測定中藥作用機理的方法

專利名稱：測定中藥作用機理的方法
技術領域：
本發明的技術方案涉及將生物傳感技術應用于測試或分析材料，具體說是應用生物傳感分析技術來測定中藥作用機理的方法。
背景技術：
在近半個世紀的中醫藥現代研究過程中，無論是對單味藥還是復方的組合運用，中藥的臨床療效和藥理研究較多，而對于中藥的作用機理，由于缺少適宜的研究方法和手段尚未深入研究，這成為中醫藥進一步研究和發展的瓶頸之一。近年來，隨著儀器分析技術的發展，如ESI/APCI-MS、NMR以及多學科在中醫藥研究上相互交流的增進，在中藥現代化研究領域中出現了一些新方法、新理論，如血清藥理學、初級的中藥效應成分動力學。這些成果對中醫藥的研究產生了新的推動，為中醫藥的研究增添了活力。日本富山醫科藥科大學在漢方藥的研究中借鑒了西藥藥物的研究方法，主要從單成分-單靶點研究中藥的有效成分，并對中藥有效成分的藥代動力學做了大量工作。近年來，基因芯片技術開始在中醫藥研究中得到應用，在中藥的物質基礎研究上取得進展，然而對細胞因子及其受體與中藥有效成分之間結合的強弱和結合過程無法進行研究，對中藥的作用機理仍解釋不清(張發寶.李欣梅.周逸平.基因芯片技術在中醫藥研究中的應用.安徽中醫學院學報2002，21(3))。中藥的作用機理說不清楚則會影響到中藥的出口，不利于中藥走向世界。
目前理論上較為普遍的觀點認為，中藥的作用機理可能是中藥能夠調節細胞因子網絡的功能態平衡(申維璽 劉玉梅.細胞因子網絡與中藥的作用機理.世界科學技術一中藥現代化.2000，2(6)24-27)，這只是一個觀點，還沒有得到實驗測定數據的證明。中藥對細胞因子網絡的調節作用是通過中藥對細胞因子與其受體之間的特異性親和作用的影響來實現的，如果能夠測定中藥有效成分對于細胞因子和受體間相互結合的影響情況，也就弄清了中藥的作用機理，并且可以由此進行中藥的篩選及其配伍。目前，雖然已有研究者應用分子生物學方法檢測相關細胞因子表達的變化(陳執中.生物特異相互作用分析及其應用進展.中國新藥雜志.2001；10(11)829；李紅，周謀.中藥對粘附分子表達調節的研究.中醫藥學報.2002；30(1)27-29)，但仍未見有測定中藥有效成分對于細胞因子與其受體間相互結合的影響情況的研究報道。
經專利文獻檢索，目前尚未發現有有關測定中藥作用機理的專利文獻報道。UnitedStates Patent Application 20020098590“Method and device for diagnosing diseasepatterns in Traditional Chinese Medicine”、United States Patent Application20030207280“Determination of physiological conditions defined in traditionalchinese medicine”和United States Patent 6,673,624“Method and device fordiagnosing disease patterns in Traditional Chinese Medicine”雖然屬于IPC分類G01N33/00—利用特殊的方法來測試或分析材料的技術領域，但與本發明的技術主題毫不相關。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種應用生物傳感分析技術來測定中藥作用機理的方法，該發明方法通過測定中藥有效成分對細胞因子與其受體間相互結合的影響情況，弄清中藥的作用機理，并且可以由此進行中藥的篩選及其配伍。
本發明解決該技術問題所采用的技術方案是應用親和型特異選擇性生物傳感器IAsys plus來檢測中藥有效成分與細胞因子的相互作用、與細胞因子受體的相互作用、以及對細胞因子與其受體間相互結合的影響情況，分析中藥有效成分的作用靶點和作用機理，具體的操作步驟是A.細胞因子生物素衍生化將4～100μg細胞因子加入200～500μL濃度為0.01mol/L pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中；將1～2mg SULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶解于120μL去離子水中，取其20～50μL加入上述細胞因子溶液中，混勻，室溫下避光反應4小時后，在4℃溫度下，以10000轉/分鐘超濾離心10分鐘，截留物溶解于200μL磷酸鹽緩沖液中，完成細胞因子生物素衍生化；B.細胞因子受體生物素衍生化將4～100μg細胞因子受體加入200～500μL0.01mol/L pH＝7.4磷酸鹽緩沖液中；1～2mg SULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶解于120μL去離子水中，取其20～50μL加入上述細胞因子受體溶液中，混勻，室溫避光反應4小時后，在4℃溫度下，以10000轉/分鐘超濾離心10分鐘，截留物溶解于200μL磷酸鹽緩沖液中，完成細胞因子受體生物素衍生化；C.