一種活性肽飼料添加劑及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：一種活性肽飼料添加劑及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種活性肽飼料添加劑，具體地說是涉及一種利用動、植物蛋白制造的活性肽(或寡肽)飼料添加劑及其制備方法。
背景技術：
自20世紀50年代以來，在動物飼養和飼料中廣泛使用抗生素、化學合成藥物、激素、β-興奮劑、重金屬、鎮靜劑等促生長保健劑，導致了如下的問題畜禽和水產產品中藥物殘留嚴重，直接危害人體健康；畜禽產品品質下降，缺乏市場競爭力和信任感；細菌耐藥性增強、耐藥菌株增多，威脅人類安全；破壞生態環境等。由于抗生素的諸多副作用，近二三十年來，科學家們一直在尋找抗生素的替代品，同時，近年來消費者對食品安全問題十分關注，因此，世界各國家都在紛紛禁用或限制抗生素的使用，并加速開發、推廣新型安全高效的綠色飼料添加劑，以減少或替代抗生素等藥物添加劑。
近些年的研究成果表明，生物活性肽是一種新型安全的，并在動物的生長發育和產品形成方面發揮著重要作用的飼料添加劑。但在飼料工業方面，目前國內市場上可見到是小肽或肽蛋白飼料，而不是真正意義上的活性肽飼料添加劑，其多為進口產品，由動物的小腸和腸粘膜加工而成的肽蛋白；或是含有一定量的小肽的肽蛋白飼料。雖然它們都能提高動物的生產性能，降低腹瀉率，但是大都存在以下缺陷(1)產品的添加量較大0.1～1.5％；(2)產品功能不明確，功效不明顯；(3)肽的分子量較大，一般為6000左右，仍然具有抗原性，對動物不利，易引起抗原過敏反應；(4)制備成本高或產品成本高，不適于動物養殖使用。這些產品主要用于代替飼料中的部分魚粉。
在活性肽飼料添加劑的制備方法上，傳統上，制備生物活性肽的方法主要是酶法，如使用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等植物蛋白酶，或是使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等動物蛋白酶，但容易產生令人難以接受的腥味或苦味，且生產成本高；其次是從原料中直接提取法，產率低、成本高；第三是由化學合成法得到，用于生產高價值的短鏈到中長鏈的藥理級肽，該法的缺點是成本高而且在反應過程中對健康和環境可能有害；第四，DNA重組技術法，該法因許多消費者反對使用由遺傳改性生物所生產的食物產品，并擔心有生物安全性和生物污染，而受到限制。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術制備活性肽飼料添加劑的添加量較大、產品功能不明確，功效不明顯，肽分子量較大仍然具有抗原性，易引起抗原過敏反應，和制備成本高不易于在動物養殖行業推廣使用的缺陷，從而提供一種在飼料中的添加量低、功能明確，具有提高動物對營養素(如蛋白質、礦物質、維生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋產量和生產能力，改善肉、蛋、奶的品質和風味，刺激動物免疫器官發育和提高抗病力和減少發病率，并能能明顯改善水產動物養殖水質，提高水產動物生長速度和存活率，廣泛用于禽、牛、羊、豬、水產和經濟動物，可作為抗生素的替代品等優點的活性肽飼料添加劑。
本發明的另一目的在于提供所述活性肽飼料添加劑的制備方法。
本發明的再一目的在于提供所述活性肽飼料添加劑的用途。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供的活性肽飼料添加劑，其為由如下制備方法將發酵底物經發酵、水解且水解度(DH％)控制在20～35％，并且經超高溫瞬時滅菌得到的蛋白水解液，所述的制備方法包括如下步驟1)制備種子液將芽孢桿菌、曲霉菌、青霉、放線菌中的一種或幾種，接入滅菌后的液體培養基中，于25～35℃培養24～48小時，得到種子液；所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，馬鈴薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生長因子1～2ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；所述的芽孢桿菌為臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或短小芽孢桿菌；所述的曲霉菌為黑曲霉菌、棲土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；所述的放線菌為綠色糖單孢菌、灰綠鏈霉菌或費式鏈霉菌；所述的青霉菌為紫微青霉、產黃青霉、蘋果青霉、淡黃青霉、臺灣青霉、杜邦青霉或藍棕青霉；2)發酵降解將發酵底物粉碎到60～120目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量份配比為100∶5～18，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶2～35，將發酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃滅菌10～30分鐘，冷卻到20～37℃，加入步驟1)得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3～1∶10，混合均勻后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入無菌空氣，以150～300rpm速度攪拌發酵，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到水解度達到20～35％，然后于140～145℃滅菌2～8秒，得到含活性肽的蛋白水解液，即為活性肽飼料添加劑；所述的發酵底物為選自植物蛋白或動物蛋白中的一種或幾種的混合物；所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆餅、碗豆蛋白、玉米蛋白、紅豆蛋白、小麥蛋白、大麥蛋白、棉籽粕或菜籽粕；所述的動物蛋白包括魚粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、動物廢棄臟器、蚯蚓蛋白粉、魷魚蛋白、魚皮或其它水產動物蛋白；所述的碳源包括玉米面、紅糖、食用白糖、玉米糖漿、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
