專利名稱：一種制備木瓜蛋白酶的方法
技術領域：
本發明為純化木瓜蛋白酶的工藝，屬生物技術領域。
背景技術：
木瓜蛋白酶廣泛存在于番木瓜莖葉和果實中，以未成熟果實的乳汁中為最高。因其含量高、穩定性好、蛋白水解能力強，對多種蛋白質均具有很好的降解作用，目前已被廣泛應用于各個行業。在食品中，用于肉類嫩化、啤酒澄清、飼料添加劑，餅干松化劑和魚類加工；在工業上，用于明膠制造、蠶繭脫膠、皮革脫毛等；在醫療衛生方面，用于驅腸蟲劑，用于治療消化不良、各種炎癥和水腫，防止腹膜粘連，處理血栓及創傷脫痂。從中提純的木瓜凝乳酶在治療骨質增生、檢測血型、腫瘤輔助冶療等方面用途廣泛、療效顯著。
近年來，雖然有關木瓜蛋白酶的研究工作已有很多報道，但還是存在著木瓜蛋白酶提純的純度低，一般在200萬單位/克以下，同時還未有從中提取木瓜凝乳酶。
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述缺點，而提供一種制備木瓜蛋白酶的方法，它即提高了木瓜蛋白酶的純度，同時還能從中提取木瓜凝乳酶。
本發明的方法包括以下步驟1、粗酶制備取新鮮木瓜乳汁，經攪拌使其液化，過濾，加入等量含0.1-0.4mmol/L硫代硫酸鈉，0.5-2mmol/L氯化鈉和0.01-0.08mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均勻后，緩慢加入已溶解的丹寧溶液至濃度達到0.05-0.2％，靜置，用鹽酸調PH至2.5-5.5，3500r/min離心10-30min，沉淀于50-70℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，該粗酶活力達到100萬單位/克以上；2、精酶制備取上述固體粗酶，加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的溶液中，其硫代硫酸鈉溶液的PH值5.00-8.00，研磨，過濾，濾液用0.05-2mol/L氫氧化鈉調PH至7.0-10.0，不斷攪動5-20分鐘，過濾，濾液中加硫酸銨至40-60％飽和度，20000×g離心30分鐘，沉淀用0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉溶解，再加入硫酸銨至50-60％飽和度，離心，沉淀溶于含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的0.05-0.02mol/L磷酸緩沖液，磷酸緩沖液PH值為6.5-8.5，加入氯化鈉到終濃度5-20％，室溫靜置20-40分鐘，4℃時于16-20小時至結晶析出，冰凍干燥，4℃冰箱保存，該精酶活力達到200萬單位/克以上；3、純化酶制備取上述冰凍干燥酶于室溫下對0.05-0.2mol/L乙酸鈉級沖液透析8-12小時，乙酸鈉級沖液的pH為4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm的SP-SePhadex50柱進行梯度洗脫，洗脫液為含0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的0.1-1.0mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.1-0.6ml/min；分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，該純化酶活力達到300萬單位/克以上。
4、木瓜凝乳酶的制備取上述冰凍干燥純化酶于室溫下加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的溶液中，硫代硫酸鈉的溶液的pH值為5.00-8.00，研磨，過濾，濾液對0.05-0.2mol/L乙酸鈉緩沖液透析8-12小時，乙酸鈉緩沖液的pH值為4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm陽離子交換柱進行梯度洗脫，洗脫液為含0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的0.1-1.0mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.1-0.6ml/min；分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，該木瓜凝乳酶活力達到200萬單位/克以上。
本發明的有益效果是木瓜蛋白酶提純的純度高，一般在200萬單位/克以上，同時從中還可提取木瓜凝乳酶。
具體實施例方式
實施例1制備木瓜蛋白酶的方法，步驟為1、粗酶制備取新鮮木瓜乳汁100克，經攪拌使其液化，過濾，加入等量含0.3mmol/L硫代硫酸鈉，2mmol/L氯化鈉和0.04mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均勻后，緩慢加入已溶解的丹寧溶液至濃度達到0.12％，靜置，用鹽酸調pH至5.5，3500r/min離心30min，沉淀于60℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，該粗酶活力達到100萬單位/克以上。
2、精酶制備取上述固定粗酶，加入含0.05mmol/L半胱氨酸和0.09mmol/L硫代硫酸鈉的溶液pH6.0中，研磨，過濾，濾液用0.15mol/L氫氧化鈉調pH至8.0，不斷攪動10分鐘，過濾，濾液中加硫酸銨至50％飽和度，20000×g離心30分鐘，沉淀用0.08mmol/L硫代硫酸鈉溶解，再加入硫酸銨至50％飽和度，離心，沉淀溶于含0.03mmol/L半胱氨酸和1mmol/L硫代硫酸鈉的0.08mol/L磷酸緩沖液pH6.8，加入氯化鈉到終濃度9％，室溫靜置28分鐘，4℃19小時至結晶析出，冰凍干燥，4℃冰箱保存，該精酶活力達到200萬單位/克以上。
3、純化酶制備取上述冰凍干燥酶于室溫下對0.09mol/L乙酸鈉級沖液pH4.8透析10小時，然后上SP-SePhadex50柱2.0cm×2.0cm進行梯度洗脫，洗脫液為含0.08mmol/L硫代硫酸鈉的0.7mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.5ml/min。分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，得純化酶。該純化酶活力達到300萬單位/克以上。
4、木瓜凝乳酶的制備取上述冰凍干燥純化酶于室溫下加入含0.04mmol/L半胱氨酸和1mmol/L硫代硫酸鈉的溶液pH6.0中，研磨，過濾，濾液對0.08mol/L乙酸鈉緩沖液pH5.0透析8小時，然后上陽離子交換柱2.0cm×2.0cm進行梯度洗脫，洗脫液為含1mmol/L硫代硫酸鈉的0.12mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.5ml/min。分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，該木瓜凝乳酶活力達到200萬單位/克以上。
