專利名稱：用于禽流感h7亞型實時熒光rt－pcr檢測的引物和探針序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及高致病性禽流感H7亞型核苷酸片斷的RT-PCR擴增引物和探針序列。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza，AI)也叫歐洲雞瘟或真性雞瘟，是由A型流感病毒引起的一種急性高度接觸性傳染病，是國際公認的一種毀滅性疾病，可以經豬或其它動物傳播給人，因此具有十分重要的生態學和公共衛生學意義，尤其是高致病性禽流感被世界動物衛生組織列為A類傳染病。
近些年發現，禽流感不僅嚴重危害禽類，而且也危害哺乳動物，尤其是可以感染人并致人死亡，極大地威脅著人類公共衛生安全。禽流感病毒屬于RNA病毒，和所有的RNA病毒一樣，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，基因組轉錄時有較高的錯誤率，而且其基因組是分節段的，極易發生重排，因此禽流感病毒具有高度的變異性。其基因組中編碼糖蛋白HA和NA的基因片段及編碼非結構蛋白NS1和NS2的基因片段，在不同的流感毒株之間存在較大差異，而其它基因在禽流感病毒基因組中相對保守。研究發現，禽流感病毒的致病力主要取決于宿主與病毒之間的相互作用關系，而病毒的不同基因片段在決定病毒致病性方面也有不同的作用，其中起主要作用的是編碼HA蛋白的基因。通過對大量禽流感病毒HA核苷酸序列和氨基酸序列的分析、比較，發現HA裂解位點的氨基酸序列決定禽流感病毒的毒力，高致病性禽流感的HA裂解位點有6個連續的堿性氨基酸，而低致病性禽流感有2個堿性氨基酸。
實時熒光PCR技術是具有巨大發展潛力的高新檢測技術，在許多領域已得到了廣泛應用，因此可以利用其解決禽流感病毒多血清型和高變異性給臨床檢測造成的難題。實時熒光定量PCR技術是于1996年首次推出的，該技術不僅實現了PCR方法從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、檢測周期更短、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等優點，目前已得到廣泛應用。
常規反轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是先將RNA反轉錄成cDNA，然后利用DNA聚合酶在體外快速擴增目的DNA片斷的技術。熒光實時RT-PCR是在普通RT-PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，該探針為兩端分別標記熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，從而檢測不到該探針熒光基團所發出的熒光信號，而在PCR擴增時，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結合在目的擴增片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，此時可以檢測到熒光報告基團的熒光信號，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比。
由于禽流感病毒具有多個亞型且變異快，國內外疫情的發生情況又較復雜，所以迫切需要建立一種特異敏感、準確可靠、快速簡便的高致病性禽流感檢測方法，用于快速檢測國內外主要流行的高致病性禽流感病毒亞型，從而滿足進出口檢驗檢疫和疫病監控的需要。
發明內容
本發明的目的是提供用于檢測禽流感病毒H7亞型的PCR引物和探針序列。
本發明采用以下技術方案分析所有已報道的禽流感H7亞型基因組序列，分別設計引物和熒光探針。在常規RT-PCR檢測技術的基礎上，添加一條標記了兩個熒光基團的核苷酸探針，熒光報告基團(R)標記在探針的5’端，熒光淬滅基團(Q)標記在探針的3’端，兩者構成能量轉移結構，即熒光報告基團所發射的熒光可被熒光淬滅基團吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告基團熒光信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，熒光淬滅基團(Q)的抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，從而進行禽流感H7亞型的檢測。實時熒光RT-PCR檢測反應原理見圖1。
用于檢測禽流感H7亞型的核苷酸擴增用引物序列和探針序列包括1.由上游引物H7N2pf1292序列為CGTGTCCAATTAATGACATTTCC及互補序列為GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG，下游引物H7N2pr1202序列為ATCACAGGCAAATTGAATCGT及互補序列為TAGTGTCCGTTTAACTTAGCA組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7N2pb1247序列為TTTGAGCTGATAGACAATGA及互補序列為AAACTCGACTATCTGTTACT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
2.由上游引物H7N2pf1010序列為CTCATTCCTGTAGCCARAAGGAG及互補序列為GAGTAAGGACATCGGTYTTCCTC，下游引物H7N2pr828序列為CCCCTGACAGGGCAAGTTT及互補序列為GGGGACTGTCCCGTTCAAA組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7N2pb945序列為5TGCCATTCCAAAACAT及互補序列為ACGGTAAGGTTTTGTA，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
3.由上游引物H7N2pf810序列為TTCAATGGGGCATTCATAGC及互補序列為AAGTTACCCCGTAAGTATCG，下游引物H7N2pr944序列為GTTGATGTTTTGGAATGGCAG及互補序列CAACTACAAAACCTTACCGTC組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7N2pb830序列為CCTGACAGGGCAAGTTT及互補序列為GGACTGTCCCGTTCAAA，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
