過氧化氫酶基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法

專利名稱：過氧化氫酶基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及過氧化氫酶基因(catalase，CAT)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
高血壓是指收縮壓或舒張壓升高的一組臨床癥侯群。血壓的升高與冠心病、腎功能障礙、高血壓心臟病及高血壓并發(fā)腦卒中的發(fā)生存在明顯的因果關(guān)系。高血壓最新的診斷標準是收縮壓≥19kpa(140mmHg)或舒張壓≥12kpa(90mmHg)，符合其中一項者可確診為高血壓。
大多數(shù)的高血壓患者在血壓升高早期僅有輕微的自覺癥狀，如頭痛、頭暈、失眠、耳鳴、煩燥、工作和學(xué)習(xí)精力不易集中并容易出現(xiàn)疲勞等。隨著病情的發(fā)展，特別是出現(xiàn)并發(fā)癥時，癥狀逐漸增多并明顯，如手指麻木和僵硬、多走路時出現(xiàn)下肢疼痛，或出現(xiàn)頸背部肌肉酸痛緊張感。當(dāng)出現(xiàn)心慌、氣促、胸悶、心前區(qū)疼痛時表明心臟已受累，出現(xiàn)夜間尿頻、多尿、尿液清淡時表明腎臟受累、腎小動脈發(fā)生硬化。如果高血壓患者突然出現(xiàn)神志不清、呼吸深沉不規(guī)則、大小便失禁等提示可能發(fā)生腦出血，如果是逐漸出現(xiàn)一側(cè)肢體活動不便、麻木甚至麻痹，應(yīng)當(dāng)懷疑是否有腦血栓的形成。
高血壓早期無明顯異常體征出現(xiàn)。當(dāng)腦、心、腎等重要器官出現(xiàn)輕度損害時可有異常的體征出現(xiàn)。常見的心臟異常表現(xiàn)有心尖搏動左移、心前區(qū)有抬舉樣搏動感，聽診心尖區(qū)第一心音增強、主動脈瓣區(qū)第二心音增強且有收縮期雜音和舒張期雜音，表明已發(fā)生動脈硬化和左心室肥厚，如果在心尖區(qū)聽及奔馬樣心律可能表明有心力衰竭的出現(xiàn)。另外還常見耳垂出現(xiàn)折痕、毛細血管搏動、橈動脈出現(xiàn)硬脈或無脈及下肢間歇性跛行等。
此外，由于某些誘發(fā)因素或高血壓本身的發(fā)展，可導(dǎo)致一些高血壓患者血壓顯著或急驟升高，同時伴有腦、心、腎、視網(wǎng)膜等重要器官功能損害，嚴重危及生命，出現(xiàn)一系列臨床特殊征象，稱為高血壓急癥。高血壓急癥的發(fā)病率占高血壓人群的5％，常見有高血壓腦病、腦出血、急性左心衰竭、可樂寧急性停藥綜合征、急性心肌梗塞、急進型惡性高血壓等。
高血壓患者中約5％左右無自覺癥狀，也不知道血壓何時升高，更不知道什么時候已產(chǎn)生了血管和器官損害的并發(fā)癥，有些患者甚至在發(fā)生了心血管意外之后才知道自己患有高血壓。所以，找出高血壓發(fā)病的遺傳原因，及早的進行預(yù)防以及檢測，可以有效控制高血壓的發(fā)病，將疾病對人體的傷害減到最小。
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)也叫高血壓病，是一種獨立的疾病，有著自己的病因、發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸的規(guī)律和臨床表現(xiàn)。臨床上主要表現(xiàn)為動脈血壓的升高。占人群高血壓患者的90％以上，目前發(fā)病機理尚未完全明了，主要依據(jù)排除了其他疾病導(dǎo)致的高血壓后才能診斷為原發(fā)性高血壓(高血壓病)。動脈血壓的升高主要是因外周小動脈阻力增高所致，同時有不同程度的血容量和心輸出量的增加。晚期常導(dǎo)致心、腦、腎等臟器受累發(fā)生高血壓心臟病、心力衰竭、腎功能障礙、腦出血等嚴重并發(fā)癥。原發(fā)性高血壓的治療主要是降低血壓同時防止并發(fā)癥的發(fā)生。原發(fā)性高血壓患者致死原因為腦血管意外、心血管意外和腎功能不全，我國以腦血管意外為多見，心力衰竭和尿毒癥次之，而歐美國家以心力衰竭多見，腦血管意外和尿毒癥次之。
原發(fā)性高血壓作為最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機制已經(jīng)成為目前研究的熱點。
雖然已有許多關(guān)于各種基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的研究，但沒有證實CAT基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報道，更沒有證實CAT基因的SNP與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報道。
綜上所述，為了最終實現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋找原發(fā)性高血壓易感基因，并開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種診斷(尤其是早期診斷)高血壓的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療高血壓的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測的是CAT的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常CAT核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性3369位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在過氧化氫酶基因CAT的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用CAT基因特異性引物擴增樣品的CAT基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性3369位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，且含有SEQ IDNO1中第3369位。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測高血壓的試劑盒，它包括特異性擴增CAT基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第3369位的擴增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第3369位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第3369位的突變限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性3369位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的CAT蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了CAT基因的部分SNP與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能CAT的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在CAT第3369位的SNP(3369位T→C)在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)，因此可作為檢測高血壓的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