將生物素衍生化的細胞因子受體接合在樣品池表面，觀察細胞因子與其受體相互作用(1)將親和型生物傳感系統IAsys plus開機預熱1小時，參數設置采樣間隔時間1秒，攪拌85轉/分，溫度22℃，親和型生物傳感系統IAsys plus是由Thermo LifeSciences公司提供，其樣品池表面已事先包被生物素；(2)將親和素Strepavidin接合至樣品池表面IAsys樣品池用40μL PBST洗3遍，平衡10分鐘，采集基線，加入20μL 2mg/mL親和素Strepavidin，反應10～20分鐘，用40μL PBST洗3遍，收集數據，PBST為含0.05％吐溫20(v/v)的磷酸鹽緩沖液；(3)生物素衍生化細胞因子受體包被樣品池在樣品池表面接合親和素Strepavidin的IAsys樣品池中加入上述B步中制取的20μL生物素衍生化的細胞因子受體，反應3～25分鐘，用40μL PBST洗3遍，采集數據；(4)細胞因子與其受體結合反應在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL細胞因子溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；D.將生物素衍生化的細胞因子受體接合在樣品池表面，觀察細胞因子受體與至少一種中藥有效成分的相互作用(1)同C步(1)；
(2)同C步(2)；(3)同C步(3)；(4)細胞因子受體與中藥有效成分結合反應在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為10-5～10-1M的20μL至少含一種中藥有效成分的溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；E.將生物素衍生化的細胞因子接合在樣品池表面，觀察細胞因子與至少一種中藥有效成分的相互作用(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)生物素衍生化細胞因子包被樣品池在經過上述(2)處理的IAsys樣品池中加入上述A步中制取的調節濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL生物素衍生化的細胞因子，反應3～25分鐘，用40μL PBST洗3遍，采集數據；(4)細胞因子與中藥有效成分結合反應在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為10-5～10-1M的20μL至少含一種中藥有效成分的溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；F.將生物素衍生化的細胞因子受體接合在樣品池表面，觀察中藥有效成分對細胞因子與其受體結合的影響(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)同C步(3)；(4)中藥有效成分對細胞因子與其受體結合的影響在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL細胞因子與濃度為10-5～10-1M的20μL至少一種中藥有效成分的混合液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；G.實驗結果對實驗采集數據所形成的反應曲線和結合曲線進行分析，可以確定中藥有效成分對細胞因子與其受體相互結合的影響，從而看出有些中藥有效成分可增強某些細胞因子與其受體的結合，有些中藥有效成分可抑制某些細胞因子與其受體的結合，有些中藥有效成分則不影響某些細胞因子與其受體的結合，由此，可進一步推論和證實中藥的作用機理影響細胞因子-受體體系的相互結合也是中藥有效成分在體內的作用位點之一，中藥有效成分通過調節某些細胞因子與其受體的相互結合，從而影響或改變細胞因子的功能與生理、病理作用，進而發揮對疾病的療效；進而根據不同中藥有效成分以及它們的不同配伍所進行的對比實驗，得出不同中藥有效成分及其不同的配伍對細胞因子與其受體結合影響的強弱程度，可進一步研究中藥配伍機理及藥物篩選和新藥開發。
本發明方法所選用的中藥有解表類藥麻黃或其配伍、杏仁或其配伍；清熱類藥黃連或其配伍、黃芩或其配伍；瀉下類藥大黃或其配伍、甘草或其配伍；利水滲濕類藥白術或其配伍、陳皮或其配伍；化濕藥及祛風濕類藥藿香或其配伍、半夏或其配伍；濕里類藥附子或其配伍、大黃或其配伍；止血藥及消食類藥三七或其配伍、大黃或其配伍；活血化瘀類藥川芎或其配伍、赤芍或其配伍；理氣類藥枳實或其配伍、厚樸或其配伍；化痰、止咳平喘類藥半夏或其配伍；開竅類藥牛黃或其配伍、朱砂或其配伍；補益類藥人參或其配伍、三七或其配伍；安神類藥龍骨或其配伍、牡蠣或其配伍；平肝熄風類藥天麻或其配伍、川芎或其配伍。
本發明方法所選用的細胞因子有人重組細胞因子內皮素-1(ET-1)、腫瘤壞死因子α、血小板膜糖蛋白IIb-IIIa、血栓素B2、血小板源性生長因子、成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、內皮細胞生長因子、白細胞介素-1、白細胞介素-6、白細胞介素-8、轉化生長因子、血管緊張素II、內皮細胞舒張因子、氧化低密度脂蛋白、或去甲腎上腺素。
