 75.3％ 78.5％ 82.2％95.3％韭蛆(遲眼蕈蚊幼蟲)Bradysia odoriphaga 81.6％ 73.9％ 78.5％97.6％注“+”表示抑菌圈直徑(mm)；+10.0-15.0；++15.0-20.0；+++20.0-25.0；++++25.0-30.0；+++++30.0以上從表1可以看出蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088本身抑菌活性與殺蟲效果不是很高，但是經過混合以后，三者發揮復合共生的作用，共同抑菌殺蟲的效果得到了顯著的提高。
3、拮抗試驗將蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088分別兩兩組合，在速生營養肉汁培養基上，兩點放置相距4cm，每個組合重復三次，進行交叉拮抗試驗，結果表明三者相互之間不存在拮抗，能夠共同生長。將三者以1∶1∶1的比例混合配制成復合共生的“功能菌液”，然后在速生營養肉汁培養基上共同培養，試驗表明三者能夠共同均勻地生長形成一個“復合共生系統”。
4、菌種的培養與保藏分別將蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088接種于速生營養肉汁培養基中單獨培養，然后劃線接種于斜面試管的速生營養肉汁培養基中，在30℃下培養72小時后，在長好菌的斜面試管中倒入滅菌液體石蠟，液面高出培養基2cm，然后直立置于4℃冰箱中保存，每半年轉管復壯一次。
5、菌株的鑒定ACCC11077是芽孢桿菌屬的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，生物學特性菌體直桿狀、成鏈，光學顯微鏡下長2.5-4.5微米，寬0.8-1.0微米，革蘭氏反應陽性；芽孢近中生，近圓形，芽孢囊不膨大，原生質內含不著色顆粒，而且含量較大；菌落近橢圓形，直徑0.5-1.2cm，邊緣不整齊，無隆起，無光澤，不透明，蠟質；生長溫度15℃-50℃，最適溫度30℃-35℃，適宜PH6.0-7.5；能厭氧生長，PH5.7生長，接觸酶陽性，碳水化合物產氣陽性，不產生吲哚，苯丙氨酸脫氨酶陰性，液體培養形成菌膜；V.P反應陽性，V.P液培養后PH為4.5-6.0；7％NaCl中生長，適宜碳源為葡萄糖、蔗糖，適宜氮源為蛋白胨、牛肉膏，無機氮源為NH4+，發酵葡萄糖、麥芽糖產酸，發酵木糖、乳糖、甘露醇不產酸，水解淀粉，利用檸檬酸鹽，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能產生蛋白酶和溶菌酶。
ACCC11106是芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，生物學特性菌體直桿狀、成鏈，光學顯微鏡下長3.0-4.5微米，寬1.0-1.2微米，革蘭氏反應陽性；芽孢近中生，近橢圓形，芽孢囊不膨大，原生質內無不著色顆粒；菌落近橢圓形，直徑0.3-0.5cm，中間微凸起，邊緣不整齊，微隆起，菌落無光澤，不透明；生長溫度15℃-47℃，最適溫度28℃-32℃，接觸酶陽性，V.P陽性，V.P液生長后PH5.5-6.0；能厭氧生長，PH5.7生長，7％NaCl中生長，碳水化合物不產氣；適宜碳源為麥芽糖、蔗糖，適宜氮源為蛋白胨、牛肉膏；水解淀粉，利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能產生幾丁質酶。
ACCC11088芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，生物學特性菌體直桿狀，光學顯微鏡下長2.5-3.5微米，寬0.8-1.0微米，革蘭氏反應陽性；芽孢近圓形，近中生，芽孢囊不膨大，原生質內沒有不著色顆粒；菌落近圓形，直徑0.6-0.8cm，中間微凹無褶皺，邊緣不整齊，有隆起，不透明，乳黃色；生長溫度10℃-50℃，最適溫度28℃-32℃，PH4-9都能生長，最適PH為6.5-8；好氧，不能厭氧生長，PH5.7生長，7％NaCl生長；石蕊牛奶不產酸，過氧化氫酶反應產氣，接觸酶陽性；V.P反應陽性，V.P液生長后PH6.0，利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇產酸，抗溶菌酶，不抗疊氮化鈉，水解淀粉，利用檸檬酸鹽，不利用丙酸鹽，水解淀粉，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，能產生蛋白酶。
