專利名稱：一種建立昆蟲細胞系的方法
技術領域：
本發明涉及一種建立細胞系的方法，尤其涉及一種建立昆蟲細胞系的方法。
背景技術：
培養昆蟲細胞作為研究材料，一直是細胞生物學、分子生物學和生物化學等科學研究的重要方面，而且在昆蟲桿狀病毒表達載體技術日益完善并大規模付諸商品化應用的當今，昆蟲細胞作為這種表達載體系統的重要組成部分，表達了大量的經濟意義或科學意義非常重大的外源蛋白質；同時作為生物反應器，擴增昆蟲桿狀病毒用作生物殺蟲劑，特別是擴增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲劑，昆蟲細胞也發揮了重要的作用。
據報道，目前已經建立的昆蟲細胞系超過400多種，對于每一株細胞系，無論是來自同一種昆蟲甚至同一個體、同一器官組織，在細胞系的建立和細胞的培養過程中，都會出現不同程度的變異，其細胞生物學特性、對特定桿狀病毒的感受性等都有可能不同。因而科學家們根據研究的需要或某些商業目的，會嘗試從不同種昆蟲、同一種昆蟲不同器官組織中，建立和篩選各種類型的細胞系，以滿足不同的需求。傳統的昆蟲細胞系的建立方法帶有很大的隨機性和不確定性，多將相應的昆蟲器官或組織剪碎，或用胰蛋白酶把昆蟲組織消化，釋放出單個或成團的細胞，放入特定的細胞培養液中培養，并定時更換細胞培養液。細胞系建立成功與否隨機性很強，有很大的不確定性，多數情況下以失敗告終，而且這個過程很長。一般一個細胞系建立成功多需要1.5-2年的時間，有些耗時更長。因此，目前已有的400多株細胞系是在1965年第一株昆蟲細胞系成功建立后至今，近40年的時間內，無數實驗室不懈努力的成果。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能夠快速、有效、可重復地建立昆蟲細胞系的方法，這種方法可以在短期內建立需要研究或生產用的昆蟲細胞系，能夠提供大量的昆蟲細胞種類的來源，并供使用者篩選，使建立細胞系成為實驗室的常規實驗方法成為可能。
本發明所提供的建立昆蟲細胞系的方法包括如下步驟(1)將實驗昆蟲浸沒在乙醇溶液中10-60分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗昆蟲，再吸干蟲體表面；(2)解剖昆蟲，取出需要建立細胞系的完整昆蟲組織或器官；(3)用生理鹽水清洗(2)中獲得的組織或器官2-3次，再用細胞培養液清洗，清洗后把該組織或器官放入細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入25-29℃無光照的細胞培養箱中培養4-24小時；(4)加入適量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，在與步驟(3)同樣條件下培養；(5)每5-7天吸出半量的培養液，并同時換入半量新的細胞培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；(6)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液，兩個培養瓶放入培養箱中培養，細胞開始傳代，細胞系建立初步成功；整個過程都是在無菌條件下進行的。
本發明方法所使用細胞培養液的說明本發明所使用的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和動物血清的混合物，配成的細胞培養液pH在6.0-6.8之間。其中該昆蟲細胞培養液可以選用目前已經商品化的昆蟲細胞培養液，例如TNM-FH，SF900，TC-100，Grace’s四種中的任何一種，優選TNM-FH；青霉素含量為50-100U/mL，優選100U/mL；鏈霉素含量為50-100U/mL，優選100U/mL；動物血清可以選用小馬血清，胎馬血清，小牛血清和胎牛血清中的任何一種，優選胎牛血清；動物血清含量為細胞培養液的5-20％(體積比)，優選10％。
相對于傳統的細胞系建立方法，這個過程由通常的耗時1.5-2年縮減到1-3個月，其優勢非常明顯，而且本發明方法的重復性很強，用同樣方法建立同樣昆蟲組織的細胞系，在預定的時間內可以使細胞傳代，因而大大提高了昆蟲細胞系建立的效率。第一次傳代以后，根據細胞生長增殖的情況，用傳統培養昆蟲細胞系的方法對細胞進行分瓶傳代處理。根據不同細胞系的特性，細胞系的生長將在第一次傳代1-3個月后達到穩定狀態。此時可以定期傳代，并用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種資，其它細胞用于常規的細胞生物學特性鑒定，并進行相應的科學實驗和生產應用。
具體實施例方式
實施例1在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或消毒處理)將5齡的光肩星天牛Anoplophora glabripennis幼蟲一頭浸沒在70％的乙醇溶液中20分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗天牛幼蟲，吸水紙吸干蟲體表面。解剖該昆蟲，取出脂肪體組織，操作時盡量保持其完整，注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分。用生理鹽水清洗該組織2-3次，再用細胞培養液(以TNM-FH為主，含100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.2)清洗一次，清洗后直接用尖嘴鑷把該組織放入25cm2的細胞培養瓶中，在此過程中連帶少量的上述細胞培養液同組織塊一同放入培養瓶，蓋緊瓶蓋。這時脂肪體組織塊的底面直接接觸培養瓶底，并使保持這種狀態，放入攝氏27℃無光照的細胞培養箱中培養10小時。然后加入3mL上述細胞培養液，使脂肪體組織塊大部分浸沒在細胞培養液中，放入同樣條件下培養，注意該方法成功建立細胞系的關鍵是要使組織塊緊貼在細胞培養瓶底，勿使組織塊懸浮在細胞培養液中。以后每7天左右吸出半量的培養液，并同時換入半量的新培養液。在此操作第7天后可以觀察到組織塊在離體并在上述培養條件下，很快從其周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向外圍擴展。第28天后見到細胞不斷增殖并充滿整個培養瓶，把含有新增殖出的細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入2mL新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液。兩個培養瓶放入培養箱中培養，標志著細胞開始傳代，光肩星天牛幼蟲脂肪體細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第7天后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第8代時，細胞生長開始穩定，在27℃下，每3天就要傳代一次，最終該細胞系被命名為Angl II。