本發明方法所選用的細胞因子受體有人重組細胞因子內皮素-1受體(ET-1受體)、腫瘤壞死因子α受體、血小板膜糖蛋白IIb-IIIa受體、血栓素B2受體、血小板源性生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體、胰島素樣生長因子-1受體、內皮細胞生長因子受體、白細胞介素-1受體、白細胞介素-6受體、白細胞介素-8受體、轉化生長因子受體、血管緊張素II受體、內皮細胞舒張因子受體、氧化低密度脂蛋白受體、或去甲腎上腺素受體-α。
本發明的有益效果是應用分子生物學方法可以檢測相關細胞因子表達的變化，但仍不能測定中藥對于細胞因子與受體間相互結合的影響。基于表面等離于體共振現象發展起來的新型生物傳感分析技術，也稱為生物相互作用分析技術，與其他常規技術相比較具有以下優點①實時性，可以對生物大分子相互作用過程中每時每刻的變化進行跟蹤監測分析；②高效性，完成一個基本過程僅需5-15分鐘的時間，在短時間內可以測定大量樣本；③敏感性，可以檢測到10-12mol/L濃度的反應過程；④特異性，樣品中其它非特異性分子對共振角無影響，可以在樣品濃度不高的情況下完成測試；⑤簡易性，對相互作用的大分子無需標記；⑥客觀性，實驗觀測結果均由儀器記錄和分析，避免了主觀因素的影響，并保證有較好的重復性。由于生物傳感分析技術具有常規技術不可替代的優點，目前已廣泛應用于生物分子間的相互作用分析，如蛋白與蛋白、藥物與受體、抗原與抗體、DNA/RNA與結合蛋白、DNA與DNA及細胞與蛋白間的相互作用分析，并將在信號傳導、免疫調節、蛋白工程、抗體定性、核酸研究及藥物的研制和開發方面的研究中發揮重大作用。隨著電子測量技術、生物電子學、免疫學、分子生物學和仿生學的快速發展和相互滲透，特別是新材料科學的迅猛發展，近來又出現了許多新型換能器件的生物傳感器，使生物傳感分析技術的應用范圍和應用水平進一步提高。
Thermo Life Sciences公司的IAsys plus生物傳感器采用波導模式和RM(resonantmirror)技術，并以絕緣體作為傳感基片材料，其能量的損耗較低，敏感度大大提高，更易測量傳感基片表面吸附物質的厚度以及適于長時間的監測分子間的相互作用過程，可進行分子水平上的分子之間相互作用分析，包括定量分析、動力學分析、分子結合位間的拓撲關系分析，因此本發明方法所具有的上述優點更加突出。
從化學分析的角度來看，所有中藥，無論單方或復方，之所以對疾病產生療效，必含有有效的化學成分存在。中藥的有效成分分屬于多種類型的化合物，藥理活性范圍十分廣泛。一方面，即便是一味中藥，也往往含有結構、性質不盡相同的多種成分，加之煎煮過程中相互反應以及與機體相互作用有可能產生的新成分，因此成分很復雜；另一方面，中藥多是通過多個靶點、多個環節、多個層次發揮療效，這給中藥有效成分及其作用機制的測定帶來了很大難度。但是本發明方法首次將生物傳感分析技術應用于中藥作用機理的測定，運用現代醫學理論闡明中藥有效成分在體內的作用靶點和分子機理，終于克服上述諸多難點，在中藥作用機理的測定中取得新的突破。本發明方法中采用親和型特異選擇性生物傳感器IAsys plus來檢測細胞因子與其受體之間的特異性親和作用，進而檢測中藥有效成分對細胞因子和其受體間相互結合的影響情況，對分子間相互作用進行直接、實時、原位監測其動態過程，具有高靈敏度和高穩定性。另外，本發明方法作為一種新的研究思路和手段，可與基因芯片技術在中藥的物質基礎研究上互補。


圖1-1表面已事先包被生物素的親和型生物傳感系統IAsys plus的樣品池的示意圖。
圖1-2在圖1-1所示樣品池中加入親和素后的示意圖。
圖1-3生物素與親和素結合的反應曲線。
圖2-1已接合親和素的樣品池的示意圖，同圖1-2。
圖2-2在圖2-1所示樣品池中加入細胞因子受體后的示意圖。
圖2-3親和素與細胞因子受體結合的反應曲線。
圖3-1已接合親和素的樣品池的示意圖，同圖1-2。
圖3-2在圖2-1所示樣品池中加入生物素衍生化細胞因子后的示意圖。
圖3-3親和素與細胞因子結合的反應曲線。
圖3-4細胞因子與生物素衍生化細胞因子受體結合示意圖。
圖4-1生物素衍生化細胞因子受體包被的樣品池的示意圖，同圖2-2。
圖4-2在圖4-1所示樣品池中加入中藥有效成分的示意圖。
圖4-3中藥有效成分與細胞因子受體結合的反應曲線圖。
圖5-1生物素衍生化細胞因子包被的樣品池的示意圖，同圖3-2。
圖5-2在圖5-1所示樣品池中加入中藥有效成分的示意圖。
圖5-3中藥有效成分與細胞因子結合的反應曲線圖。
圖6-1生物素衍生化細胞因子受體包被的樣品池的示意圖，同圖2-2。
圖6-2在圖6-1所示樣品池中加入細胞因子與中藥有效成分混合液的示意圖。
圖7細胞因子受體與細胞因子的結合曲線圖。
圖8細胞因子受體與中藥有效成分的結合曲線圖。
圖9細胞因子與中藥有效成分結合曲線圖。
圖10中藥有效成分與細胞因子的混合液與細胞因子受體的結合曲線圖。
圖11-1中藥有效成分為川芎嗪、阿魏酸分別和細胞因子ET-1的混合液與細胞因子ET-1受體結合的反應曲線圖。