用于制備本發明的活性肽飼料添加劑的方法還包括步驟3)和步驟4)所述步驟3)為蛋白水解液的離心除渣、超濾、濃縮將步驟2)得到的經滅菌的蛋白水解液再經5000～7000rpm連續離心分離10～30分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液；所述步驟4)為加載體吸附干燥或噴霧干燥加載體吸附干燥是將步驟3)得到的濃縮液，加到預先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽飼料添加劑；所述的載體由2～5重量份有機載體和3～5重量份無機載體組成；所述有機載體包括糠麩類和餅粕類有機載體；所述糠麩類有機載體為麥麩、玉米芯粉、脫脂稻殼粉和脫脂米糠中的一種或幾種的混合物；所述餅粕類有機載體為豆粕粉、豆餅粉和玉米蛋白粉中的一種或幾種的混合物；所述無機載體為輕質碳酸鈣、石粉、麥飯石和沸石粉中的一種或幾種的混合物；噴霧干燥是將步驟3)得到的濃縮液，按操作條件體積比加入0.3～1％糊精和2～8％輕質碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機上按進風100℃～130℃，出風60～80℃，噴壓1.8～2.3kg，流量1000～1500ml/min，進行噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑。
本發明提供的活性肽飼料添加劑的制備方法，包括如下步驟1)制備種子液將芽孢桿菌、曲霉菌、青霉、放線菌中的一種或幾種，接入滅菌后的液體培養基中，于25～35℃培養24～48小時，得到種子液；所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，馬鈴薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生長因子1～2ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；所述的芽孢桿菌為臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或短小芽孢桿菌；所述的曲霉菌為黑曲霉菌、棲土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；所述的放線菌為綠色糖單孢菌、灰綠鏈霉菌或費式鏈霉菌；所述的青霉菌為紫微青霉、產黃青霉、蘋果青霉、淡黃青霉、臺灣青霉、杜邦青霉或藍棕青霉；2)發酵降解將發酵底物粉碎到60～120目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量份配比為100∶5～18，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶2～35，將發酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃滅菌10～30分鐘，冷卻到20～37℃，加入步驟1)得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3～1∶10，混合均勻后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入無菌空氣，以150～300rpm速度攪拌發酵，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到水解度達到20～35％，然后于140～145℃滅菌2～8秒，得到活性肽飼料添加劑；所述的發酵底物為選自植物蛋白或動物蛋白中的一種或幾種的混合物；所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆餅、碗豆蛋白、玉米蛋白、紅豆蛋白、小麥蛋白、大麥蛋白、棉籽粕或菜籽粕；所述的動物蛋白包括魚粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、動物廢棄臟器、蚯蚓蛋白粉、魷魚蛋白、魚皮或其它水產動物蛋白；所述的碳源包括玉米面、紅糖、食用白糖、玉米糖漿、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
其制備方法還包括步驟3)和步驟4)所述步驟3)為蛋白水解液的離心除渣、超濾、濃縮將步驟2)得到的經滅菌的蛋白水解液再經5000～7000rpm離心10～30分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液；所述步驟4)為加載體吸附干燥或噴霧干燥加載體吸附干燥是將步驟3)得到的濃縮液，加到預先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽飼料添加劑；所述的載體由2～5重量份有機載體和3～5重量份無機載體組成；所述有機載體包括糠麩類和餅粕類有機載體；所述糠麩類有機載體為麥麩、玉米芯粉、脫脂稻殼粉和脫脂米糠中的一種或幾種的混合物；所述餅粕類有機載體為豆粕粉、豆餅粉和玉米蛋白粉中的一種或幾種的混合物；所述無機載體為輕質碳酸鈣、石粉、麥飯石和沸石粉中的一種或幾種的混合物；噴霧干燥是將步驟3)得到的濃縮液，按操作條件體積比加入0.3～1％糊精和2～8％輕質碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機上按進風100℃～130℃，出風60～80℃，噴壓1.8～2.3kg，流量1000～1500ml/min，進行噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑。
本發明提供的活性肽飼料添加劑具有以下功效或用途1.提高飼料利用率，降低生產成本。主要基于活性肽能提高動物對營養素(如蛋白質、礦物質、維生素等)吸收利用率，從而提高飼料的轉化利用率，減少禽類腿病和骨質疏松癥的發生。
2.促進動物生長，能提高生長速度。因活性肽能促進細胞的生長分化、增殖，進而促進動物的生長和長大。同時可減少動物皮下脂肪沉積，提高瘦肉率和出肉率，而且能提高基礎代謝率，促進動物微循環。
3.能顯著提高瘤胃中纖維素分解菌的數量，提高粗飼料的利用率，從而提高奶牛的產奶量和肉牛、肉羊的生長速度。
