專利名稱：含有流動氣體層的高速液流緩沖系統及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種含有流動氣體層的高速液流緩沖系統及其應用，特別是在使用流式細胞技術進行細胞分選時，緩沖包含在高速液體流束或流滴內的細胞，使其免受其在下落時所遇液體或固體表面的撞擊造成的損傷。
背景技術：
流式細胞技術是液體在高速流動狀態下檢測、分析、分選的技術，它集電子技術、計算機技術、激光技術、流體理論于一體，是一種非常先進的檢測和細胞分選技術。流式細胞技術在功能水平上可對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選，它可以高速每秒分析幾萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，與傳統的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優點，成為當代最先進的細胞定量分析、分選技術。
對待測樣品進行分析分選時(見圖1)，首先將待測樣品中的細胞染色后制成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品經進樣管壓入流動室，不含細胞的緩沖液(稱作鞘液)在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過檢測區域。在檢測區域的上端裝有激光光源，經過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細胞在激光束的照射下，產生散射光和激發熒光，再通過模/數轉換，進行計算機處理。同時，在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測定細胞或微粒就分散在這些液滴之中，形成含有單細胞或微粒的液滴。將這些液滴充以正負不同的電荷，當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時，在高壓電場的作用下偏轉，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現細胞的分離。
該技術廣泛用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等研究領域。目前常用于白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定，免疫細胞分析計數、細菌鑒定、病毒感染細胞的識別、XY精子細胞分選等。
隨著分選技術和分選儀器的不斷改進，分選速度不斷加快，使含有細胞的液滴以很高的速度(百公里/小時)向下撞擊到樣品接收管的液體或固體表面，對細胞造成損傷，且這種損傷與液滴的流速呈正相關，顯著影響著活細胞的分選質量，因此，如何有效地減輕這種損傷程度，對流式細胞分選技術的應用和發展意義重大。
發明內容
本發明的目的是提供一種高速液流緩沖系統及其應用，特別是在使用流式細胞技術進行細胞分選時，緩沖包含在高速液體流束或液滴內的細胞，使其免受其在下落時所遇液體或固體表面的撞擊造成的損傷。
為實現上述目的，本發明采用了如下技術方案本發明在流式細胞儀的局部微環境內施加一流動氣體層，使高速下降的液滴在穿過流動氣體層時，一部分動能被氣流層吸收，使其下降速度減慢或使液滴成漂浮狀態，然后落下，從而顯著減輕對包含在液滴內的細胞在撞擊所遇液體或固體造成的損傷。
為使本發明更為有效，所述的流式細胞儀的局部微環境指在流式細胞儀液流系統中自噴嘴噴出的高速液體流束經超高頻電晶體振動變為液滴以下的部分，包括偏轉電極板和偏轉電極板以下和收集管的全部。