(B.E.布坎南和N.E.吉本斯等，伯吉細菌鑒定手冊第八版)二、“功能菌液-SS”與“功能菌肥-SS”的制備與發酵工藝1、菌液的制備速生營養肉汁培養液配方蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈創木酚鈉(促進菌落快速良好生長)-1毫升；MgSO4·7H2O-0.2克；KCl-0.2克；(NH4)H2PO4-1克；酒石酸鈉-0.09克；鉬酸銨-0.035克；FeCl2-0.098克；ZnSO4-0.8克；MnCl2-0.07克；CaCl2-0.3克；CuSO4-0.2克；NaHCO3-20毫克；MnSO4-5毫克；營養瓊脂-3克；添加蒸餾水至1000毫升；PH值6.5-7.5。
按上述配方將速生營養肉汁培養基配制好后，倒入三角搖瓶中，然后121℃高壓滅菌30分鐘，待冷卻后在超潔凈工作臺上，在無菌操作的條件下，將保存培養的蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088三個菌株各自配成菌液，分別接種到三角搖瓶中，每瓶接種比例為3％，在30℃條件下于搖床上振蕩培養72小時后，將三個菌株的菌液以1∶1∶1的比例混合搖勻，然后以3％的比例接種到發酵罐。
2、“功能菌液-SS”的發酵發酵罐速生營養液配方黃豆粉-3％；魚粉-2％；玉米粉-1％；蔗糖-0.3％；甘油-0.2％；酵母片-0.1％；10％鈣鎂磷肥溶液-2％；10％草木灰水上清液-1％；NaCO3-0.02％；NaCl-0.5％；5-硝基愈創木酚鈉(促進菌落快速良好生長)2ppm；營養瓊脂-3％；PH值6.5-7.5。
空罐在125℃/0.15Mpa壓力下滅菌30分鐘，裝料后在121℃/0.12Mpa下滅菌2小時。冷卻至30℃后按3％的比例接種；培養溫度30℃，24小時后增至35℃，48小時后降至32℃；通氣量開始在1∶1(v.v.m)，培養24小時后增至1∶1.5(v.v.m)，48小時后降至1∶1.2(v.v.m)。發酵至72小時發酵完畢，經過鏡檢蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088的比例在1∶1∶1左右，含菌量達到80-100億/毫升時為合格產品。
發酵液可直接裝袋包裝制成復合共生的“功能菌液-SS”；發酵液以有機載體(腐殖酸銨、草炭粉、污泥粉)為吸附劑制成生物有機的“功能菌肥-SS。
3、“功能菌肥-SS”的配制吸附劑的制備將腐殖酸、草炭、污泥粉按2∶3∶5的比例混配，再加入千分之一的5-硝基愈創木酚鈉混勻，經121℃高溫高壓滅菌30分鐘。
營養液的制備尿素-20kg；磷酸二氫鉀-30kg；硫酸鉀-20kg；鉬酸銨-0.1kg；硫酸鎂0.1kg；檸檬酸鐵0.1kg；硫酸鋅0.1kg；硼酸0.1kg；加入100升水中溶解均勻后，經121℃高溫高壓滅菌30分鐘。
菌肥的配制將滅菌后溫度降至30℃的吸附劑800kg加入攪拌裝置的容器內，加入100升營養液，加入100升菌液，以每分鐘250-300轉的速度攪拌10分鐘，直至攪拌均勻，即為生物有機的“功能菌肥-SS”，該菌肥經過鏡檢蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088的比例在1∶1∶1左右，總含菌量在5-8億個/克，雜菌數＜100個/克時為合格產品。
本發明的工藝流程詳見附

圖1。
三、“功能菌液-SS”與“功能菌肥-SS”的施用方法1、拌種每畝用30-50毫升菌液，加5倍的水均勻噴灑于種子表面，噴灑的過程中不斷的翻動，使菌液均勻粘附于種子表面，稍晾干后即可播種。
2、蘸根每畝根苗用30-50毫升菌液，按按每畝蘸根所需水量進行稀釋，然后將根苗均勻蘸上菌液，稍晾干即可栽植。
3、灌根每畝用30-50毫升菌液，稀釋1000倍左右，隨灌溉水少量不斷地均勻噴灑于水中，灌溉水灌勻整個地塊為止。
如若滴灌，可直接加入滴灌水中。
4、底肥采用條施、穴施的方法將菌肥均勻灑入條溝、穴內和種子或植株的根部附近，然后覆土，最好再配合灌水。
本“功能菌液-SS”與“功能菌肥-SS”適用于小麥、玉米、水稻、大豆、棉花、花生、西瓜、黃瓜、韭菜、辣椒、茄子、西紅柿、果樹等多種植物，尤其是在土壤病蟲害發生較嚴重的地塊使用效果更好，能夠顯著抑制土壤病蟲害，包括枯黃萎病、線蟲、韭蛆、根腐等。