CAT基因過氧化氫酶基因(catalase，CAT)的詳細序列可參見登錄號為AL035079的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO1所示。
過氧化氫酶(CAT)基因?qū)儆谝粋€結(jié)構(gòu)和功能上已經(jīng)比較清楚的過氧化物酶。1986年Quan等人分離人的這一基因并闡述了此基因的特征(Quan et al.NucleicAcids Res.145321-5335，1986.)?；蛉L34Kb，由13個外顯子組成?；虍a(chǎn)物是由60Kd的四亞基組成，每個亞基包含一個高鐵血紅素基團，分子量為240Kd。過氧化氫酶能把有毒的H2O2分解成H2O和O2使細胞免受氧化壓力的毒害。這種蛋白最早從老鼠的紅細胞中被分離得到，隨后在人體內(nèi)的紅細胞也分離得到了該蛋白。過氧化氫酶和SOD以及谷胱甘肽還原酶組成了細胞內(nèi)的主要抗氧化體系。
過氧化氫酶是存在目前已知的生物體內(nèi)的廣泛存在的蛋白酶，并在肝臟，腎細胞以及紅細胞中表達豐度較高。過氧化氫酶蛋白和SOD以及谷胱甘肽還原酶共同組成了細胞內(nèi)的抗氧化體系，在紅細胞內(nèi)過氧化氫酶發(fā)揮了主要的抗氧化作用。有研究表明，日本人的過氧化氫酶缺乏癥與紅細胞中的過氧化氫酶濃度過低有關(guān)，這種疾病紅細胞中過氧化氫酶的濃度只有正常人的0.2-4％(Ogata，M.Aatalasemia.Hum.Genet.86331-340；1991)，并且是由于剪接突變造成的(第四個內(nèi)含子的第五個堿基G→A)。匈牙利人中發(fā)現(xiàn)在上游調(diào)控區(qū)域有多態(tài)存在(-21，A→T，翻譯起始位點為1；(Goth.L et al.Electrophoresis.1997jun18(7)1105-8)。截止到目前為止關(guān)于過氧化氫酶基因還很少有大家所認可的共同多態(tài)，大部分發(fā)現(xiàn)的是具有民族特征的多態(tài)。
多年的研究表明氧化壓力失衡會導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生如動脈粥樣硬化等以及一些老化病等(Jose M et al.，Biochemistry，32(8)，595-603，1999)。作為紅細胞內(nèi)主要的抗氧化酶，過氧化氫酶在抗氧化作用發(fā)揮了很大的作用(Gaetani GF，et al.，Blood 871595，1996)。
2000年Goth L和Eaton JW發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶缺陷會導(dǎo)致較高的糖尿病的發(fā)生(Goth et al，Lancet 2000 25；356(9244)1820-1)。
由于過氧化氫酶能夠降解有毒的H2O2避免對細胞造成氧化壓力的危害，因此作為高血壓病的候選基因在中國的隔離群體進行篩查。
本發(fā)明人對CAT基因中的幾乎整個區(qū)域進行了測序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與高血壓易感性并不相關(guān)，然而關(guān)聯(lián)研究表明3369位T→C卻是與高血壓易感性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。該SNP位于CAT的3’末端區(qū)，提示對CAT的轉(zhuǎn)錄水平有一定影響，進而導(dǎo)致影響過氧化氫酶的表達，并最終導(dǎo)致攜帶者的高血壓易感性明顯高于正常人群。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，CAT蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療CAT蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進CAT蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人CAT蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能刺激人CAT蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人CAT DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CAT基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CAT基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CAT蛋白的分子，也包括那些并不影響人CAT蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人CAT基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人CAT蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CAT蛋白功能的抗體以及不影響人CAT蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CAT基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CAT基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人CAT蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標本中的人CAT蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗CAT抗體是不識別正常CAT但識別突變CAT的抗體，或者識別正常CAT但不識別突變CAT的抗體。利用這些抗體，可以方便地進行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測。