本發明所述的流動氣體層的氣流方向為液體流束和液滴的流動方向的任意方位，即前后左右上下及其夾角。
本發明所述的流動氣體的流動形式為但不限于層流、反流、渦流、軸流、對流。
為了不影響流式細胞儀的分選效率，本發明在流動氣體層的上方施加氣流遮蓋板，使氣流盡可能少地進入遮蓋板的上方，從而保證氣流不影響遮蓋板的上方來自于流式細胞儀的液體流束和液滴在流經偏轉電極板和偏轉電極板以上部分的運動軌跡。
本發明由于采用了上述設計，來自于流式細胞儀液流系統的高速液體流束或液滴在經過局部微環境內流動氣體層時，產生一角向的切力或作用力，從而減弱了高速液體流束或液滴上所帶有的面向樣品收集管方向的動能，使其下降速度減慢，從而減輕了液體流束或液滴內的細胞在樣品收集管內液體或固體表面的撞擊損傷。
本發明具有結構簡單，造價低廉，使用方便等特點，是一種提高采用流式細胞技術進行細胞分選的有效方法，具有良好的應用前景。
下面結合附圖對本發明的實施例做進一步說明
圖1為流式細胞儀工作原理示意示意2為實施例層流結構測面示意3為實施例層流結構底部示意4為實施例反流結構測面示意5為實施例反流結構底部示意6本發明對分選后細胞活力的影響具體實施方式
實施例一、含有層流流動氣體層的高速液流緩沖系統的制作如圖2，圖3所示，本發明包括下層半月氣流環1和位于其上方對側的上層半月氣流環2、與下層半月氣流環1相通的下層通氣管3、與上層半月氣流環2相通的上層通氣管4、與上下層通氣管相連的通氣主管5、位于樣品收集管外與通氣主管5相連的氣流發生器-氣泵6、位于氣流層上方呈漏斗狀的氣流遮蓋板7、以及連接下層通氣管3與下層半月氣流環1的下層進氣口13、連接上層通氣管4與上層半月氣流環2的上層進氣口14和位于上下層氣流環內側的多個氣流噴出孔15組成。當氣泵6開啟時，氣流經通氣主管5、下層通氣管3、上層通氣管4、下層進氣口13、上層進氣口14分別進入下層半月氣流環1和上層半月氣流環2，然后經氣流噴出孔15噴出，分別形成下層氣流11和上層氣流12。當含有細胞的液滴10穿過上下氣流層時，對液滴形成側向的切力或作用力，使其向下的動能減弱，從而減輕了細胞下落時的撞擊損傷。使用時可通過調節氣泵6的氣流量，以保證氣流遮蓋板7上方的氣流不影響來自于流式細胞儀的液體流束和液滴的運動軌跡。同時，下層通氣管3和上層通氣管4采用不同的內徑，使其送出的氣流量不同，因而上下氣流層的流速也不同，形成差異的切向力，增加緩沖效果。8為樣品接收管，9為樣品接收管內的液體。
實施例二、含有反流流動氣體層的高速液流緩沖系統的制作如圖4，圖5所示，本發明包括右半月氣流環16和位于其對側的左半月氣流環17、與右半月氣流環16相通的右通氣管18、與左半月氣流環17相通的左通氣管19、與左右通氣管相連的通氣主管20、位于樣品收集管外與通氣主管20相連的氣流發生器-氣泵21、位于氣流層上訪呈漏斗狀的氣流遮蓋板22、以及連接右通氣管18與右半月氣流環16的右進氣口28、連接左通氣管19與左半月氣流環17的左進氣口29和位于左右氣流環下側(底部)的多個氣流噴出孔30組成。當氣泵21開啟時，氣流經通氣主管20、右通氣管18、左通氣管19、右進氣口28、左進氣口29分別進入右半月氣流環16和左半月氣流環17，然后經氣流噴出孔30噴出，分別形成向下氣流26和返回氣流27。當含有細胞的液滴25穿過氣流層時，與返回氣流27相遇，對液滴形成反方向的作用力，使其向下的動能減弱，從而減輕了細胞下落時的撞擊損傷。制做時可通過調節氣泵21的氣流量，以保證氣流遮蓋板22上方的氣流不影響來自于流式細胞儀的液體流束和液滴的運動軌跡。23為樣品接收管，24為樣品接收管內的液體。
