專利名稱：用于禽流感h5、h7和h9亞型多重實時熒光rt－pcr檢測的引物、探針序列和方法
技術領域：
本發明涉及高致病性禽流感H5、H7和H9亞型核苷酸片斷的RT-PCR擴增引物和探針，及同時進行禽流感H5、H7和H9亞型的分型檢測方法。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza，AI)也叫歐洲雞瘟或真性雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種急性高度接觸性傳染病，是國際公認的一種毀滅性疾病，其可以經豬或其它動物傳播給人，因此又具有十分重要的生態學和公共衛生學意義，尤其是高致病性禽流感被世界動物衛生組織列為A類傳染病。
自1878年Perroncito首次報道了禽流感在意大利的流行后，在歐洲、美洲相繼分離到了禽流感病毒，從而開始了禽流感長期伴隨人類的歷史。目前發現禽流感病毒共有16個血清型，其中高致病性禽流感病毒主要包括H5、H7和H9亞型，潛伏期短、高死亡率和猝死是其主要特征，在短時間內可導致感染雞群全軍覆沒，其發病率和死亡率可達100％，造成嚴重的經濟損失。目前，禽流感病毒已廣泛分布于世界各地，而且每次暴發都給世界養禽業造成巨大的經濟損失。1993年美國賓夕法尼亞州暴發禽流感，投資6000萬美元用于捕殺1700萬只雞；1995年由于禽流感的原因，墨西哥淘汰1800萬只雞，封鎖3200萬只雞，對1.3億只雞進行了緊急疫苗接種，造成10億美元直接經濟損失；1997年香港特區政府曾斥資1億港幣捕殺150萬只雞，2001年再度斥資8000萬港幣捕殺120萬只雞。可見禽流感嚴重制約影響著我國乃至世界養禽業的發展，對養禽業造成了極大的打擊，已經成為各國進出口檢驗檢疫和疾病監控的重點對象。
近些年發現，禽流感不僅嚴重危害禽類，而且也危害哺乳動物，尤其是可以感染人并致人死亡。禽流感病毒屬于RNA病毒，和所有的RNA病毒一樣，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，基因組轉錄時有較高的錯誤率，而且其基因組是分節段的，極易發生重排，因而禽流感病毒具有高度的變異性。其基因組中編碼糖蛋白HA和NA的基因片段及編碼非結構蛋白NS1和NS2的基因片段，在不同的流感毒株之間存在較大差異，而其它基因在禽流感病毒基因組中相對保守。研究發現，禽流感病毒的致病力主要取決于宿主與病毒之間的相互作用關系，而病毒的不同基因片段在決定病毒致病性方面也有不同的作用，其中起主要作用的是編碼HA蛋白的基因。通過對大量禽流感病毒HA核苷酸序列和氨基酸序列的分析、比較，發現HA裂解位點的氨基酸序列決定禽流感病毒的毒力，高致病性禽流感的HA裂解位點有6個連續的堿性氨基酸，而低致病性禽流感有2個堿性氨基酸。
盡管人們對禽流感進行了廣泛深入的研究，并建立了一些診斷檢測方法，但是目前還沒有可同時檢測禽流感H5、H7和H9亞型的方法，而實時熒光PCR技術是具有巨大發展潛力的高新檢測技術，在許多領域已得到了廣泛應用，因此可以利用其解決禽流感病毒多血清型和高變異性給臨床檢測造成的難題。實時熒光定量PCR技術是于1996年被首次推出的，該技術不僅實現了PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、檢測周期更短、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。
常規反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是先將RNA反轉錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴增目的DNA片斷的技術。熒光實時RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，從而檢測不到該探針熒光基團所發出的熒光信號，而在PCR擴增時，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結合在目的擴增片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，此時可以檢測到熒光報告基團的熒光信號，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比。
多重實時熒光PCR是在同一反應體系中加入多對引物和探針，同時檢測多個目的片斷的方法，在類癥疾病的鑒別和多血清型病原的分型檢測中具有重要意義。與普通PCR方法相比，具有以下優點a.使用了熒光標記探針，進一步提高了檢測的特異性和準確性；b.通過自動化檢測熒光信號的變化，使檢測具有更高的靈敏度；c.進行全封閉檢測反應，不用對PCR產物進行后期處理，避免了污染；d.可以實時監測結果，提高了檢測速度和效率；e.可以實現一管多檢，達到省時省力的目的。
由于禽流感病毒具有多個亞型且變異快，疫情的發生情況又較復雜，所以迫切需要建立一種特異敏感、準確可靠、快速簡便的高致病性禽流感“一步法”分型檢測方法，用于快速檢測國內外主要流行的高致病性禽流感病毒亞型，從而滿足進出口檢驗檢疫和疫病監控的需要。
發明內容
本發明的目的是提供用于禽流感H5、H7和H9亞型多重實時熒光RT-PCR檢測的引物、探針序列和方法。
本發明的目的可通過以下技術方案實現通過分析所有已報道的禽流感H5、H7和H9亞型基因組序列，分別設計引物和熒光探針。在常規RT-PCR檢測技術的基礎上，添加一條標記了兩個熒光基團的核苷酸探針，熒光報告基團(R)標記在探針的5’端，熒光淬滅基團(Q)標記在探針的3’端，兩者構成能量轉移結構，即熒光報告基團所發射的熒光可被熒光淬滅基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告基團熒光信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團(Q)的抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，從而進行禽流感H5、H7和H9亞型的檢測。實時熒光RT-PCR檢測反應原理見圖1。
引物和探針設計通過分別對所有已經報道的禽流感病毒H5、H7和H9亞型基因組序列進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的核苷酸區段設計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內無互補序列，而且應分別特異性地針對禽流感病毒H5、H7和H9亞型，相互間不存在交叉反應，可以在一個反應管中同時用于區分H5、H7和H9亞型。
用于檢測禽流感H5亞型的核苷酸擴增用引物序列和探針序列包括由上游引物H5pf1673序列為GACCAGCTACCATGATTGCCA及互補序列為CTGGTCGATGGTACTAACGGT，下游引物H5pr1600序列為GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG及互補序列為CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H5pb1655序列為TGCTAGGGAACTCGCCA，互補序列為ACGATCCCTTGAGCGGT以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