利用本發(fā)明CAT蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CAT蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明CAT蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的CAT多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明CAT蛋白時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明CAT蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的CAT蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人CAT蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CAT蛋白的無表達或異常/無活性的CAT蛋白的表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶CAT基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人CAT基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細胞中，再將細胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人CAT蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。
一種檢測檢測樣品中是否存在CAT蛋白的方法是利用CAT蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與CAT蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CAT蛋白。
CAT蛋白的多聚核苷酸可用于CAT蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，CAT蛋白的多聚核苷酸可用于檢測CAT蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下CAT蛋白的異常表達。如CAT DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷CAT蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CAT蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測CAT蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測CAT基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。CAT蛋白突變的形式包括與正常野生型CAT DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用CAT基因特異性引物擴增樣品的CAT基因，得到擴增產(chǎn)物；然后檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性3369位T→C，其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了CAT基因的SNP與高血壓的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在3369位T→C。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對具有SEQ ID NO2和3的序列。
雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQ ID NO1中第3369位。
由于本發(fā)明的SNP與高血壓具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期較準確地診斷原發(fā)性高血壓，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施(如在飲食上采取相應(yīng)控制)，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價值和社會效益。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例11.1研究對象由于血壓是多基因參與的受多種環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀，必然在分析相關(guān)基因時要考慮遺傳異質(zhì)性的問題。選擇遺傳背景相對比較單一的隔離人群作為研究多基因疾病的材料將有助于降低遺傳異質(zhì)性的影響，同時由于這些群體具有比較固定的生活環(huán)境和較為一致的生活習(xí)慣使得環(huán)境因素的影響大大降低。選擇這樣的群體，不論是用于連鎖不平衡分析，還是從中選取家系進行家系分析，都有助于提高高血壓易感基因位點的檢測靈敏度。因此在本實施例中選定隔離群體作為研究對象(隔離群體具有遺傳背景的相對一致性，奠基者數(shù)目比較少的優(yōu)點)。
在知情同意的基礎(chǔ)上隨機收集了324個年齡在50歲以上的漢族個體，均來自于安徽省岳西縣大別山響腸鎮(zhèn)。80％的個體只有6個姓，奠基者數(shù)目應(yīng)該比較少，并且同一性別的個體來自于同一個奠基者。選用的高血壓樣本要求收縮壓不低于140mmHg，舒張壓不低于90mmHg，測量血壓兩次取平均值。
挑選其中的11％位于血壓分布的最頂端(37例個體；SBP＞178mmHg)和有7％位于血壓分布的最底端的(22個個體；SBP＜104mmHg)共59個個體，通過直接測序的方法進行SNP的檢測。
1.2實驗方法和結(jié)果1.2.1 DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴增。
1.2.2 PCR及測序引物的設(shè)計根據(jù)GenBank中CAT的基因組序列，設(shè)計和合成以下引物。具體引物如下表1所示。
表1 引物序列表

1.2.3 CAT基因的PCR擴增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。
結(jié)果，獲得367bp的擴增產(chǎn)物。
1.2.4 SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進行熒光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP3369位T→C。