4.明顯提高蛋禽的產蛋率，延長產蛋高峰期，優化禽蛋中營養素結構和比例，降低膽固醇含量。
5.改善肉、蛋、奶的品質和風味，使味道更鮮、更香。
6.刺激動物免疫器官發育和提高抗病力，明顯提高畜禽成活率，降低死淘率。
7.具有明顯的抗氧化、抗衰老作用，提高種用動物體能和使用時間。
8.用于水產動物，能明顯的改善水質，提高魚苗的生長速度和存活率，增加蝦苗采食量和苗體長度。
該活性肽飼料添加劑的使用方法為(1)與飼料混合或拌料(含活性肽有效成分克/噸飼料)，仔豬、肉仔雞、牛仔、羔羊，80～120克；母豬、育肥豬、奶牛、肥育羊和牛，60～80克；產蛋雞、鴨、鵝60～80克；水產動物80～120克。
(2)也可直接口服或加入水中飲用。
本發明提供的活性肽飼料添加劑是一種綠色飼料添加劑，與已有技術相比具有以下優越性(1)此活性肽飼料添加劑在飼料中的添加量低，每噸飼料僅添加100克左右，是目前肽蛋白飼料的1/10；(2)該活性肽飼料添加劑的功能明確，具有如下的功能①可提高動物對營養素，如蛋白質、礦物質、維生素等重要營養素的吸收利用率，提高飼料利用率，減少禽類腿病和骨質疏松癥發生；
②可提高奶、肉、蛋產量和生產能力，改善肉、蛋、奶的品質和風味；③可刺激動物免疫器官發育和提高抗病力和減少發病率，有效防治畜禽腹瀉、肉雞腹水綜合征和水樣糞便的發生；④用于水產動物，能明顯的改善水質，提高魚苗的生長速度和存活率，增加蝦苗采食量和苗體長度，可廣泛用于禽、牛、羊、豬、水產和經濟動物；(3)該活性肽飼料添加劑的分子量較小；(4)本發明產品成本低，易于在薄利的養殖行業推廣；(5)本發明產品具有刺激動物免疫器官發育、提高抗病力和減少發病率等功能，可作為抗生素的替代品，降低藥物殘留；(6)本發明所采用的方法是微生物發酵法，是酶法成本的1/10，酶解法水解1Kg蛋白原料需要20元成本，本發明的發酵法僅需要需1.8元；而且發酵法生產的活性肽無苦味、無臭味，產品的理化特性良好。
因此本發明提供的活性肽飼料添加劑制品的開發與研制，對于節約飼料、降低成本提高動物生產性能和抗病力具有重大的現實意義和社會意義。
具體實施例方式
實施例1、制備活性肽飼料添加劑L-1(液劑)將枯草芽孢桿菌接入滅菌后的液體培養基中，25℃培養48小時，得到種子液。
所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨1.3g，葡萄糖3g，糖蜜3g，馬鈴薯浸液50ml，可溶性淀粉10g，蔗糖10g，牛肉膏2g，酵母浸粉3.5g，豆粕粉(60目)1.5g，生長因子1ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 20.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20mg/ml，ZnSO4.7H2O 0.81mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44mg/ml，MnSO4.H2O 0.13mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02mg/ml的混合物。
將發酵底物——大豆蛋白粉粉碎到60目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源——玉米面和糖蜜(重量比為1∶1)，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量比為100∶5，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶2，將混合物在0.1MPa，121℃滅菌30分鐘，冷卻到37℃，加入如前所述得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3∶10，混合均勻后在25℃，以0.5vvm的速度通入無菌空氣，以150rpm速度攪拌發酵，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)達到20％，然后經超高溫瞬時滅菌機于140℃滅菌8秒，得到活性肽飼料添加劑L-1(液劑)。
水解度(Degree of Hydrolysis，DH)的測定方法為常規的茚三酮法顯色法，現簡單介紹如下①標準曲線的繪制首先配制標準甘氨酸溶液，其濃度為20ug/ml；然后依表1所列加樣量順序加樣。
表1 甘氨酸、茚三酮和乙醇的加樣量試管編號012 3 456 7標準甘氨酸溶液加樣量(ml) 00.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.5 2.0蒸餾水加樣量(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.5 0終體積2ml時甘氨酸終濃度(ug/ml) 024 6 810 1520茚三酮加樣量(ml) 111 1 111 140％乙醇加樣量(ml) 555 5 555 5按表1所列加樣量，于具塞試管中依次加入標準甘氨酸溶液、蒸餾水和茚三酮顯色劑，在沸水中加熱15min，然后于冷水中冷卻5min；再加入40％的乙醇溶液終止反應，放置15min；以空白管調零于570nm處測定A(吸光度)值。
②水解蛋白液中-NH2含量的測定取一定量的蛋白水解液于4000rpm下離心15min，取上清液100μl于25ml容量瓶，定容，亦即稀釋250倍。吸取2ml稀釋液于具塞試管中并加入1ml茚三酮顯色劑，混勻后于沸水中加熱15min；然后于冷水中冷卻5min；再加5ml 40％的乙醇溶液終止反應，放置15min后，待測。最后，利用標準曲線計算蛋白水解液中-NH2的含量(umol/ml)。
③水解度(DH％)計算 在上式中蛋白水解液的相對甘氨酸濃度是指按上述方法測出的蛋白水解液的吸光度后，由標準曲線換算出的甘氨酸濃度。
發酵底物的蛋白濃度是指發酵底物(如大豆蛋白等)的蛋白質濃度。
75.07是甘氨酸的分子量。
7.8mmol/g是大豆蛋白完全水解后的肽鍵數(常數)。
0.33mmol/g是發酵底物(原料)中的肽鍵數(常數)。
實施例2、制備活性肽飼料添加劑L-2(液劑)將黑曲霉菌接入滅菌后的液體培養基中，35℃培養24小時，得到種子液。