用于檢測禽流感H7亞型的核苷酸擴增用引物序列和探針序列包括1.由上游引物H7pf1292序列為CGTGTCCAATTAATGACATTTCC及互補序列為GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG，下游引物H7pr1202序列為ATCACAGGCAAATTGAATCGT及互補序列為TAGTGTCCGTTTAACTTAGCA組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7pb1247序列為TTTGAGCTGATAGACAATGA及互補序列為AAACTCGACTATCTGTTACT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
2.由上游引物H7pf1664序列為GCCATTGCAATGGGCCT及互補序列為CGGTAACGTTACCCGGA，下游引物H7pr1736序列為AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA及互補序列為TCATCTTTGTTCCCACAAAAAAGGT組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7pb1712序列為CGGTGCACTATTTGTATA及互補序列為GCCACGTGATAAACATAT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
用于檢測禽流感H9亞型的核苷酸擴增用引物序列和探針序列包括由上游引物H9pf151序列為CCTGTGACACATGCCAAAGA及互補序列為GGACACTGTGTACGGTTTCT，下游引物H9pr302序列為CTTTCGACRATGTAGGACCATTC及互補序列為GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H9pb175序列為CTCCACACAGAGCACAAT及互補序列為GAGGTGTGTCTCGTGTTA，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
將上述引物、探針序列優化組合后，建立同時檢測禽流感H5、H7和H9亞型的多重實時熒光RT-PCR檢測方法，并制成用于同時檢測禽流感H5、H7和H9亞型的多重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。
禽流感H5、H7和H9亞型多重實時熒光RT-PCR檢測的方法采用以下步驟(1)選取權利要求1-9中所述的引物和探針；(2)制備待測模板，提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA；(3)反應體系的建立，a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定反轉錄酶(AMV RnaseXL)用量；d、確定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；e、確定dNTPs濃度；f、確定最佳探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測。
禽流感H5、H7和H9亞型多重實時熒光RT-PCR檢測方法中待測模板的制備可采用方法QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA。
本發明的顯著特點是充分運用PCR技術的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術的快速敏感性，對一個樣品進行一次檢測操作即可完成高致病性禽流感H5和H7和H9亞型的檢測，并可以確定血清型，具有結果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本、提高檢測效率等優點。
圖1 Taqman探針的實時熒光RT-PCR檢測原理圖。
圖2 禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。
圖3 禽流感H5和H9亞型二重實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。
圖4 禽流感H7和H9亞型二重實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。
圖5 禽流感H5和H7亞型二重實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。
具體實施例方式
反應體系的建立和優化利用滅活的禽流感病毒H5、H7和H9亞型毒株作為待檢樣品，利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲存于-20℃備用。禽流感H5、H7和H9亞型多重實時熒光RT-PCR反應體系的建立和優化(1)引物濃度的優化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將禽流感H5、H7和H9的引物濃度分別從0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比連續稀釋，互相組合后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4μmol/L。
(2)鎂離子濃度的優化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L遞增，經過多次重復實驗選定5mmol/L為試劑盒反應體系中的鎂離子濃度。
(3)反轉錄酶(AMV RnaseXL)用量的優化 經過使用不同濃度AMV RNaseXL的試驗結果比較，選定5U作為試劑盒反應體系中AMV RnaseXL的用量。
(4)Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優化 通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優化實驗結果，選定5U作為試劑盒反應體系中Taq酶的用量。
(5)dNTPs濃度的優化 通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選1mmol/L作為試劑盒反應體系中dNTPs的使用量。〕(6)探針濃度的優化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將禽流感H5、H7和H9亞型的探針濃度分別從0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比連續稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.2μmol/L。