1.2.5 SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測序法進行SNP基因分型。即在高血壓病人和正常血壓對照組中進行分型和關(guān)聯(lián)分析。
等位基因的頻率統(tǒng)計出來以后進行卡方檢驗，通過對血壓最高的11％和最低的7％個體數(shù)據(jù)進行比較，初步確定是否等位基因的頻率和血壓水平連鎖。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1中3369位的C型SNP在高血壓個體中的頻率為36％，而在低血壓人群中的頻率為20％。兩者之間的頻率差為16％，證實了SEQ ID NO1中3369位的T/C型SNP與高血壓的發(fā)生存在著相關(guān)性。
實施例2原發(fā)性高血壓易感性檢測試劑盒如實施例1所述，SEQ ID NO1中3369位T→C的突變與高血壓疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個突變設(shè)計CAT基因特異性引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測。
制備一試劑盒(100人次)，它含有

抽取待檢測男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1ìmol/ìl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進行熒光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。
或者，將擴增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，也可檢測出3369位T→C。
檢測結(jié)果，含3369位T→C的檢測對象的高血壓易感性高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)上海人類基因組研究中心<120>過氧化氫酶基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>040162<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38100<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gatctcccct cctcagcctc ccaaagtgct gggcttacag gcatgaacca ccgtgcctgg 60ccgaattaat gtgtttttaa accaaaatcc tgacatttat ttgaaacaaa ctaggcaatc120cttcacagtg cttctaaaag cccagaccaa gccctccttt tagaagagca agtctcatga180gcagcgtgag gtcagagatg atcaggtcca tgcacatttg tgtctttcca caatgtctga240ctttcttgaa gtaatctcaa tcacaaaagc cacgagctgc acggagttcc taaggaggca300gtttgcctca gtgcttccca tttgctcgat agtcagagct gcagtcacac aggctcaagc360cactccacaa gtcagtcaat gtggcagatc atacataata gtatacttaa aatataaatg420ttatagatta aacatgccac aacaaagtaa tattgaacat caaaagaaga aggataggaa 480gaaagggtta atgaatcaat tcagggagag cgactaaggc aaaaagaatc tcctggtctg540cgccaggcag tccgagagcc ttcagtggca gatgccaggt gattatcatg attaacagca600agatggtgta gttaagacgg ccatttcaag ctgcgcaagt cctgttcttt ttatagccac660agtcctctag tgaggactga gagtggaaaa gtgtgcttgt tgatgtcctc atctggttgg720atgcagtctt tatttattaa gcaaacatct tgtccctgtt cgcaaagtgc cctatgaaat780ataagatgga gtctctaaga tggagttact tatgtcaagg ggcttgacac agcaaaagaa840cagattttta tatattaaga gtctaatatt tacattttta gatagtggtg tggcagagtg900taggtgaaaa acaccttttt ttttttttga gacggagtct cgctctgtca cccaggctgg960agtgcagtgg cgcaatcggc tcactgcaac ctccgcctcc caggttcaag caattttcct 1020gcctcagcct cctgactggc tgggattact ggcgcctgcc accacgccca gctaattttt 1080ttttgtattt ttattagaga tggggtttca ccatagtggc caggctgctc ttgaactctt 1140gacctcgtga tccgcccgcc tcagccttcc aaagtgctgg cattacaggt ggcagccacc 1200gcacccagcc agaaaaacac cttttaagat gagaatgcaa gaaatgaaaa tgttatgtcc 1260acacaaaaat atgtacagaa atgttcatac cagcactatt cataatagcc aaaaagtaga 1320aacaatccaa atgtccatca aatgataaac ggataaataa aacatagtaa atccataaaa 1380tggaatatta tttggcaatt aaaaaaatga agcactcata gatgctacaa tatgtaagaa 1440tcttgaaaat attatgctaa gtgaaagaag ccagtcacaa aagaccacat actatattat 1500tccatttaaa tgaaacatgc agagtaggca aatcttagat tcatgatggc ctagggctgg 1560ggactaggtt aagaaagaaa tggagagtgg ctgctgatag gtacaggttt ccctttgggg 1620tgatgaaaat gctccaaaat tgattgtggt gatggttgcg caattctgtg aatatacaaa 1680aaaaatttac tcgtacactt taaatgggtg gtttttacgg tatgtgaatt atatctcaat 1740aaagctctta ttttaaaaaa gagagagaag aaaaaaggaa gaaggaagaa aaaaaaagga 1800