所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨2.5g，葡萄糖5g，糖蜜5g，馬鈴薯浸液100ml，可溶性淀粉20g，蔗糖30g，牛肉膏3g，酵母浸粉5g，豆粕2g，生長因子2ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 30.00mg/ml，CaCl2.2H2O3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O 1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.04mg/ml的混合物。
將發酵底物——豆粕粉碎到120目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源——玉米糖蜜和白砂糖(重量比＝3∶2)，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量比為100∶18，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶35，將混合物在0.13MPa，125℃滅菌10分鐘，冷卻到20℃，加入如前所述得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為1∶10，混合均勻后在42℃，以2.5vvm的速度通入無菌空氣，以300rpm速度攪拌發酵，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)達到35％，然后經超高溫瞬時滅菌機于145℃滅菌2秒，得到活性肽飼料添加劑L-2(液劑)。
實施例3、制備活性肽飼料添加劑L-3(液劑)將綠色糖單孢菌接入滅菌后的液體培養基中，27℃培養36小時，得到種子液。
所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨1.8g，葡萄糖4g，糖蜜4g，馬鈴薯浸液70ml，可溶性淀粉15g，蔗糖20g，牛肉膏2.5g，酵母浸粉4g，豆粕粉(80目)1.8g，生長因子1.5ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 25.00mg/ml，CaCl2.2H2O 3.00mg/ml，ZnSO4.7H2O 1.00mg/ml，FeSO4.7H2O 0.50mg/ml，MnSO4.H2O0.17mg/ml，CuSO4.5H2O 0.03mg/ml的混合液。
將發酵底物——豆餅粉碎到80目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源——淀粉，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量比為100∶10，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶10，將混合物在0.11MPa，115℃滅菌20分鐘，冷卻到30℃，加入如前所述得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.5∶10，混合均勻后在28℃，以1.5vvm的速度通入無菌空氣，以180rpm速度攪拌，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到蛋白水解液的水解度(DH％)達到25％，然后經超高溫瞬時滅菌機于142℃滅菌6秒，得到活性肽飼料添加劑L-3(液劑)。
實施例4～27、制備活性肽飼料添加劑L-4～L-27(液劑)如表2所列，制備活性肽飼料添加劑L-4到L-27(液劑)。
表2、


實施例28、制備活性肽飼料添加劑C-1將實施例1得到的水解度(DH％)為20％的蛋白水解液經5000rpm離心30分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液加到預先混合好的載體中，所述載體為5重量份有機載體(2重量份麥麩，2重量份豆粕粉，1重量份玉米蛋白粉)和5重量份無機載體(輕質碳酸鈣)組成，濃縮液與載體的重量比為0.5∶1，然后在45℃干燥，粉碎到80目，得到活性肽飼料添加劑C-1。
實施例29、制備活性肽飼料添加劑C-2將實施例2得到的水解度(DH％)為35％的蛋白水解液經6000rpm離心20分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液加到預先混合好的載體中，所述載體為2重量份有機載體(玉米芯粉)和3重量份無機載體(石粉)組成，濃縮液與載體的重量比為0.8∶1，然后在80℃干燥，粉碎到80目，得到活性肽飼料添加劑C-2。
實施例30、制備活性肽飼料添加劑C-3將實施例3得到的水解度(DH％)為25％的蛋白水解液經7000rpm離心10分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液加到預先混合好的載體中，所述載體為3重量份有機載體(脫脂稻殼粉)和4重量份無機載體(麥飯石)，組成，濃縮液與載體的重量比為0.7∶1，然后在60℃干燥，粉碎到80目，得到活性肽飼料添加劑C-3。
實施例31～54、制備活性肽飼料添加劑C-4～C-27將實施例4～27得到的蛋白水解液分別按實施例28～30的方法，如表3所列，得到活性肽飼料添加劑C-4到C-27。
表3、


實施例55、制備活性肽飼料添加劑S-1將實施例1得到的水解度(DH％)為20％的蛋白水解液經5000rpm離心30分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液按操作條件體積比加入0.3％糊精和2％輕質碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機上按進風100℃℃，出風60℃，噴壓1.8kg，流量1000ml/min，進行噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑S-1。
實施例56、制備活性肽飼料添加劑S-2將實施例2得到的水解度(DH％)為35％的蛋白水解液經6000rpm離心20分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液按操作條件體積比加入1％糊精和8％輕質碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機上按進風130℃，出風80℃，噴壓2.3kg，流量1500ml/min，進行噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑S-2。