利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的禽流感H5、H7和H9實時熒光RT-PCR反應體系為50μl體系，所需各組分及相應濃度見表1。
表1禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR反應中的各組分情況
注1.在多重實時熒光RT-PCR反應體積不同時，各試劑應按比例調整。
2.使用的儀器不同，應將反應參數作適當調整。
3.根據檢測樣本來源不同，應適當調整模板加量。
儀器檢測通道的選擇在進行禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR反應時，應對所用儀器中反應管熒光信號的收集進行設置，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。
實施例1(1)待測模板的制備方法一 利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA，具體操作步驟如下a.取560μl含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的微量離心管中；b.加入140μl血漿、血清、尿樣、細胞培養上清液或拭子的PBS清洗液，旋渦振蕩15sec；c.于室溫(15-25℃)下孵育10min；d.瞬時離心以便將蓋上的液體離心至離心管內；e.再加入560μl無水乙醇，旋渦振蕩15sec，瞬時離心，將蓋上的液體離心至離心管內；f.小心吸取630μl上述液體至QIAamp離心柱內(置于2 ml的收集管內)，不要弄濕管口邊緣，8000rpm離心1min。棄去含有液體的收集管，將QIAamp離心柱放置于另一2ml的收集管中；g.小心打開QIAamp離心柱蓋，重復步驟f；h.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW1緩沖液，8000rpm離心1min。將QIAamp離心柱放置于另一個干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管；i.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW2緩沖液，14000rpm離心3min。將QIAamp離心柱放置于另一個干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管，再次14000rpm離心1min；j.將QIAamp離心柱放置于一個干凈的1.5ml的離心管中，小心打開柱蓋，加入60μl AVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min后，8000rpm離心1min即獲得病毒RNA，-20℃儲存備用。
方法二 用Trizol核酸抽提試劑的提取方法a.收獲禽流感病毒致死雞胚的尿囊液，12000rpm離心去除大分子雜質。將100μl上清液加入1.5ml的離心管中，再向其中加入300μl的TrizoL組織抽提液，于振蕩器上充分振蕩。然后13000rpm離心15min，將上清移至1.5ml的離心管中；b.向上清液中加400μl的預冷異丙醇，在振蕩器上充分振蕩后；c.13000rpm離心10min以便獲得RNA沉淀；d.小心倒掉上清，加入600μl 75％乙醇，用手上下顛倒數次洗滌。(注意不能劇烈振蕩，防止RNA的斷裂和RNA沉淀溶解后難以重新沉淀)；e.13000rpm離心10min，緩慢吸棄上清，室溫干燥約25min，待乙醇完全揮發后加25-40μl無RNA酶的水溶解(充分彈動混勻，或用槍反復吹打)，-20℃儲存備用。
(2)禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR反應的擴增條件根據表1加樣，將加好樣的PCR管放在熒光PCR儀中，設置相應熒光收集條件后進行擴增，反應程序如下50℃ 30min進行RNA的反轉錄，95℃ 3min滅活反轉錄酶；95℃ 15sec變性，55℃ 30sec退火，72℃ 1min延伸，如此重復5個循環進行預擴增；95℃ 10sec變性，60℃ 40sec退火、延伸，如此重復40個循環進行目的片段的擴增檢測，試驗結果可以實時監測。
(3)禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR的檢測結果在50μl反應體系中，利用針對禽流感H5、H7和H9亞型的特異性引物和探針進行三重實時熒光RT-PCR，檢測含有禽流感病毒H5、H7和H9亞型基因組RNA的陽性樣品，結果可以得到特異性的熒光曲線(圖2)。
以上試驗結果表明，本發明設計的引物和探針特異且工作性能良好，并建立了禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR檢測的方法。
實施例2禽流感H5和H9亞型二重實時熒光RT-PCR檢測在50μl反應體系中，利用針對禽流感H5和H9亞型的特異性引物和探針進行二重實時熒光RT-PCR，檢測含有禽流感病毒H5和H9亞型基因組RNA的陽性樣品，結果可以得到特異性的熒光曲線(圖3)。
實施例3禽流感H7和H9亞型二重實時熒光RT-PCR檢測在50μl反應體系中，利用針對禽流感H7和H9亞型的特異性引物和探針進行二重實時熒光RT-PCR，檢測含有禽流感病毒H7和H9亞型基因組RNA的陽性樣品，結果可以得到特異性的熒光曲線(圖4)。
實施例4禽流感H5和H7亞型二重實時熒光RT-PCR檢測在50μl反應體系中，利用針對禽流感H5和H7亞型的特異性引物和探針進行二重實時熒光RT-PCR，檢測含有禽流感病毒H5和H7亞型基因組RNA的陽性樣品，結果可以得到特異性的熒光曲線(圖5)。
實施例5按常規方法制備合成相應引物和探針后，與實時熒光RT-PCR所需試劑及陽性對照核苷酸組裝成禽流感H5、H7和H9亞型三重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。
H5-H7-H9序列表序列表<110>深圳太太基因工程有限公司中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局<120>用于禽流感H5、H7和H9亞型多重實時熒光RT-PCR檢測的引物、探針序列和方法<140>200410027815.5<141>2004-06-25<160>24<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gaccagctac catgattgcc a 21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2ggagtcaaat ttggaatcaa tgg 23<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3ctggtcgatg gtactaacgg t 21<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4cctcagttta aaccttagtt acc 23<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列