ggaggatgag ggcaaggaca agaagaagag agaggaggag gaggaagaaa aatgaggagg 1860aggagaaagg gacgaggagg aaagctgggc atggtgatgt gtgcctgtag tcccagttac 1920tcaggaggca gaggccaccc tgggcaacat aatgatatgc cgtctctaaa ataaataaac 1980aatgaagaag gcagtgtgaa cgaccaactg tgtcaaacac cgctgagagg tcatgtaaga 2040caaggactaa gaatggacca ttggattttt ttgtggggta aaatatacac aaaacttacc 2100atttagccat ttttaggtgt acagttcagt agcattaaat acattcacac tgttgtgcaa 2160ccatcaccac caaccatctc cagaagttct cacctttccc aataaaaagt gcagtggcgc 2220aatcttggct cactgcaacc tccacctcct gggttcaagc gattctccca cctcagcctc 2280acgagtagct gggattacac gcacatgcca ccacacccag ctaatttttg tatttttagt 2340agaaatgggg tttcaccacg ttggccaggc tgatctcaaa ctcctgacct caggtgttcc 2400acccgccttg gcctcccaaa gtgctgggtt tacaggcgtg agccactgca cccagcccga 2460tatatctatt ttctatgtct acaaatataa cagtctcaaa gcatactcaa atacgggggg 2520aattaggcag gagggtttga cagaggagta aagaaatttg agctaaaaga ccaagaatga 2580gtttgtatct gtctgctagt ggtctgtttc ctgaagcccg taactcagga actcctgaaa 2640gtataaactg gtttggtttt ttgtttttag ttgttattgt tgttgttttc agacaaggtc 2700tcactctgtt gcccagactg gagtgcagtg gtgcaatcac gactcactgc agcctcaacc 2760tcctgggctc aagagatcct cccgcctcag cctccctagt aactgggact acaggcatgc 2820gttaccatac tcggctaatt tttgtatttt ttgtacagac agggcttcgc catgttgccc 2880cggctggtct caaactcctg agttcaagtg atcctcctgc cttggcttcc caaagtgctg 2940ggtttacagg catatgagcc accacacccg gcacaaactg gttttgaata tgaacggaat 3000aaagattttc aaggaaaaca aattttcatt tagtattcag aactcatctt taaagtcttc 3060catgtgattt tcaaccatga taggcaaata tgggctttaa aaagaaggaa gaggaaagtg 3120accagtggtt ctgagccctt gttttaaaaa gtcaatcaca ggtaagtgag caaatggaca 3180agagatttaa gtaattttca aagttggggc atttgctatt ttatcagtgt ctcagaaggc 3240tgtccaaagg ctatagattt aaacaaataa catggagtcc tcgagatact ggcatttcca 3300tttttaaggg taaacatctg aaaatgatga tgttcaaatt aagagtctgg tagcagttta 3360cagttacata tggagtcgaa agaaagaaaa taccatctct gttcttacgt acagattatt 3420tattgtaaaa atgtaagcaa ttacaaattg atctgttgtg aaatcagtgc tgaattaaca 3480ttaatgtaac tccagtgaaa aaaatgaatt tgatcaatta ttatcaggaa taaacattaa 3540gccatgacgg tgctcaagtt atcttctgat gacactgctg tattaaatgt acttttccta 3600tgagaacctt agaaaaataa aaatttctga gtagatcatc tttatctttt ctttttatat 3660atttatagcc atattttaat ataataggcc atgaggtgat atgtaaacat acataatttc 3720aacaaatttt gtcaaataaa atcatatttc tagctagaaa cttgccttct aatcatttta 3780aatgaataat ccaatcatcc gtcaaaacaa attttttttt taaatgactg ttaaatccta 3840accttcattt tcccctgggg aaatagcatt aaaattgtta cacaatctgc tatagaaagt 3900gggattctct attttgaagc cactagcttg catttgcaca tctagcacag gagaatcttc 3960atccagtgat gagcgggtta cacggatgaa cgctaagctt cgctgcacag gtgcagggcc 4020ccggcctcac agatttgcct tctcccttgc cgccaagtga gatccggact gcacaaaggt 4080gtgaatcgca ttctgtttta aaagaacaag atgagcaggt taatcacctc atgggcagca 4140acgtgatatt tactcagttt taatatgtat gcaaatgaaa ataataattc agaattcatt 4200cactttaact gtcttaaatt gcccagcgct aaaatgaaga gtatgtgttt tgccagtgaa 4260ttctttatct ctcaaatgaa tttctgcaca gctgcctaag aaatctaaca gtggcaggta 4320atggcccctg cagactgtaa tgctaagtgg taactaagtc atgcctactc caacccagca 4380cacacagcct ctgcatggcc aggctgctcc cagcttacct taggcttctc agcattgtac 4440ttgtccagaa gagcctggat gtggctcccg tagtcagggt ggacctcagt gaagttcttg 4500acctaaggcc aaaggaaaat aaatgcaagc attactctaa ctccctacta tatcactccc 4560cagggactgt ggtttcccag tgtttattcc ataggggagg aaagacgttt cagcaggagg 4620cagtactaca ggtgtttaac aatgccagcc tcagagttaa gatgcaggtc cagtgaacac 4680tctgacatat actggctgag caacctcgga taggtcactt aacttactga gcttatgtcc 4740