圖11-2中藥有效成分為赤芍801和細胞因子ET-1的混合液與細胞因子ET-1受體結合的反應曲線圖。
圖中，1.IAsys plus的樣品池、2.事先包被樣品池表面的生物素、3.親和素、4.生物素衍生化細胞因子受體、5.生物素衍生化細胞因子、6.細胞因子、7.中藥有效成分。
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明，但權利要求保護的范圍并不限于此。
具體實施例方式
圖1-1表示親和型生物傳感系統IAsys plus樣品池(1)表面已事先包被生物素(2)；圖1-2、圖2-1和圖3-1均表示在表面已事先包被生物素(2)的IAsys plus樣品池(1)中加入親和素(3)后，親和素(3)與生物素(2)結合；圖1-3表示IAsys plus記錄的結合反應曲線表明生物素與親和素之間具有很高的親和力，加入親和素后，與生物素迅速結合，曲線幾乎在瞬時直線上升；圖2-2、圖4-1和圖6-1表示在圖2-1所示樣品池中加入生物素衍生化細胞因子受體(4)后，生物素衍生化細胞因子受體(4)與親和素(3)緊密結合；圖2-3表示，IAsys plus記錄的親和素與細胞因子受體結合的反應曲線表明，加入生物素衍生化細胞因子受體(4)與結合在樣品池表面的親和素(3)發生結合反應，由此，利用生物素和親和素的特異性相互結合作用將生物素衍生化細胞因子受體固定在IAsys樣品池表面，這里所用的生物素衍生化細胞因子受體是生物素化ET-1受體；圖3-2和圖5-1表示在圖3-1所示樣品池中加入生物素衍生化細胞因子(5)后，生物素衍生化細胞因子(5)與親和素(3)緊密結合；圖3-3表示，IAsys plus記錄的親和素與細胞因子結合的反應曲線表明，加入生物素衍生化細胞因子(5)與結合在樣品池表面的親和素(3)發生結合反應，由此，利用生物素和親和素的特異性相互結合作用將生物素衍生化細胞因子固定在IAsys樣品池表面，這里所用的生物素衍生化細胞因子是生物素化ET-1；圖3-4表示在圖2-2所示樣品池中加入細胞因子(6)后，細胞因子(6)與生物素衍生化細胞因子受體(4)緊密結合；圖4-2表示在圖4-1所示樣品池中加入中藥有效成分(7)，中藥有效成分(7)與生物素衍生化細胞因子受體(4)結合；圖4-3表示，IAsys plus記錄的中藥有效成分與細胞因子受體結合的反應曲線表明，加入中藥有效成分后，這里用的是赤芍801，曲線上升，PBST沖洗后曲線未降至基線水平，說明中藥有效成分與細胞因子之間發生特異性結合反應；圖5-2表示在圖5-1所示樣品池中加入中藥有效成分(7)，中藥有效成分(7)與生物素衍生化細胞因子(5)結合；圖5-3表示，IAsys plus記錄的中藥有效成分與細胞因子結合的反應曲線表明，加入中藥有效成分后，這里用的是赤芍801，曲線上升，PBST沖洗后曲線未降至基線水平，說明中藥有效成分與細胞因子之間發生特異性結合反應；圖6-2表示在圖6-1所示樣品池中加入細胞因子與中藥有效成分混合液；中藥有效成分(7)與細胞因子(6)和生物素衍生化細胞因子受體(4)分別結合，影響細胞因子與受體的結合；圖7細胞因子受體與細胞因子的結合曲線表明，在生物素衍生化表面的樣品池中加入親和素時(7-1)，由于生物素與親和素的特異性相互作用，曲線迅速上升，反應達平衡后，用PBST沖洗，去除非特異性吸附時(7-2)，曲線略下降，向樣品池中加入生物素衍生化的細胞因子受體時(7-3)，利用生物素-親和素體系即可將細胞因子受體接合在樣品池表面，再向樣品池中加入細胞因子時(7-4)，曲線上升，沖洗后有所下降，但仍高于基線，說明在該實驗條件下細胞因子與其受體發生特異性結合；圖8細胞因子受體與中藥有效成分的結合曲線表明，在生物素衍生化表面的樣品池中加入親和素時(8-1)，由于生物素與親和素的特異性相互作用，曲線迅速上升，反應達平衡后，用PBST沖洗，去除非特異性吸附時(8-2)，曲線略下降，向樣品池中加入生物素衍生化的細胞因子受體時(8-3)，親和素具有四個與生物素結合的位點，所以應用生物素-親和素體系即可將細胞因子受體接合在樣品池表面，再向樣品池中加入中藥有效成分時(8-4)，曲線上升，沖洗后有所下降，但仍高于基線，說明中藥有效成分可與細胞因子受體發生特異性結合；圖9細胞因子與中藥有效成分結合曲線表明，在生物素衍生化表面的樣品池中加入親和素時(9-1)，由于生物素與親和素的特異性相互作用，曲線迅速上升，反應達平衡后，用PBST沖洗，去除非特異性吸附時(9-2)，曲線略下降，向樣品池中加入生物素衍生化的細胞因子時(9-3)，親和素具有四個與生物素結合的位點，所以應用生物素-親和素體系即可將細胞因子接合在樣品池表面，再向樣品池中加入中藥有效成分時(9-4)，曲線上升，沖洗后有所下降，但仍高于基線，說明中藥有效成分可與細胞因子發生特異性結合；圖10中藥有效成分與細胞因子的混合液與細胞因子受體的結合曲線表明在生物素表面的樣品池中加入親和素時(10-1)，由于生物素與親和素的特異性相互作用，曲線迅速上升，反應達平衡后，用PBST沖洗，去除非特異性吸附時(10-2)，曲線略下降，向樣品池中加入生物素衍生化的細胞因子受體時(10-3)，利用生物素-親和素體系即可將細胞因子受體接合在樣品池表面，再向樣品池中加入細胞因子與中藥有效成分的混合液時(10-4)，曲線上升，沖洗后下降，由于曲線升高的幅度較小，說明加入的中藥有效成分可抑制該對細胞因子與受體間發生的特異性結合；圖11-1中藥有效成分為川芎嗪、阿魏酸分別和細胞因子ET-1的混合液與細胞因子ET-1受體結合的反應曲線圖和圖11-2中藥有效成分為赤芍801和細胞因子ET-1的混合液與細胞因子ET-1受體結合的反應曲線圖表明，三種不同中藥有效成分抑制該對細胞因子與受體間發生特異性結合的強弱不同。