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權利要求
1.一種能同時檢測禽流感H5、H7和H9亞型的多重實時熒光RT-PCR方法，其特征在于所述的方法包括(1)通過對禽流感病毒H5、H7和H9亞型已知基因組序列的比較分析，設計出能分別檢測禽流感病毒H5、H7和H9亞型的引物和探針序列；(2)采用Joe、Rox、Ned、Hex、Tet、Fam或Vic熒光素分別標記用于檢測禽流感病毒H5、H7、H9亞型的探針序列；(3)將分別用于禽流感病毒H5和H7或H5和H9或H7和H9兩種不同亞型的引物和探針，或分別用于禽流感病毒H5、H7、H9三種不同亞型的引物和探針置于同一個反應管中，使用熒光PCR檢測儀進行實時熒光RT-PCR反應。
2.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H5亞型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物Hfpf1673序列為GACCAGCTACCATGATTGCCA和下游引物Hfpr1600序列為GGAGTCAAATTTGGAATCAATGG組成的引物對；以及上游引物的互補序列CTGGTCGATGGTACTAACGGT和下游引物的互補序列CCTCAGTTTAAACCTTAGTTACC；該引物對的上游引物Hfpf1673位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物H5pr1600位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
3.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H5亞型的探針序列，其特征在于所述的探針H5pb1655序列為TGCTAGGGAACTCGCCA，互補序列為ACGATCCCTTGAGCGGT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及其互補序列。
4.根據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H7亞型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf1292序列為CGTGTCCAATTAATGACATTTCC和下游引物H7N2pr1202序列為ATCACAGGCAAATTGAATCGT組成的引物對；以及上游引物的互補序列GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG和下游引物的互補序列TAGTGTCCGTTTAACTTAGCA；該引物對的上游引物H7N2pf1292位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7N2pr1202位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
5.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H7亞型的探針序列，其特征在于所述的探針H7N2pb1247序列為TTTGAGCTGATAGACAATGA，互補序列為AAACTCGACTATCTGTTACT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及其互補序列。
6.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H7亞型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7Nxpf1664序列為GCCATTGCAATGGGCCT和下游引物H7Nxpr1736序列為AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA組成的引物對，以及上游引物的互補序列CGGTAACGTTACCCGGA和下游引物的互補序列TCATCTTTGTTCCCACAAAAAAGGT；該引物對的上游H7Nxpf1664位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7Nxpr1736位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
7.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H7亞型的探針序列，其特征在于所述的探針H7Nxpb1712序列為CGGTGCACTATTTGTATA，互補序列為GCCACGTGATAAACATAT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及其互補序列。
8.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H9亞型的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H9pf151序列為CCTGTGACACATGCCAAAGA和下游引物H9pr302序列為CTTTCGACRATGTAGGACCATTC組成的引物對；以及上游引物的互補序列GGACACTGTGTACGGTTTCT和下游引物的互補序列GAAAGCTGYTACATCCTGGTAAG；該引物對的上游引物H9pf151位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H9pr302位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
9.據權利要求1所述的用于檢測禽流感病毒H9亞型的探針序列，其特征在于所述的探針H9pb175序列為CTCCACACAGAGCACAAT，互補序列為GAGGTGTGTCTCGTGTTA，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
全文摘要
用于高致病性禽流感H5、H7和H9亞型多重實時熒光RT－PCR檢測的核苷酸引物、探針序列和方法；涉及高致病性禽流感H5、H7和H9核苷酸片斷的RT－PCR擴增引物和探針及其互補序列，以及同時進行禽流感H5、H7和H9亞型的分型檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK1670221SQ20041002781
公開日2005年9月21日 申請日期2004年6月25日 優先權日2004年6月25日
發明者林鏡中, 肖性龍, 秦智鋒, 呂建強, 鐘安清, 劉勝利, 金顯忠 申請人:深圳太太基因工程有限公司, 中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局