4.由上游引物H7Nxpf1664序列為GCCATTGCAATGGGCCT及互補序列為CGGTAACGTTACCCGGA，下游引物H7Nxpr1736序列為AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA及互補序列為TCATCTTTGTTCCCACAAAAAAGGT組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7Nxpb1712序列為CGGTGCACTATTTGTATA及互補序列為GCCACGTGATAAACATAT，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
5.由上游引物H7Nxpf1614序列為AAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCG及互補序列為TTCTACACTATGAAACCAAATCGAAGC，下游引物H7Nxpr1701序列為GTGCACCGCATGTTTCCAT及互補序列為CACGTGGCGTACAAAGGTA組成的引物對，以及該引物對的上游引物位置向5’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基、向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列；探針H7Nxpb1665序列為CCATTGCAATGGGCCT及互補序列為GGTAACGTTACCCGGA，該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。引物和探針設計通過分別對所有已經報道的禽流感病毒H7亞型基因組序列進行比較分析，選擇無二級結構且高度保守的核苷酸區段設計多對引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內無互補序列。最優引物、探針序列如下H7N2pf12925’-CGTGTCCAATTAATGACATTTCC-3’H7N2pr12025’-ATCACAGGCAAATTGAATCGT-3’H7N2pb12475’-TTTGAGCTGATAGACAATGA-3’H7Nxpf16645’-GCCATTGCAATGGGCCT-3’H7Nxpr17365’-AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA-3’H7Nxpb17125’-CGGTGCACTATTTGTATA-3’
將上述引物、探針序列優化組合后，建立檢測禽流感H7亞型的實時熒光RT-PCR檢測方法，并制成用于檢測禽流感H7亞型的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。
禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的方法采用以下步驟(1)選取權利要求1-20中所述的引物和探針；(2)制備待測模板，提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA；(3)反應體系的建立，a、確定最佳引物濃度；b、確定鎂離子濃度；c、確定反轉錄酶(AMVRnaseXL)用量；d、確定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；e、確定dNTPs濃度；f、確定最佳探針濃度；(4)選擇儀器的檢測通道；(5)上機檢測。
禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測方法中的待測模板的制備可采用方法QIAampViral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA。
本發明的顯著特點是充分運用PCR技術的高效擴增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測技術的快速敏感性，具有結果可靠和準確靈敏、操作簡單、省時省力、降低檢測成本、提高檢測效率等優點。
圖1 Taqman探針的實時熒光RT-PCR檢測原理圖。
圖2 禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測曲線圖。
圖3 禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗檢測曲線圖。
圖4 禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR方法的敏感性試驗檢測曲線圖。
具體實施例方式
反應體系的建立和優化禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR反應體系的建立和優化利用滅活的禽流感病毒H7亞型毒株作為待檢樣品，利用QIAamp Viral RNA Mini kit或Trizol核酸抽提試劑的提取方法提取病毒基因組RNA，分別分裝后儲存于-20℃備用。
(1)引物濃度的優化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將H7的引物濃度分別從0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比連續稀釋，通過試驗結果的分析比較，確定最佳引物終濃度為0.4μmol/L。
(2)鎂離子濃度的優化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度從1mmol/L至10mmol/L以1mmol/L遞增，經過多次重復實驗選定5mmol/L為試劑盒反應體系中的鎂離子濃度。
(3)反轉錄酶(AMV RnaseXL)用量的優化 經過使用不同濃度AMV RNaseXL的試驗結果比較，選定5U作為試劑盒反應體系中AMV RnaseXL的用量。
(4)Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的優化 通過比較Taq酶用量(以單位Unit計)的優化實驗結果，選定5U作為試劑盒反應體系中Taq酶的用量。
(5)dNTPs濃度的優化 通過使用不同濃度的dNTPs進行檢測，綜合評估后選1mmol/L作為試劑盒反應體系中dNTPs的使用量。
(6)探針濃度的優化 在反應體系中其它條件相同的情況下，將禽流感H7亞型的探針濃度分別從0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比連續稀釋后進行檢測，通過試驗結果的分析比較，確定最佳探針終濃度為0.2μmol/L。
利用上述引物和探針進行反應體系的建立，最后確定采用的禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR反應體系為25μl體系，所需各組分及相應濃度見表1。
表1禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR反應中的各組分情況