實施例57、制備活性肽飼料添加劑S-3將實施例3得到的水解度(DH％)為25％的蛋白水解液經7000rpm離心10分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液。
將此濃縮液按操作條件體積比加入0.7％糊精和5％輕質碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機上按進風120℃，出風70℃，噴壓2.0kg，流量1300ml/min，進行噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑S-3。
實施例58～81、制備活性肽飼料添加劑S-4～S-27將實施例4～27得到的蛋白水解液分別經5000rpm離心除去渣質，分出的上清液通過膜孔徑為5nm的超濾膜過濾；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液；將此濃縮液按操作條件體積比加入0.3～1％糊精和2～8％輕質碳酸鈣，混合均勻后，在噴霧干燥機上按進風100℃～130℃，出風60～80℃，噴壓1.8～2.3kg，流量1000～1500ml/min，進行噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑S-4到S-27。
根據長期的喂養試驗可知，本發明提供的活性肽飼料添加劑無論是以液劑(L-1～L-27)，還是以吸附在載體上的形式(C-1～C-27)或是直接噴霧干燥得到的固體粉末(S-1～S-27)形式飼喂禽類，其效果僅與所含的蛋白水解液的水解度和飼喂量有關，而與飼料的固、液形式無關。
實施例82、活性肽飼料添加劑S-2中肽氨基酸(即活性肽)含量的測定按照實施例56方法得到的活性肽飼料添加劑S-2，稱取樣品1.0013g，溶于20ml蒸餾水中，用40ml磺基水楊酸沉淀蛋白質，3000rpm離心30min后，取上清液10000rpm二次離心40min。從上清液中取出2ml溶液，45℃旋轉蒸發，然后進行染生(用2ml牛磺酸溶解，在試管中加入400μL 0.05mol/L的硼酸，再加入100μL溶解好的樣品和600μLFMOC，放置1min)。染生充分后用2000μL正戊烷提取剩余的FMOC。取出100μL染生后的樣品加入700μL洗脫液，在高壓液相色譜(HPLC)上測定，結果列于表4。
表4、活性肽飼料添加劑S-2中總氨基酸(TAA)、游離氨基酸(FAA)和肽氨基酸(PAA)的含量PAA占TAA的比氨基酸名稱FAA(g/g)TAA(g/g) PAA(g/g)例Asp 0.002166792 0.012578449 0.010411657 82.77％Ser 0.008550902 0.02781238 0.019261478 69.26％Glu 0.00011639 0.037771759 0.037655369 99.69％Thr 9.3796E-05 0.004508148 0.004414352 97.92％Gly 0.004637067 0.011950659 0.007313592 61.20％Arg 00 00.00％Ala 0.009697688 0.016944848 0.0072471642.77％Tyr 8.60159E-05 0.002721595 0.002635579 96.84％Pro 0.008556269 0.023238143 0.014681874 63.18％Val 00 00.00％Phe 0.00100304 0.003769058 0.002766018 73.39％Ile 0.013641658 0.035264777 0.021623119 61.32％leu 0.004459154 0.014044763 0.009585609 68.25％His 0.001131631 0.138213842 0.137082211 99.18％Lys 0.005849348 0.013225191 0.007375843 55.77％合計 0.059989751 0.342043613 0.282053861 82.46％注FAA為游離氨基酸，TAA為總氨基酸，PAA為肽氨基酸如表4所示，活性肽飼料添加劑S-2中肽氨基酸占總氨基酸含量的82.46％，亦即肽含量為82.46％，而游離氨基酸僅占總氨基酸的17.54％。其中組氨酸的含量最高為0.138213842g/g，谷氨酸次之，含量為0.037771759g/g。游離氨基酸中的丙氨酸含量高于肽氨基酸中丙氨酸含量，其余氨基酸都是肽中含量較高。這說明發酵所得的活性肽飼料添加劑S-2中既含有肽，也含有游離氨基酸，但以活性肽為主(占82.46％)，游離氨基酸所占比例很小。
實施例83、活性肽飼料添加劑的溶解度表5列出了豆粕發酵前及發酵后得到的產物——活性肽飼料添加劑S-2在不同酸堿度條件下的溶解度表5、豆粕發酵前后溶解度的變化

由表5可以看出，發酵前的豆粕的溶解度在pH＝2(極酸性條件下)時最高，為34.4％，隨著酸性降低，當pH值為3、4、5時溶解度急劇下降到1.97％～3.21％，此后，隨著酸性進一步降低，溶解度又逐漸回升；在pH值＝9時(強堿性條件下)達到了27.02％。而發酵后得到的產物——活性肽飼料添加劑S-2無論酸堿性如何變化(pH2～9)，均具有較高的溶解性，明顯高于發酵前的豆粕，而且在不同pH值的條件下溶解性基本保持平穩狀態，最低為32.68％，最高為40.45％。可見，本發明提供的活性肽飼料添加劑具有很好的溶解性和在不同酸堿酸堿度條件下的穩定性。
實施例84、大豆活性肽和大豆蛋白的熱穩定性大豆肽的熱穩定性是指將大豆肽溶液在100℃水浴鍋中加熱30min后，測定其吸光度值(OD)，計算加熱后與加熱前OD值比值的百分比，計為溶解度(％)，即溶解度％＝加熱后OD值/加熱前OD值*100％，見表6，溶解度(％)低，說明加熱后產生沉淀，沉入底部，使溶液清亮，從而OD值減小，標志著穩定性差。