實施例3、本發明高速液流緩沖系統對分選后細胞活力的影響1)實驗材料流式細胞儀，FACS Vantage SE，美國BD公司2)實驗方法(1)SP2/0骨髓瘤細胞采用美國ATCC產品，按常規法培養。實驗配制含10％胎牛血清的RPMI-1640(美國Hyclone公司產品)完全培養液，取出SP2/0骨髓瘤細胞凍存管，迅速融化復溫，加入培養基中，37℃，5％CO2培養至達良好的生長狀態，收集細胞，用新鮮培養液配制1×108細胞/ml懸液。用Hoechst 33342進行染色，然后將細胞懸液置流式細胞儀上，以磷酸緩沖液為鞘液，用365nm激光激發熒光，進行細胞分選。鞘液壓力為750Pa，進樣速度為50000次/秒，收集速度為25000個/秒。分選的目的細胞設定為所有已染色細胞。采用不加本發明的高速液流緩沖系統和加本發明的高速液流緩沖系統進行收集。收集到的細胞經離心濃縮，用完全培養液稀釋至1×106細胞/ml，37℃，5％CO2培養2小時，用臺盼藍液染色，顯微鏡下計數細胞存活百分率。
(2)精子細胞采用新鮮采集的牛精液，用含有3％的牛血清白蛋白和5％蛋黃的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖溶液稀釋至1×108細胞/ml，用Hoechst33342進行染色，然后將細胞懸液置流式細胞儀上，以磷酸緩沖液為鞘液，用365nm激光激發熒光，進行細胞分選。鞘液壓力為750Pa，進樣速度為50000次/秒，收集速度為25000個/秒。分選的目的細胞設定為所有已染色細胞。采用不加本發明的高速液流緩沖系統和加本發明的高速液流緩沖系統進行收集。收集到的細胞經離心濃縮，用含20％蛋黃的精液稀釋液(2.9％檸檬酸鈉，0.5％D-果糖)稀釋至1×106細胞/ml，室溫(25℃)靜置30分鐘，顯微鏡下計數直線運動精子細胞存活百分率。
3)實驗結果
如圖6所見，在鞘液壓力為750Pa的高壓下，含有流動氣體層的高速液流緩沖系統能使SP2/0骨髓瘤細胞的活力提高53％以上，使精子細胞的活力提高48％以上，說明本發明的流動氣體層可有效地減弱流式細胞儀上快速下降的液滴對細胞所造成的撞擊損傷。
權利要求
1.一種含有流動氣體層的高速液流緩沖系統，特別是在使用流式細胞技術進行細胞分選時，通過流動氣體緩沖包含在高速液體流束或液滴內的細胞，使所述的細胞免受在高速下落時與所遇液體或固體表面的撞擊造成的損傷。
2.根據權利要求1所述的緩沖系統，其特征在于在流式細胞儀的樣品接收系統內施加一流動氣體層，使高速下降的液滴在穿過流動氣體層時，一部分動能被氣流層吸收，使其下降速度減慢或使液滴成漂浮狀態，然后落下。
3.根據權利要求1所述的緩沖系統，其特征在于所述的流動氣體層的氣流方向為液體流束和液滴的流動方向的任意方位，即前后左右上下及其夾角。
4.根據權利要求2所述的流動氣體層，其特征在于所述的流動氣體層的作用部位在流式細胞儀液流系統中高速液體流束變為流滴以下的部分，包括偏轉電極板和偏轉電極板以下和收集管的全部。
5.根據權利要求2所述的流動氣體層，其特征在于所述的氣體流動形式為但不限于層流、反流、渦流、軸流、對流。
6.根據權利要求1所述的緩沖系統，其特征在于在所述流動氣體層的上方施加氣流遮蓋板，使氣流盡可能少地進入遮蓋板的上方，從而保證氣流不影響遮蓋板上方流式細胞儀的液體流束和液滴的運動軌跡。
全文摘要
本發明涉及一種含有流動氣體層的高速液流緩沖系統，特別是在使用流式細胞技術進行細胞分選時，通過流動氣體緩沖包含在高速液體流束或液滴內的細胞，使其免受其在下落時所遇液體或固體表面的撞擊造成的損傷。本發明可使經流式細胞儀分選的細胞活力提高40％以上，且具有結構簡單，造價低廉，使用方便等特點，是一種提高采用流式細胞技術進行細胞分選的有效方法，具有良好的應用前景。
文檔編號C12Q1/04GK1683552SQ20041003114
公開日2005年10月19日 申請日期2004年4月13日 優先權日2004年4月13日
發明者馬文·F·劉 申請人:馬文·F·劉