注1.在多重實時熒光RT-PCR反應體積不同時，各試劑應按比例調整。
2.使用的儀器不同，應將反應參數作適當調整。
3.根據檢測樣本來源不同，應適當調整模板加量。
儀器檢測通道的選擇在進行禽流H7亞型實時熒光RT-PCR反應時，應對所用儀器中反應管熒光信號的收集進行設置，選擇的熒光檢測通道與探針所標記的熒光報告基團一致。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。
實施例1(1)待測模板的制備方法一 利用QIAamp Viral RNA Mini kit提取各種來源樣品中禽流感病毒的基因組RNA，具體操作步驟如下a.取560μl含載體RNA的AVL緩沖液至1.5ml的微量離心管中；b.加入140μl血漿、血清、尿樣、細胞培養上清液或拭子的PBS清洗液，旋渦振蕩15sec；c.于室溫(15-25℃)下孵育10min；d.瞬時離心以便將蓋上的液體離心至離心管內；e.再加入560μl無水乙醇，旋渦振蕩15sec，瞬時離心，將蓋上的液體離心至離心管內；f.小心吸取630μl上述液體至QIAamp離心柱內(置于2ml的收集管內)，不要弄濕管口邊緣，8000rpm離心1min。棄去含有液體的收集管，將QIAamp離心柱放置于另一2ml的收集管中；g.小心打開QIAamp離心柱蓋，重復步驟f；h.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW1緩沖液，8000rpm離心1min。將QIAamp離心柱放置于另一個干凈的2ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管；i.小心打開QIAamp離心柱蓋，加入500μl的AW2緩沖液，14000rpm離心3min。將QIAamp離心柱放置于另一個干凈的2 ml的收集管上，棄掉含有液體的收集管，再次14000rpm離心1min；j.將QIAamp離心柱放置于一個干凈的1.5ml的離心管中，小心打開柱蓋，加入60μlAVE洗脫緩沖液，室溫孵育1min后，8000rpm離心1min即獲得病毒RNA，-20℃儲存備用。
方法二 用Trizol核酸抽提試劑的提取方法a.收獲禽流感病毒致死雞胚的尿囊液，12000rpm離心去除大分子雜質。將100μl上清液加入1.5ml的離心管中，再向其中加入300μl的TrizoL組織抽提液，于振蕩器上充分振蕩。然后13000rpm離心15min，將上清移至1.5ml的離心管中；b.向上清液中加400μl的預冷異丙醇，在振蕩器上充分振蕩后；c.13000rpm離心10min以便獲得RNA沉淀；d.小心倒掉上清，加入600μl75％乙醇，用手上下顛倒數次洗滌。(注意不能劇烈振蕩，防止RNA的斷裂和RNA沉淀溶解后難以重新沉淀)；e.13000rpm離心10min，緩慢吸棄上清，室溫干燥約25min，待乙醇完全揮發后加25-40μl無RNA酶的水溶解(充分彈動混勻，或用槍反復吹打)，-20℃儲存備用。
(2)禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR反應的擴增條件根據表1加樣，將加好樣的PCR管放在熒光PCR儀中，設置相應熒光收集條件后進行擴增，反應程序如下50℃ 30min進行RNA的反轉錄，95℃ 3min滅活反轉錄酶；95℃ 15sec變性，55℃ 30sec退火，72℃ 1min延伸，如此重復5個循環進行預擴增；
95℃ 10sec變性，60℃ 40sec退火、延伸，如此重復40個循環進行目的片段的擴增檢測，試驗結果可以實時監測。
(3)禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR的檢測結果在25μl反應體系中，利用針對禽流感H7亞型的特異性引物和探針進行實時熒光RT-PCR，檢測含有禽流感病毒H7亞型基因組RNA的陽性樣品，結果可以得到特異性的熒光曲線(圖2)。
以上試驗結果表明，本發明設計的引物和探針特異且工作性能良好，并建立了禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的方法。
實施例2禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR方法的特異性試驗在25μl反應體系中，同時加入禽流感病毒H5、H7、H9亞型的基因組RNA作為模板，運用針對禽流感H7亞型的引物、探針進行實時熒光RT-PCR檢測，結果只得到H7亞型的特異性熒光曲線，表明該方法只對H7亞型具有特異性擴增，對H5、H9亞型無擴增，證實本發明涉及的針對禽流感H7亞型的引物、探針具有很強的特異性(圖3)。
實施例3禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR方法的敏感性試驗在25μl禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR反應體系中，將禽流感病毒H7亞型的基因組RNA作10倍連續稀釋，進行針對H7亞型的實時熒光RT-PCR敏感性檢測，得到稀釋梯度系列擴增曲線(圖4)。
以上試驗結果表明，本發明涉及的禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR方法敏感性很高，可以檢測到樣品中微量存在的禽流感H7亞型。
本發明提供的用于檢測禽流感H7熒光探針的使用進一步提高了檢測的特異性，從而可以達到省時省力、降低檢測成本、提高檢測速度和效率的目的。
本發明對禽流感H7亞型的檢測靈敏度為10-5，可以滿足各種樣品的檢測要求。
利用本發明進行檢測，操作簡便快速，一般可在2小時左右完成，而且可以在檢測過程中實時監測結果，不需要進行擴增產物的電泳觀察，避免了擴增產物之間的污染以及電泳觀察時EB對環境的污染。
H7序列表序列表<110>深圳太太基因工程有限公司中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局<120>用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物和探針序列<140>200410027813.6<141>2004-06-25<160>30<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1cgtgtccaat taatgacatt tcc 23<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2atcacaggca aattgaatcg t 21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3gcacaggtta attactgtaa agg 23<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4tagtgtccgt ttaacttagc a 21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5