實施例2制備木瓜蛋白酶的方法，步驟為1、粗酶制備取新鮮木瓜乳汁100克，經攪拌使其液化，過濾，加入等量含0.25mmol/L硫代硫酸鈉，1mmol/L氯化鈉和0.03mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均勻后，緩慢加入已溶解的丹寧溶液至濃度達到0.15％，靜置，用鹽酸調pH至4.5，3500r/min離心25min，沉淀于55℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，該粗酶活力達到100萬單位/克以上。
2、精酶制備取上述固定粗酶，加入含0.03mmol/L半胱氨酸和0.08mmol/L硫代硫酸鈉的溶液PH6.0中，研磨，過濾，濾液用1.5mol/L氫氧化鈉調pH至9.0，不斷攪動15分鐘，過濾，濾液中加硫酸銨至55％飽和度，20000×g離心25分鐘，沉淀用0.09mmol/L硫代硫酸鈉溶解，再加入硫酸銨至55％飽和度，離心，沉淀溶于含0.04mmol/L半胱氨酸和1.5mmol/L硫代硫酸鈉的1.0mol/L磷酸緩沖液pH7.2，加入氯化鈉到終濃度10％，室溫靜置30分鐘，4℃18小時至結晶析出，冰凍干燥，4℃冰箱保存，該精酶活力達到200萬單位/克以上。
3、純化酶制備取上述冰凍干燥酶于室溫下對0.06mol/L乙酸鈉級沖液pH5.2透析12小時，然后上SP-SePhadex50柱2.0cm×2.0cm進行梯度洗脫，洗脫液為含0.1mmol/L硫代硫酸鈉的0.7mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.6ml/min。分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，該純化酶活力達到300萬單位/克以上。
4、木瓜凝乳酶的制備取上述冰凍干燥純化酶于室溫下加入含0.03mmol/L半胱氨酸和0.8mmol/L硫代硫酸鈉的溶液pH5.5中，研磨，過濾，濾液對1.0mol/L乙酸鈉緩沖液PH5.5透析12小時，然后上陽離子交換柱2.0cm×2.0cm進行梯度洗脫，洗脫液為含0.8mmol/L硫代硫酸鈉的0.15mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.5ml/min。分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，該木瓜凝乳酶活力達到200萬單位/克以上。
權利要求
1.一種制備木瓜蛋白酶的方法，步驟為1)、粗酶制備取新鮮木瓜乳汁，經攪拌使其液化，過濾，加入等量含0.1-0.4mmol/L硫代硫酸鈉，0.5-2mmol/L氯化鈉和0.01-0.08mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均勻后，緩慢加入已溶解的丹寧溶液至濃度達到0.05-0.2％，靜置，用鹽酸調PH至2.5-5.5，3500r/min離心10-30min，沉淀于50-70℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，該粗酶活力達到100萬單位/克以上；2)、精酶制備取上述固體粗酶，加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的溶液中，其硫代硫酸鈉溶液的PH值5.00-8.00，研磨，過濾，濾液用0.05-2mol/L氫氧化鈉調PH至7.0-10.0，不斷攪動5-20分鐘，過濾，濾液中加硫酸銨至40-60％飽和度，20000×g離心30分鐘，沉淀用0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉溶解，再加入硫酸銨至50-60％飽和度，離心，沉淀溶于含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的0.05-0.02mol/L磷酸緩沖液，磷酸緩沖液PH值為6.5-8.5，加入氯化鈉到終濃度5-20％，室溫靜置20-40分鐘，4℃時于16-20小時至結晶析出，冰凍干燥，4℃冰箱保存，該精酶活力達到200-萬單位/克以上；3)、純化酶制備取上述冰凍干燥酶于室溫下對0.05-0.2mol/L乙酸鈉級沖液透析8-12小時，乙酸鈉級沖液的pH為4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm的SP-SePhadex50柱進行梯度洗脫，洗脫液為含0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的0.1-1.0mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.1-0.6ml/min；分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，得純化酶，該純化酶活力達到300萬單位/克以上。
2.根據權利要求1所述的一種制備木瓜蛋白酶的方法，步驟為取上述冰凍干燥純化酶于室溫下加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的溶液中，硫代硫酸鈉的溶液的pH值為5.00-8.00，研磨，過濾，濾液對0.05-0.2mol/L乙酸鈉緩沖液透析8-12小時，乙酸鈉緩沖液的pH值為4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm陽離子交換柱進行梯度洗脫，洗脫液為含0.05-2mmol/L硫代硫酸鈉的0.1-1.0mol/L乙酸鈉溶液，流速為0.1-0.6ml/min；分部收集，透析，冷凍干燥，4℃冰箱保存，得木瓜凝乳酶，該木瓜凝乳酶活力達到200萬單位/克以上。
全文摘要
一種制備木瓜蛋白酶的方法，屬生物技術領域。本發明的方法包括以下步驟粗酶制備，粗酶活力達到100萬單位/克以上；精酶制備，精酶活力達到200萬單位/克以上；純化酶制備，純化酶活力達到300萬單位/克以上；在此基礎上制得木瓜凝乳酶，木瓜凝乳酶活力達到200萬單位/克以上。本發明的方法，木瓜蛋白酶提純的純度高，一般在200萬單位/克以上，同時從中還可提取木瓜凝乳酶。用于純化木瓜蛋白酶。
文檔編號C12N9/50GK1597946SQ200410024540
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月9日 優先權日2004年8月9日
發明者王美嶺 申請人:王美嶺