大豆肽和大豆粕的熱穩定性方法為各取一定體積的1％的大豆肽溶液和豆粕溶液，分別調至不同的pH(2～9)值，4000rpm，離心15min。測定時取上清液于420nm處測其吸光值，后于100℃水浴鍋中加熱30min，按上述方法于420nm處測吸光值。通過比較兩次OD值，反映其熱穩定性。
表6、大豆肽和大豆蛋白溶解度隨pH的變化

由表6可知，大豆肽的熱穩定性較其母本蛋白有大幅度提高。在pH＝2時，大豆肽和大豆蛋白的熱穩定性均在80％左右，而在pH＝3時，大豆蛋白的溶解度較大豆肽有大幅度下降，說明大豆肽的溶解性好于大豆蛋白。此外，大豆肽的熱穩定性pH在大幅度的變化范圍內均較為平穩，說明大豆肽具有良好的熱穩定性。這與其母本——大豆蛋白不同，熱處理后其溶解性大幅度下降，即說明熱穩定性差。
實施例85、活性肽飼料添加劑的儲藏穩定性表7、大豆蛋白發酵前后的吸光值A2(100℃，30min，A0(初始值，常溫) A1(4℃，12h)然后冷卻至4℃)S-1 1.0116 1.0245 1.1462大豆蛋白 0.0123 0.0140 0.0185表7列出了大豆蛋白發酵前及發酵后得到的產物——活性肽飼料添加劑S-1的吸光值。由此可知，經4℃冷藏后活性肽飼料添加劑S-1的色澤和濁度均無較大變化，說明冷藏并沒有使肽溶液中肽分子產生沉淀，但經100℃，30min加熱和突然冷卻至4℃，其吸光值有較大變化，但與發酵前的母本大豆蛋白相比較，吸光值變化較小，說明在相同濃度的條件下，本發明的活性肽飼料添加劑的溶液儲藏穩定性比其母本蛋白明顯優越。
實施例86、使用本發明活性肽飼料添加劑在養豬生產中應用為檢驗本發明產品的功效和在養豬業上的應用效果，以及代替抗生素的可行性。試驗選取體重接近健康的35日齡斷奶仔豬(公母各半)180頭分為5個處理，每個處理(組)36頭豬，每個處理6個重復，每個重復6頭豬，均為3公3母，試驗期8周(2個月)，試驗結果列于表8。
五個處理如下所示空白對照組不添加任何添加劑，僅飼喂豬基礎日糧；抗生素對照組粉劑金霉素100mg/kg，均勻混合于基礎日糧中；活性肽1組40mg/kg實施例56的活性肽飼料添加劑S-2，均勻混合于基礎日糧中；活性肽2組120mg/kg實施例56的活性肽飼料添加劑S-2，均勻混合于基礎日糧中；活性肽3組200mg/kg實施例56的活性肽飼料添加劑S-2，均勻混合于基礎日糧中。
表8、在養豬生產中的使用效果

從表8可以看出，添加了活性肽飼料添加劑S-2的3個活性肽組的平均日增重和飼料轉化效率均好于空白對照組，可明顯提高豬只的生產性能，即日增重和飼料轉化效率。
其中活性肽2組(有效成分120mg/kg飼料)的平均日增重和飼料轉化效率顯著好于空白對照組及抗生素組，完全可以替代抗生素。
實施例87、使用本發明活性肽飼料添加劑在蛋雞飼養中的應用為檢驗活性肽飼料添加劑在蛋雞上的使用效果和在畜牧業上的應用前景，試驗選用海賽褐殼蛋雞后期雞3000羽，分三組，每組1000只蛋雞，分5個重復，每個重復200只雞，喂以3種不同的日糧，即A組為空白對照組，B組每噸飼料添加20克實施例57的活性肽飼料添加劑S-3(即0.05％的活性肽添加劑)，C組每噸飼料添加40克實施例57的活性肽飼料添加劑S-3(即0.1％的活性肽添加劑)。試驗期2個月，結果列于表9。檢測指標為破蛋率(％)、產蛋率(％)、蛋重(克/個蛋)、死淘率(％)、飼料轉化效率(耗料g/kg蛋)。
表9、在蛋雞飼養中的應用 注同行數字右肩標有不同小寫字母者為差異顯著(P＜0.05)。
從表9可以看出，隨著活性肽飼料添加劑的添加量的增加，產蛋率明顯增加，且A、B、C三組間均存在顯著性差異(p＜0.05)，其中，添加活性肽40/mg使產蛋率提高了4.6％。在飼料轉化效率(料/蛋比)方面，添加活性肽能明顯降低料蛋比，即明顯提高了飼料轉化效率，且差異顯著(p＜0.05)，但B組與C組差異不顯著(p＞0.05)；在蛋雞日糧中添加活性肽40/mg能明顯增加蛋重達3.5克/枚，增加幅度達5.4％，與對照組差異顯著(p＜0.05)，還明顯可降低死淘率和破蛋率，這些都有助于降低養殖成本。總之，本試驗表明，在蛋雞飼料中添加活性肽飼料添加劑能可明顯提高蛋禽產蛋率，增加蛋重，降低料蛋比、破蛋率，降低死淘率，提高飼料利用率、生產性能和降低生產成本。
由營養生化試驗的研究表明，活性或小肽的吸收具有耗能低、不易飽和且各種肽之間運轉無競爭性與抑制性的特點，同時肽本身對于氨基酸或肽的轉運的促進作用，所以在蛋雞日糧中添加本發明的活性肽飼料添加劑能提高產蛋率、降低飼料消耗和增加蛋重。
實施例88、本發明的活性肽飼料添加劑對雞外周血T-淋巴細胞增殖活力的影響為檢測本發明的活性肽飼料添加劑對雞外周血T-淋巴細胞增殖活力的影響，即檢測本發明產品對肉仔雞細胞免疫力的作用效果或影響程度。進行了微量法淋巴細胞轉化試驗，即在肉仔雞淋巴細胞培養液中加入不同劑量的無菌活性肽液，觀察活性肽對肉仔雞血液中淋巴細胞增殖活力的影響，具體方法如下(1)從飼養3周齡的肉仔雞上采血在滅菌的采血管中加入無菌肝素，從雞翅經脈采血4ml，輕輕搖動讓肝素與血液充分混合、靜置1小時，得到無菌抗凝血液。
(2)從無菌抗凝血液中分離淋巴細胞(全程進行無菌操作)將肝素抗凝血先用無鈣鎂Hank’s液作1∶1稀釋，在尖底離心管加淋巴細胞分層液6ml，然后沿管壁緩緩疊加3mlHank’s液稀釋的肝素抗凝血，水平式離心機3000轉/分離心30分鐘，可見液體分為三層上層為血漿，中層為分離液，下層為紅細胞和粒細胞。在上層和中層之間的界面上可見一薄層混濁帶，此為淋巴細胞和單核細胞的混合物。用吸管吸棄血漿層直至距淋巴細胞層0.5cm處，然后將淋巴細胞層及少許分離液一起吸出，移入10ml離心管中，加入5倍以上體積的pH7.2-7.4無鈣鎂Hank’s液，混勻，以2000rpm離心沉淀10分鐘，棄去上清液，同法再洗滌二次。沉淀的淋巴細胞用RPMI1640培養(不含FCS)配成1×107/ml淋巴細胞懸液。
(3)淋巴細胞純度鑒定取上述淋巴細胞懸液涂片，自然干燥后，瑞氏染液染色1min，加等量PBS緩沖液繼續染色4min，蒸餾水沖洗涼干，顯微鏡觀察，淋巴細胞純度的95％以上。
(4)細胞培養在96孔細胞培養板上，每孔加入淋巴細胞懸液60μl，在培養液中不加或加入濃度為640μg/ml的小肽母液60μl，使小肽在培養液中的最終濃度為0、0.0234375％、0.046875％、0.09375％、0.1875％、0.375％、0.75％、1.5％，重復三孔。由RPMI1640培養液(共四組，所含FCS分別為0、5％、10％、15％)將總培養體積調整至200μl，2置5％CO2，37℃分別培養48h。培養結束前4h，每孔輕輕吸去上清液70μl(血清蛋白是細胞培養液的基本成份，血清蛋白在有機溶劑中容易變性形成絮狀沉淀，影響透光度。為了減少血清的影響，加MTT前盡量去掉培養上清)，然后不同組每孔加入2.5mg/ml、5.0mg/ml、7.5mg/ml MTT 10μl，于振蕩器上混勻約1分鐘，繼續培養4h。培養結束后，每孔加入0.04M酸化異丙醇100μl，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。