實施例1所選中藥為活血化瘀類藥赤芍，其有效成分為赤芍801；所選細胞因子及其受體為人重組細胞因子內皮素-1(ET-1)及人重組細胞因子內皮素-1受體(ET-1受體)；所選活化生物素為SULFO-NHS-LC-BIOTIN；所選親和素為Strepavidin；所選親和型生物傳感系統是由Thermo Life Sciences公司提供的IAsys plus，其樣品池表面已事先包被生物素。
A.將4～100μg人重組細胞因子內皮素-1加入濃度為0.01mol/L、pH＝7.4的200～500μL磷酸鹽緩沖液中，又將1～2mg SULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶于120μL去離子水中，取其20～50μL加入上述人重組細胞因子內皮素-1溶液中，混勻，室溫避光反應4小時后，在4℃溫度下，以10000轉/分鐘超濾離心10分鐘，截留物溶解于200μL磷酸鹽緩沖液中，完成人重組細胞因子內皮素-1生物素衍生化；B.將4～100μg人重組細胞因子內皮素-1受體加入濃度為0.01mol/L、pH＝7.4的200～500μL磷酸鹽緩沖液中，又將1～2mg SULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶于120μL去離子水中，取其20～50μL加入上述人重組細胞因子內皮素-1受體溶液中，混勻，室溫避光反應4小時后，在4℃溫度下，以10000轉/分鐘超濾離心10分鐘，截留物溶解于200μL磷酸鹽緩沖液中，完成人重組細胞因子內皮素-1受體生物素衍生化；C.(1)將親和型生物傳感系統IAsys plus開機預熱1小時，參數設置采樣間隔時間1秒，攪拌85轉/分，溫度22℃，親和型生物傳感系統IAsys plus是由ThermoLife Sciences公司提供，其樣品池表面已事先包被生物素；(2)IAsys樣品池用40μL PBST洗3遍，平衡10分鐘，采集基線，加入20μL濃度為2mg/mL的親和素Strepavidin，反應10～20分鐘，用40μL PBST洗3遍，收集數據，結果處理如圖1-3所示，PBST為含0.05％吐溫20(v/v)的磷酸鹽緩沖液；(3)再在樣品池中加入上述B步中制取的20μL生物素衍生化的人重組細胞因子內皮素-1受體，反應3～25分鐘，用40μL PBST洗3遍，采集數據，結果如圖2-3所示；(4)在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中再加入濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL人重組細胞因子內皮素-1，接合反應5～25分鐘，形成結果如圖3-4所示，用50μL PBST洗3遍，由采集數據，結果如圖7所示，表明人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體結合，在人體內，人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合會引起血管收縮，血小板聚集；D.(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)同C步(3)；(4)在經上述步處理的IAsys樣品池中加入20μL濃度為10-5～10-1M的中藥有效成分為赤芍801的溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據，結果如圖4-3和圖8所示，表明人重組細胞因子內皮素-1受體與赤芍801能發生特異性結合；E.(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)再在樣品池中加入上述A步中制取的20μL生物素衍生化的人重組細胞因子內皮素-1，反應3～25分鐘，用40μL PBST洗3遍，采集數據，結果如圖3-3所示；(4)在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入20μL濃度為10-5～10-1M的中藥有效成分為赤芍801的溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據，結果如圖5-3和圖9所示，表明人重組細胞因子內皮素-1與赤芍801能發生特異性結合；