實施例2在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或消毒處理)將3日齡的甜菜夜蛾Spodoptera exigua雌蟲的蛹一頭浸沒在70％的乙醇溶液中40分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗該蛹，吸水紙吸干蛹體表面。解剖取出該蛹的卵巢，操作時盡量保持其完整，注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分。用生理鹽水清洗卵巢3次，再用細胞培養液(以Sf900為主，含80U/mL的青霉素，80U/mL的鏈霉素和5％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.5)清洗一次，清洗后直接用尖嘴鑷把卵巢放入25cm2的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋。這時卵巢的底面直接接觸培養瓶底，放入攝氏27℃無光照的細胞培養箱中培養5小時。然后加入2mL上述細胞培養液，使卵巢組織完全浸沒在該培養液中，放入同樣條件下培養。以后每7天左右吸出半量的細胞培養液，并同時換入半量新的細胞培養液。在上述操作第3天后可以觀察到從卵巢周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向外圍擴展，而此時卵巢組織一直保持蠕動狀態。在第56天后見到增殖的細胞充滿整個培養瓶，把含有新增殖出的細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入2mL新的細胞培養液，而原含有卵巢組織的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液。兩個培養瓶放入培養箱中培養。這個過程標志著細胞開始傳代，甜菜夜蛾卵巢細胞系建立初步成功。在第一次傳代的第13天后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第5代時，細胞生長開始穩定，在27℃下，每4天就要傳代一次，最終該細胞系被命名為Spex I。
實施例3在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或消毒處理)將4日齡的棉鈴蟲Helicoverpa armigera雌蟲的蛹一頭浸沒在70％的乙醇溶液中60分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗該蛹，吸水紙吸干蛹體表面。解剖取出該蛹的卵巢，操作時盡量保持其完整，注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分。用生理鹽水清洗卵巢3次，再用細胞培養液(以TNM-FH為主，含50U/mL的青霉素，50U/mL的鏈霉素和20％(v/v)的胎牛血清，pH＝6.8)清洗一次，清洗后直接用尖嘴鑷把卵巢放入25cm2的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋。這時卵巢的底面直接接觸培養瓶底，放入攝氏27℃無光照的細胞培養箱中培養6小時。然后加入2mL上述細胞培養液，使卵巢組織完全浸沒在該培養液中，放入同樣條件下培養。以后每7天左右吸出半量的細胞培養液，并同時換入半量新的細胞培養液。在上述操作的第2天后觀察到從卵巢周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向外圍擴展，而此時卵巢組織一直保持蠕動狀態。在第63天后見到增殖的細胞充滿整個培養瓶，把含有新增殖出的細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入2mL新的細胞培養液，而原含有卵巢組織的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液。兩個培養瓶放入培養箱中培養。這個過程標志著細胞開始傳代，棉鈴蟲卵巢細胞系建立初步成功。在第一次傳代的第10天后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第7代時，細胞生長開始穩定，在27℃下，每4天就要傳代一次，最終該細胞系被命名為HearI。
權利要求
1.一種建立昆蟲細胞系的方法，包括如下步驟(1)將實驗昆蟲浸沒在乙醇溶液中10-60分鐘，進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水清洗昆蟲，再吸干蟲體表面；(2)解剖昆蟲，取出需要建立細胞系的完整昆蟲組織或器官；(3)用生理鹽水清洗(2)中獲得的組織或器官2-3次，再用細胞培養液清洗，清洗后把該組織或器官放入細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入25-29℃無光照的細胞培養箱中培養4-24小時；(4)加入適量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，在與步驟(3)同樣條件下培養；(5)每5-7天吸出半量的細胞培養液，并同時換入半量新的細胞培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；(6)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞培養液，兩個培養瓶放入培養箱中培養，細胞開始傳代，細胞系建立初步成功；整個過程都是在無菌條件下進行的。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和動物血清的混合物，pH在6.0-6.8之間。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲細胞培養液選自TNM-FH，SF900，TC-100和Grace’s。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量為50-100U/mL。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的鏈霉素含量為50-100U/mL。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的動物血清選自小馬血清，胎馬血清，小牛血清和胎牛血清。
7.根據權利要求2或7所述的方法，其特征在于，所述的動物血清含量為細胞培養液的5-20％(體積比)。
全文摘要
本發明涉及建立昆蟲細胞系的方法，包括將昆蟲浸沒在乙醇溶液中，用無菌蒸餾水清洗昆蟲，吸干蟲體表面；解剖昆蟲，取出需要建立細胞系的完整昆蟲組織或器官；分別用生理鹽水和細胞培養液清洗昆蟲組織或器官，放入無光照的細胞培養箱中培養；加入細胞培養液培養；并不斷吸出和換入半量的細胞培養液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養瓶；把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，加入新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞培養液，兩個培養瓶放入培養箱中培養至細胞系建立初步成功。該方法將能在短期內快速、可重復地建立多種昆蟲的細胞系，所需的昆蟲細胞培養設備簡單，可操作性強。
文檔編號C12N5/06GK1673355SQ200410029730
公開日2005年9月28日 申請日期2004年3月25日 優先權日2004年3月25日
發明者秦啟聯, 張寰, 張永安, 王玉珠, 李瑄, 苗麟, 丁翠 申請人:中國科學院動物研究所, 中國林業科學研究院森林保護研究所