防病機理初步研究表明，該復合菌株可以分泌抗菌蛋白、溶菌酶、幾丁質酶等，對真菌的分生孢子、細菌細胞、蟲蛆幾丁質有溶解作用，對土壤中的有機質有分解轉化的作用。施入土壤中可以迅速繁殖擴增，能夠將土壤中被固定的磷、鉀等元素轉化為可被植物吸收利用的速效磷、鉀，可以與根瘤固氮菌良好共生，促進植物對氮的吸收與利用。無毒無污染，不影響生態環境，在作物周圍土壤形成局部優勢，可以在土壤中長期存在，但菌量會逐步下降。
實施例1、對大豆枯、黃萎病的防效浸種處理對大豆枯、黃萎病的防效苗期為100％，成株期為97.2％，田間灌根防效為83.6％，以菌肥做底肥防治效果為94.5％，增產26.2％。
實施例2、對西瓜枯、黃萎病的防效浸種與蘸根處理對西瓜枯萎病苗期防效為100％，成株期防效96.4％，田間灌根防效為88.7％，以菌肥作底肥防治效果為95.6％，增產26.8％。
實施例3、對大豆線蟲的防效浸種處理對大豆線蟲苗期的防效為100％，成株期防效為95.3％，田間灌根防效為85.8％，以菌肥作底肥防治效果為95.6％，增產28.5％。
實施例4、對黃瓜線蟲的防效浸種與蘸根處理對黃瓜線蟲苗期的防效為100％，成株期防效為93.2％，田間灌根防效為84.5％，以菌肥作底肥防治效果為92.4％，增產25.3％。
實施例5、對韭菜韭蛆的防效田間灌根防治效果為87.9％，以菌肥作底肥防治效果為92.1％，增產27.8％。
實施實例6、對辣椒疫病的防效浸種與蘸根處理對辣椒疫病苗期的防治效果為100％，成株期防效為94.8％，田間灌根防效為90.3％，以菌肥作底肥防治效果為93.6％，增產23.5％。
權利要求
1.一種復合共生的“功能菌液-SS”，其特征在于該復合共生菌液由蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088三個菌株組成，其比例為1∶1∶1。
2.根據權利要求1的“功能菌液-SS”，所述的三個菌株是在速生營養肉汁培養基中培養，其中培養基的配方為蛋白胨-8克；NaCl-5克；牛肉膏-5克；葡萄糖-10克；酵母膏-5克；山梨醇-5克；0.2％的5-硝基愈創木酚鈉-1毫升；MgSO4·7H2O-0.2克；KCl-0.2克；(NH4)H2PO4-1克；酒石酸鈉-0.09克；鉬酸銨-0.035克；FeCl2-0.098克；ZnSO4-0.8克；MnCl2-0.07克；CaCl2-0.3克；CuSO4-0.2克；NaHCO3-20毫克MnSO4-5毫克；營養瓊脂-20克；添加蒸餾水至1000毫升。
3.根據權利要求1的“功能菌液-SS”，所述的三個菌株的發酵罐速生營養液配方是黃豆粉-3％；魚粉-2％；玉米粉-1％；蔗糖-0.3％；甘油-0.2％；酵母片-0.1％；10％鈣鎂磷肥溶液-2％；10％草木灰水上清液-1％；NaCO3-0.02％；NaCl-0.5％；5-硝基愈創木酚鈉-2ppm；營養瓊脂-3％。
4.采用如權利要求1所述的“功能菌液-SS”防治土傳病蟲害的用途，用于防治大豆與西瓜的枯黃萎病、大豆與黃瓜的線蟲病、韭蛆。
5.一種生物有機的“功能菌肥-SS”，其特征在于該菌肥是以如權利要求1所述的“功能菌液-SS”的發酵液以有機載體為吸附劑制成生物有機的“功能菌肥-SS”。
6.根據權利要求5的“功能菌肥-SS”，所述的有機載體為腐殖酸銨、草炭粉、污泥粉，三者的比例為2∶3∶5。
7.根據權利要求5的“功能菌肥-SS”，該菌肥營養液的制備方法為將尿素-20kg；磷酸二氫鉀-30kg；硫酸鉀-20kg；鉬酸銨-0.1kg硫酸鎂0.1kg；檸檬酸鐵0.1kg；硫酸鋅0.1kg；硼酸0.1kg；加入100升水中溶解均勻后，經121℃高溫高壓滅菌30分鐘。
8.采用如權利要求5所述的“功能菌肥-SS”防治土傳病蟲害的用途，用于防治大豆與西瓜的枯黃萎病、大豆與黃瓜的線蟲病、韭蛆。
全文摘要
本發明涉及一種復合共生的“功能菌液－SS”，該菌液由蠟狀芽胞桿菌ACCC11077、地衣芽胞桿菌ACCC11106、枯草芽胞桿菌ACCC11088三個菌株組成，其比例為1∶1∶1。“功能菌液－SS”的發酵液以有機載體為吸附劑可制成生物有機的“功能菌肥－SS”。本發明的“功能菌液－SS”與“功能菌肥－SS”均可防治大豆與西瓜的枯黃萎病、大豆與黃瓜的線蟲病、韭蛆等土傳病蟲害。
文檔編號C12N1/00GK1616648SQ20041003119
公開日2005年5月18日 申請日期2004年4月14日 優先權日2004年4月14日
發明者任承才, 荀云端, 朱莉 申請人:北京天地新生力生物技術有限公司