F.(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)同C步(3)；(4)在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL人重組細胞因子內皮素-1與濃度為10-5～10-1M的20μL赤芍801的混合液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據，結果如圖10所示，由于圖10中的(10-4)升高的幅度小于圖7中的(7-4)，說明加入中藥有效成分赤芍801抑制了人重組細胞因子內皮素-1與其受體間發生的特異性結合，起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集；G.結果分析內皮素是迄今發現最強的收縮血管物質之一，也是較強的血小板致聚劑，因此是諸多活血化瘀中藥擴血管、抗血小板聚集的主要作用靶點，本實驗的檢測結果表明赤芍801可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示赤芍801在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即赤芍801通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例2除將所用中藥赤芍801替換為中藥川芎有效成分川芎嗪之外，其余與實施例1相同，本實驗的檢測結果表明川芎嗪可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示川芎嗪在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即川芎嗪通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例3除將所用中藥赤芍801替換為中藥當歸有效成分阿魏酸之外，其余與實施例1相同，本實驗的檢測結果表明阿魏酸可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示阿魏酸在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即阿魏酸通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例4比較實施例1、2和3中三種不同中藥對人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體結合抑制的強弱比較圖11-1和圖11-2中的三條反應曲線可以得出，赤芍801和細胞因子ET-1的混合液使細胞因子ET-1與細胞因子ET受體的結合最小，川芎嗪和和細胞因子ET-1混合液使細胞因子ET-1與細胞因子ET受體的結合次之，阿魏酸和和細胞因子ET-1混合液使細胞因子ET-1與細胞因子ET受體結合的最大。這說明赤芍801抑制細胞因子ET-1及其受體的能力最強、川芎嗪次之、阿魏酸最弱，即在拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集方面，赤芍801藥效最強、川芎嗪次之、阿魏酸最弱。
實施例5除將所用中藥赤芍801替換為赤芍801與川芎嗪之間的配伍之外，其余與實施例1相同，本實驗的檢測結果表明赤芍801與川芎嗪之間的配伍可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示赤芍801與川芎嗪之間的配伍在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即赤芍801與川芎嗪之間的配伍通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例6除將所用中藥赤芍801替換為赤芍801與阿魏酸之間的配伍之外，其余與實施例1相同，本實驗的檢測結果表明赤芍801與阿魏酸之間的配伍可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示赤芍801與阿魏酸之間的配伍在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即赤芍801與阿魏酸之間的配伍通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例7除將所用中藥赤芍801替換為川芎嗪和阿魏酸之間的配伍之外，其余與實施例1相同，本實驗的檢測結果表明川芎嗪和阿魏酸之間的配伍可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示川芎嗪和阿魏酸之間的配伍在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即川芎嗪和阿魏酸之間的配伍通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例8除將所用中藥赤芍801替換為赤芍801、川芎嗪和阿魏酸它們之間的配伍之外，其余與實施例1相同，本實驗的檢測結果表明赤芍801、川芎嗪和阿魏酸它們之間的配伍可與人重組細胞因子內皮素-1及其受體發生特異性結合，提示赤芍801、川芎嗪和阿魏酸它們之間的配伍在體內的作用靶點除已有報道的血栓素A2外，還有人重組細胞因子內皮素-1及其受體途徑，即赤芍801、川芎嗪和阿魏酸它們之間的配伍通過與人重組細胞因子內皮素-1及其受體的結合，抑制人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體的結合，從而起到拮抗內皮素的作用、擴張血管和抑制血小板聚集。