H7序列表tttgagctga tagacaatga 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6aaactcgact atctgttact 20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>7ctcattcctg tagccaraag gag 23<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8cccctgacag ggcaagttt 19<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>9gagtaaggac atcggtyttc ctc 23<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>10ggggactgtc ccgttcaaa 19<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>11tgccattcca aaacat 16
H7序列表<210>12<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>12acggtaaggt tttgta 16<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>13ttcaatgggg cattcatagc 20<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14gttgatgttt tggaatggca g 21<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>15aagttacccc gtaagtatcg 20<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>16caactacaaa accttaccgt c 21<210>17<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>17cctgacaggg caagttt17<210>18
H7序列表<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>18ggactgtccc gttcaaa17<210>19<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>19gccattgcaa tgggcct17<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>20agtagaaaca agggtgtttt ttcca 25<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>21cggtaacgt t acccgga 17<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>22tcatctttgt tcccacaaaa aaggt 25<210>23<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>23cggtgcacta tttgtata 18<210>24<211>18<212>DNA
H7序列表<213>人工序列<400>24gccacgtgat aaacatat 18<210>25<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>25aagatgtgat actttggttt agcttcg 27<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>26gtgcaccgca tgtttccat 19<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>27ttctacacta tgaaaccaaa tcgaagc 27<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>28cacgtggcgt acaaaggta 19<210>29<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>29ccattgcaat gggcct 16<210>30<211>16<212>DNA<213>人工序列
H7序列表<400>30ggtaacgtta cccgga 1權利要求
1.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf1292序列為CGTGTCCAATTAATGACATTTCC和下游引物H7N2pr1202序列為ATCACAGGCAAATTGAATCGT組成的引物對，以及上游引物的互補序列GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG和下游引物的互補序列TAGTGTCCGTTTAACTTAGCA。
2.根據權利要求1所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf1292位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7N2pr1202位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
3.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H7N2pb1247序列為TTTGAGCTGATAGACAATGA，以及其互補序列為AAACTCGACTATCTGTTACT。
4.根據權利要求3所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H7N2pb1247向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
5.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf1010序列為CTCATTCCTGTAGCCARAAGGAG和下游引物H7N2pr828序列為CCCCTGACAGGGCAAGTTT組成的引物對，以及上游引物的互補序列GAGTAAGGACATCGGTYTTCCTC和下游引物的互補序列GGGGACTGTCCCGTTCAAA。