(5)結果檢測用酶聯免疫檢測儀，在測定波長570nm，參考波長630nm處測定光密度值(OD值)，以OD值表示淋巴細胞的增殖活力。結果見表10。
表10、對雞外周血T-淋巴細胞增殖活力的影響

由表10的數據可以看出，活性飼料添加劑具有刺激動物免疫功能，增強動物T細胞活力的功能，T細胞是畜禽動物體內參與非特異性免疫(如抗腫瘤、抗病毒)和細胞免疫的主力軍，其活力的增強說明可提高動物的抗病力。
實施例89、本發明的活性肽飼料添加劑對雞的牛血清白蛋白(BSA)抗體效價的影響為檢測本發明的活性肽飼料添加劑對肉雞對牛血清白蛋白(BSA)特異性抗體效價的影響，將肉仔雞分為5個組，每個組分成5個重復，每個重復20只雞，試期7周。試驗設計見表11，基礎日糧配比及營養水平見表12。分別于35日齡、42日齡給肉雞左右腿肌各注射牛血清白蛋白0.5ml(牛血清白蛋白濃度為2.5mg/kg)表11、肉雞飼養試驗設計

表12、肉仔雞日糧配方及營養水平

注預混料向每千克全價料提供Cu 6mg，Fe 75mg，Zn 75mg，Mn 80mg，Se0.2mg，I 0.4mg，沸石粉1mg，膽堿3mg。維生素A 6000IU，維生素D3 2000IU，維生素E 12IU，維生素K3 2mg，生物素0.05mg，葉酸0.4mg，煙酸32mg，泛酸7mg，維生素B1 1mg，維生素B2 5mg，維生素B6 1mg，維生素B12 10ug。
于28日齡、49日齡每組組取12只雞心臟采血，然后3000rpm離心10min分離血清，凍存于-20℃冰箱中，用酶聯免疫方法(ELISA)檢測BSA抗體效價，結果以OD值表示，見表13。
表13、28日齡添加活性肽對肉仔雞BSA抗體效價的影響

從表13可以看出，添加活性肽組的肉仔雞的抗體效價明顯高于空白對照組和抗生素組，特別是D組和E組更為顯著。說明活性肽飼料添加劑可明顯提高肉仔雞的抗體效價，抗體效價是衡量機體抵抗病原能力的重要指標，抗體效價高即表明機體的抗病力強。
實施例90、本發明的活性肽飼料添加劑對肉仔雞生產性能(增重速度和耗料)的影響按實施例89飼養肉雞，在1日齡入雛時和4周齡末(28日齡)、7周齡末(49日齡)分別以重復為單位稱重，并統計耗料量，計算0～4周和4～7周齡的死亡只數、增重、采食量以及料肉比。結果見表14。
表14、49日齡添加活性肽對肉仔雞生產性能的影響

表14的數據表明，D組和E組雞的體重比空白對照組分別提高47克和44克，比抗生素組分別提高31克和28克，同時，D組和E組雞的耗料量也明顯低于其他組。說明添加生物活性肽可明顯提高肉雞的增重，也能提高飼料轉化效率，節約飼料開支，提高經濟效益。
實施例91、本發明的活性肽飼料添加劑對肉仔雞產品品質的影響按實施例89飼養肉雞，在28日齡和49日齡時，做禽肉品質測定.每個重復取兩只雞稱重、屠宰，每個處理10只雞，取胸肌、腿肌和腹脂(僅49天時取)，計算胸肌率、腿肌率和腹脂率。結果見表15。
表15、肉仔雞出欄(7周齡)時的產品品質指數

表15說明，添加活性肽飼料添加劑可明顯提高肉仔雞胸肌和腿肌的比率，同時能降低腹部脂肪的數量，即能明顯改善肉雞胴體(去毛去內臟的凈堂雞)的品質。
權利要求
1.一種活性肽飼料添加劑，其為由如下制備方法將發酵底物經發酵、水解且水解度控制在20～35％，并且經超高溫瞬時滅菌得到的蛋白水解液，所述的制備方法包括如下步驟1)制備種子液將芽孢桿菌、曲霉菌、青霉、放線菌中的一種或幾種，接入滅菌后的液體培養基中，于25～35℃培養24～48小時，得到種子液；所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，馬鈴薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生長因子l～2ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；2)發酵降解將發酵底物粉碎到60～120目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量份配比為100∶5～18，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶2～35，將發酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃滅菌10～30分鐘，冷卻到20～37℃，加入步驟1)得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3～1∶10，混合均勻后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入無菌空氣，以150～300rpm速度攪拌發酵，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到水解度達到20～35％，然后于140～145℃滅菌2～8秒，得到活性肽飼料添加劑；所述的發酵底物為選自植物蛋白或動物蛋白中的一種或幾種的混合物；所述的碳源包括玉米面、紅糖、食用白糖、玉米糖漿、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
2.如權利要求1所述的活性肽飼料添加劑，其特征在于，所述的芽孢桿菌為臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或短小芽孢桿菌；所述的曲霉菌為黑曲霉菌、棲土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；所述的放線菌為綠色糖單孢菌、灰綠鏈霉菌或費式鏈霉菌；所述的青霉菌為紫微青霉、產黃青霉、蘋果青霉、淡黃青霉、臺灣青霉、杜邦青霉或藍棕青霉。