實施例9將所用中藥赤芍801替換為川芎嗪，細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明川芎嗪可以促進腫瘤壞死因子TNF-α與其受可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α的生物學活性。腫瘤壞死因子TNF-α是一種重要的調節機體免疫功能和代謝過程的多功能細胞因子，具有抗腫瘤的有益的生物學作用，但當TNF-α產生過量時，則會對機體造成嚴重損害。因此可溶性受體sTNFR-1可與原細胞膜上的受體競爭，先與TNF-α結合，減少直接發揮有害人體作用的TNF-α數量，對某些疾病，如膿毒性休克、自身免疫性疾病和移植排斥反應起到治療作用。
實施例10將所用中藥赤芍801替換為阿魏酸，細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明阿魏酸可以促進腫瘤壞死因子TNF-a與其受可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α的生物學活性。
實施例11仍然用中藥赤芍801，將細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明赤芍801也可以促進腫瘤壞死因子TNF-α與其可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α生物學活性。
實施例12將所用中藥赤芍801替換為川芎嗪和阿魏酸之間的配伍，細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明川芎嗪和阿魏酸之間的配伍可以促進腫瘤壞死因子TNF-α與其可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α生物學活性。
實施例13將所用中藥赤芍801替換為川芎嗪和赤芍801之間的配伍，細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明川芎嗪和赤芍801之間的配伍可以促進腫瘤壞死因子TNF-α與其可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α生物學活性。
實施例14將所用中藥赤芍801替換為阿魏酸和赤芍801之間的配伍，細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明阿魏酸和赤芍801之間的配伍可以促進腫瘤壞死因子TNF-α與其可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α生物學活性。
實施例15將所用中藥赤芍801替換為川芎嗪、阿魏酸和赤芍801它們之間的配伍，細胞因子及其受體由人重組細胞因子內皮素-1與人重組細胞因子內皮素-1受體替換為腫瘤壞死因子TNF-α及其可溶性受體sTNFR-1，操作步驟與實施例1相同，實驗的檢測結果表明川芎嗪、阿魏酸和赤芍801它們之間的配伍可以促進腫瘤壞死因子TNF-α與其可溶性受體sTNFR-1結合，從而抑制TNF-α生物學活性。
由于中藥的種類繁多，與人體健康相關的細胞因子及其受體也不勝枚舉，本發明方法中不可能將其全部列出，但是采用本發明的應用生物傳感分析技術來測定中藥作用機理的方法，均可以實現弄清其作用機理和篩選藥物的目的。
權利要求
1.測定中藥作用機理的方法，應用親和型特異選擇性生物傳感器IAsys plus來檢測中藥有效成分與細胞因子的相互作用、與細胞因子受體的相互作用、以及對細胞因子與其受體間相互結合的影響情況，分析中藥有效成分的作用靶點和作用機理，具體的操作步驟是A.細胞因子生物素衍生化將4～100μg細胞因子加入200～500μL濃度為0.01mol/L pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中；將1～2mg SULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶解于120μL去離子水中，取其20～50μL加入上述細胞因子溶液中，混勻，室溫下避光反應4小時后，在4℃溫度下，以10000轉/分鐘超濾離心10分鐘，截留物溶解于200μL磷酸鹽緩沖液中，完成細胞因子生物素衍生化；B.