6.根據權利要求5所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf1010位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7N2pr828位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
7.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H7N2pb945序列為TGCCATTCCAAAACAT，以及其互補序列為ACGGTAAGGTTTTGTA。
8.根據權利要求7所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H7N2pb945向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
9.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf810序列為TTCAATGGGGCATTCATAGC和下游引物H7N2pr944序列為GTTGATGTTTTGGAATGGCAG組成的引物對，以及上游引物的互補序列AAGTTACCCCGTAAGTATCG和下游引物的互補序列CAACTACAAAACCTTACCGTC。
10.根據權利要求9所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7N2pf810位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7N2pr944位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
11.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H7N2pb830序列為CCTGACAGGGCAAGTTT，以及其互補序列為GGACTGTCCCGTTCAAA。
12.根據權利要求11所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H7N2pb830向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
13.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7Nxpf1664序列為GCCATTGCAATGGGCCT和下游引物H7Nxpr1736序列為AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTCCA組成的引物對，以及上游引物的互補序列CGGTAACGTTACCCGGA和下游引物的互補序列TCATCTTTGTTCCCACAAAAAAGGT。
14.根據權利要求13所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游H7Nxpf1664位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7Nxpr1736位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
15.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H7Nxpb1712序列為CGGTGCACTATTTGTATA，以及其互補序列為GCCACGTGATAAACATAT。
16.根據權利要求15所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H7Nxpb1712向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
17.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7Nxpf1614序列為AAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCG和下游引物H7Nxpr1701序列為GTGCACCGCATGTTTCCAT組成的引物對，以及上游引物的互補序列TTCTACACTATGAAACCAAATCGAAGC和下游引物的互補序列CACGTGGCGTACAAAGGTA。
18.根據權利要求17所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的引物序列，其特征在于所述的引物序列包括由上游引物H7Nxpf1614位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物H7Nxpr1701位置向3’端方向延伸10個堿基，向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列。
19.一種用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針H7Nxpb1665序列為CCATTGCAATGGGCCT，以及其互補序列為GGTAACGTTACCCGGA。
20.根據權利要求19所述的用于禽流感H7亞型實時熒光RT-PCR檢測的探針序列，其特征在于所述的探針序列包括由探針H7Nxpb1665向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列。
全文摘要
一種用于高致病性禽流感H7亞型核苷酸片斷的RT－PCR擴增引物和探針序列。引物序列包括由上游引物H7N2pf1292序列為CGTGTCCAATTAATGACATTTCC和下游引物H7N2pr1202序列為ATCACAGGCAAATTGAATCGT組成的引物對，以及上游引物的互補序列GCACAGGTTAATTACTGTAAAGG和下游引物的互補序列GAGGTGTGTGTCGTGTTA，并由上游引物位置向3’端方向延伸10個堿基，下游引物位置向3’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的引物序列及互補序列等。探針序列包括探針H7N2pb1247序列為TTTGAGCTGATAGACAATGA及互補序列為AAACTCGACTATCTGTTACT，以及該探針向3’端方向延伸10個堿基和向5’端方向延伸10個堿基區域范圍內得到的探針序列及互補序列等。
文檔編號C12Q1/68GK1670220SQ20041002781
公開日2005年9月21日 申請日期2004年6月25日 優先權日2004年6月25日
發明者鐘安清, 林鏡中, 呂建強, 肖性龍, 秦智鋒, 劉勝利, 金顯忠 申請人:深圳太太基因工程有限公司, 中華人民共和國深圳出入境檢驗檢疫局