3.如權利要求1所述的活性肽飼料添加劑，其特征在于，所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆餅、碗豆蛋白、玉米蛋白、紅豆蛋白、小麥蛋白、大麥蛋白、棉籽粕和菜籽粕；所述的動物蛋白包括魚粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、動物廢棄臟器、蚯蚓蛋白粉、魷魚蛋白和魚皮。
4.如權利要求1所述的活性肽飼料添加劑，其特征在于，其制備方法還包括步驟3)和步驟4)所述步驟3)為蛋白水解液的離心除渣、超濾、濃縮將步驟2)得到的經滅菌的蛋白水解液再經5000～7000rpm離心10～30分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液；所述步驟4)為加載體吸附干燥或噴霧干燥加載體吸附干燥是將步驟3)得到的濃縮液，加到預先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽飼料添加劑；所述的載體由2～5重量份有機載體和3～5重量份無機載體組成；所述有機載體包括糠麩類和餅粕類有機載體；所述糠麩類有機載體為麥麩、玉米芯粉、脫脂稻殼粉和脫脂米糠中的一種或幾種的混合物；所述餅粕類有機載體為豆粕粉、豆餅粉和玉米蛋白粉中的一種或幾種的混合物；所述無機載體為輕質碳酸鈣、石粉、麥飯石和沸石粉中的一種或幾種的混合物；噴霧干燥是將步驟3)得到的濃縮液，噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑。
5.一種權利要求1所述的活性肽飼料添加劑的制備方法，包括如下步驟1)制備種子液將芽孢桿菌、曲霉菌、青霉、放線菌中的一種或幾種，接入滅菌后的液體培養基中，于25～35℃培養24～48小時，得到種子液；所述的液體培養基為按下述比例配制的混合液蛋白胨1.3～2.5g，葡萄糖3～5g，糖蜜3～5g，馬鈴薯浸液50～100ml，可溶性淀粉10～20g，蔗糖10～30g，牛肉膏2～3g，酵母浸粉3.5～5g，豆粕1.5～2g，生長因子1～2ml，水1000ml；其中的生長因子為含有MgSO4.7H2O 20.00～30.00mg/ml，CaCl2.2H2O 2.20～3.50mg/ml，ZnSO4.7H2O0.81～1.10mg/ml，FeSO4.7H2O 0.44～0.60mg/ml，MnSO4.H2O 0.13～0.20mg/ml，CuSO4.5H2O 0.02～0.04mg/ml的混合物；2)發酵降解將發酵底物粉碎到60～120目后放入發酵罐中，依次加入水和碳源，所加入水的重量與發酵底物所含蛋白質的重量份配比為100∶5～18，所加入碳源的含碳量與發酵底物的含氮量的重量比為1∶2～35，將發酵液在0.1～0.13MPa，115～125℃滅菌10～30分鐘，冷卻到20～37℃，加入步驟1)得到的種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3～1∶10，混合均勻后在25～42℃，以0.5～2.5vvm的速度通入無菌空氣，以150～300rpm速度攪拌發酵，期間用常規的茚三酮法顯色法測定水解度，24小時前每6小時檢測一次水解度，24～48小時之間，每4小時檢測一次水解度，48小時后每2小時檢測一次水解度，直到水解度達到20～35％，然后于140～145℃滅菌2～8秒，得到活性肽飼料添加劑；所述的發酵底物為選自植物蛋白或動物蛋白中的一種或幾種的混合物；所述的碳源包括玉米面、紅糖、食用白糖、玉米糖漿、淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜。
6.如權利要求1所述的活性肽飼料添加劑的制備方法，其特征在于，所述的芽孢桿菌為臘樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或短小芽孢桿菌；所述的曲霉菌為黑曲霉菌、棲土曲霉菌、米曲霉菌、肉桂色曲霉菌或宇佐美曲霉菌；所述的放線菌為綠色糖單孢菌、灰綠鏈霉菌或費式鏈霉菌；所述的青霉菌為紫微青霉、產黃青霉、蘋果青霉、淡黃青霉、臺灣青霉、杜邦青霉或藍棕青霉。
7.如權利要求1所述的活性肽飼料添加劑的制備方法，其特征在于，所述的植物蛋白包括大豆蛋白、豆粕、豆餅、碗豆蛋白、玉米蛋白、紅豆蛋白、小麥蛋白、大麥蛋白、棉籽粕和菜籽粕；所述的動物蛋白包括魚粉、血粉、羽毛粉、乳蛋白、筋肉、酪蛋白、動物廢棄臟器、蚯蚓蛋白粉、魷魚蛋白和魚皮。
8.如權利要求1所述的活性肽飼料添加劑的制備方法，其特征在于，還包括步驟3)和步驟4)所述步驟3)為蛋白水解液的離心除渣、超濾、濃縮將步驟2)得到的經滅菌的蛋白水解液再經5000～7000rpm離心10～30分鐘除去渣質，分出的上清液通過超濾膜過濾，得到分子量小于5000Da的濾液；將此濾液經負壓真空濃縮到原體積的50％，得到濃縮液；所述步驟4)為加載體吸附干燥或噴霧干燥加載體吸附干燥是將步驟3)得到的濃縮液，加到預先混合好的載體中，濃縮液與載體的重量比為0.5～0.8∶1，然后在45～80℃干燥，得到活性肽飼料添加劑；所述的載體由2～5重量份有機載體和3～5重量份無機載體組成；所述有機載體包括糠麩類和餅粕類有機載體；所述糠麩類有機載體為麥麩、玉米芯粉、脫脂稻殼粉和脫脂米糠中的一種或幾種的混合物；所述餅粕類有機載體為豆粕粉、豆餅粉和玉米蛋白粉中的一種或幾種的混合物；所述無機載體為輕質碳酸鈣、石粉、麥飯石和沸石粉中的一種或幾種的混合物；噴霧干燥是將步驟3)得到的濃縮液，噴霧干燥，得到活性肽飼料添加劑。
9.一種權利要求1所述的活性肽飼料添加劑作為飼料添加劑的用途。
全文摘要
本發明涉及一種活性肽飼料添加劑，其為植物蛋白和動物蛋白的一種或幾種的混合物，經芽孢桿菌等發酵降解，使其水解度控制在20～35％，經過分離后處理工藝，得到發酵上清液，將上清液或濃縮干燥或直接吸附到載體上，低溫干燥后得到的產物。該活性肽飼料添加劑能明顯抑制大腸桿菌、沙門氏菌的生長，可防治細菌性腹瀉和消化不良性腹瀉；在極低濃度下即可發揮作用，作用十分強烈；調節胃腸菌群，促進動物消化功能；刺激動物的免疫功能，增強動物對多種疫病的抗病力，大幅度降低發病率和死淘率；促進動物生長，提高生長速度；提高飼料利用率，降低生產成本。利用本發明提供的微生物發酵降解法，生產成本低，所得的肽類多，含量高，無環境污染。
文檔編號A23J3/34GK1579198SQ20041002978
公開日2005年2月16日 申請日期2004年3月26日 優先權日2003年8月15日
發明者張日俊, 于長青 申請人:中國農業大學