細胞因子受體生物素衍生化將4～100μg細胞因子受體加入200～500μL0.01mol/L pH＝7.4磷酸鹽緩沖液中；1～2mg SULFO-NHS-LC-BIOTIN活化生物素溶解于120μL去離子水中，取其20～50μL加入上述細胞因子受體溶液中，混勻，室溫避光反應4小時后，在4℃溫度下，以10000轉/分鐘超濾離心10分鐘，截留物溶解于200μL磷酸鹽緩沖液中，完成細胞因子受體生物素衍生化；C.將生物素衍生化的細胞因子受體接合在樣品池表面，觀察細胞因子與其受體相互作用(1)將親和型生物傳感系統IAsys plus開機預熱1小時，參數設置采樣間隔時間1秒，攪拌85轉/分，溫度22℃，親和型生物傳感系統IAsys plus是由Thermo LifeSciences公司提供，其樣品池表面已事先包被生物素；(2)將親和素Strepavidin接合至樣品池表面IAsys樣品池用40μL PBST洗3遍，平衡10分鐘，采集基線，加入20μL 2mg/mL親和素Strepavidin，反應10～20分鐘，用40μL PBST洗3遍，收集數據，PBST為含0.05％吐溫20(v/v)的磷酸鹽緩沖液；(3)生物素衍生化細胞因子受體包被樣品池在樣品池表面接合親和素Strepavidin的IAsys樣品池中加入上述B步中制取的20μL生物素衍生化的細胞因子受體，反應3～25分鐘，用40μL PBST洗3遍，采集數據；(4)細胞因子與其受體結合反應在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL細胞因子溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；D.將生物素衍生化的細胞因子受體接合在樣品池表面，觀察細胞因子受體與至少一種中藥有效成分的相互作用(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)同C步(3)；(4)細胞因子受體與中藥有效成分結合反應在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為10-5～10-1M的20μL至少含一種中藥有效成分的溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；E.將生物素衍生化的細胞因子接合在樣品池表面，觀察細胞因子與至少一種中藥有效成分的相互作用(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)生物素衍生化細胞因子包被樣品池在經過上述(2)處理的IAsys樣品池中加入上述A步中制取的調節濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL生物素衍生化的細胞因子，反應3～25分鐘，用40μL PBST洗3遍，采集數據；(4)細胞因子與中藥有效成分結合反應在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為10-5～10-1M的20μL至少含一種中藥有效成分的溶液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；F.將生物素衍生化的細胞因子受體接合在樣品池表面，觀察中藥有效成分對細胞因子與其受體結合的影響(1)同C步(1)；(2)同C步(2)；(3)同C步(3)；(4)中藥有效成分對細胞因子與其受體結合的影響在經上述(3)步處理的IAsys樣品池中加入濃度為0.05～0.5mg/mL的20μL細胞因子與濃度為10-5～10-1M的20μL至少一種中藥有效成分的混合液，接合反應5～25分鐘，用50μL PBST洗3遍，采集數據；G.實驗結果對實驗采集數據所形成的反應曲線和結合曲線進行分析，可以確定中藥有效成分對細胞因子與其受體相互結合的影響，從而看出有些中藥有效成分可增強某些細胞因子與其受體的結合，有些中藥有效成分可抑制某些細胞因子與其受體的結合，有些中藥有效成分則不影響某些細胞因子與其受體的結合，由此，可進一步推論和證實中藥的作用機理影響細胞因子-受體體系的相互結合也是中藥有效成分在體內的作用位點之一，中藥有效成分通過調節某些細胞因子與其受體的相互結合，從而影響或改變細胞因子的功能與生理、病理作用，進而發揮對疾病的療效；進而根據不同中藥有效成分以及它們的不同配伍所進行的對比實驗，得出不同中藥有效成分及其不同的配伍對細胞因子與其受體結合影響的強弱程度，可進一步研究中藥配伍機理及藥物篩選和新藥開發。
全文摘要
本發明的技術方案涉及應用生物傳感分析技術來測定中藥作用機理的方法，應用親和型特異選擇性生物傳感器IAsys plus來檢測中藥有效成分與細胞因子的相互作用、細胞因子受體的相互作用、以及對細胞因子與其受體間相互結合的影響情況，分析中藥有效成分的作用靶點和作用機理，弄清中藥的作用機理，并且可以由此進行中藥的篩選及其配伍，本發明方法具有實時性、高效性、敏感性、特異性、簡易性、客觀性的優點。
文檔編號C12Q1/00GK1598576SQ20041002017
公開日2005年3月23日 申請日期2004年7月28日 優先權日2004年7月28日
發明者陳強, 陳可冀, 李靜, 殷惠軍, 吳寶艷, 黃加棟, 韓松巖, 史海濱 申請人:南開大學