ctctgccgaa atgcgcaaga aaatgacacc taatcagtat aattttaaaa atactatttg 4800gtctttgtcc cccattcctg acacagatct aaaacccttc gaatgtactg tcttttatat 4860actactaaga tgattcatgg gggcctacat agattcctga tggaggctca caccaggaag 4920aacaagcacg cgatcagaag gttagaactt ctagccccac ccccaaacct ccagggatgg 4980gagaggggct ggagattgta ttcaatcacc catagccaat aatttcatca atcatgccta 5040tgtcataaaa cctccagaaa aacccacaac tggcaaggtc agggagtgtc tggattagtg 5100cacacatcca ggagctagaa gggtggtcca ctcagggagg cacagaagct ccgaggcctt 5160cccccatgcc cctcttccat ttgtctattc ctgagttgta ttctttataa taaattggta 5220atcataagta aatcattttc ctgagttcta tgagtctttc cagcaaatta tcaaacctga 5280ggaaagggtt tgatttgcag tcagaatctg cagaagtgtg catagccagg gtacctcatt 5340tgttatctaa agtgggaaat gacccctaaa tctttgggtt ctgactctag ctccaggagc 5400tactgttaga attgaattga gttataggac acacagttac tgtcaaagaa ttacagaatt 5460gcttattgtc ggggaaaaaa acccatacaa cctaggccag gcgcagtggc tcacgcccga 5520aatcccagca ctttgggagg ccaagatggg tggatcacct gaggtcagta gttcaagacc 5580agcctggtta acatggcaaa accccatctc tactaaaaac acaaaaatta gtcgggcatg 5640gtggggcatg cctgtagtcc aagctactgg ggaggctgag gcaggaaaat ctcttgaacc 5700caggaggcag aggttgcagt gagccgagat catgccactg cagtccagcc tgggtgacag 5760aacaagactc catcttaaaa aaaaaaaacc cacacaacct acctcacagg atgctgtgag 5820aaaaatgctg agaagtgagg tgcatttact gcatgaaaag agctgacctc agagtaagcg 5880cttaacaaat tacagtgatt tacattgaga aacgggccca gacacagcct aaagttaatg 5940tgaaggatac aagaacactg gtacatgcag cacaactcca cacacttcag gcaggaattc 6000cccagtggac agcaagagga ggcagggcat tgggaaccca taaaagcctt acagtttcag 6060catatgtgaa aggagaatgc caagggttcc agcccagttc tgctatttac aagctgtcgt 6120atccattctc tccagtaaaa ggagataaat cctgccctgc ctaccacaca gagcgcctgt 6180caagctctct gctgatactg gaacccaggc tctgggacac agcccagaca gctgctagcc 6240cagctgcccc taggaactga gaagcagcaa ctaggggcca aggaaaaagg gggatttcta 6300gatttgcaaa aagcttagct ctgggacagg ccaggaaacc agaagtgaga gggcttcact 6360cagctcgatg agcggccatc agaaataccc cagcacctta gcatgaaagt ctagcctgcc 6420ttttggaagc attgcagttc ttattccaga aatcatgcaa atttctagtc tgcatctgaa 6480ggaggatcga ggtattatga cattaagcct ttaggcaggt tttaaaccat aaaaatgcaa 6540aaaagaaaga cagactgatt gactgattga ctgattttag agacagggtc tccctatgtt 6600gtccaggctg gccctgtatt cctgggctca agcgatcctc ccatctcaac ctcctaagta 6660gctaggacta caggtgcatg ccatcacacc ggctgatata tttattatca tccaaagttt 6720aagtagaatt gcagcaggac tcacattttg atattgcaca tttactatct tgcacagaac 6780ttggctgcag ctgaattaaa cagaatagga caaaattcag tctgaacaca actaaattag 6840tacacactgg acaaacagct aaggacgatg gatatgccag accagataaa acatggaaag 6900aaaataatca gaagttggtt ggggattact agtttatttt ttttttttta agttctctta 6960agtcaagtaa aacagaaatg gcactttctt tttagggttc tcccacacag ctgcactgtc 7020ttccttagcc agcagaggac acccttcagc ttacaaagac tcaccgcttt cttctggatg 7080aaaatttgtg catccttcag gtggccggca atgttctcac acagacgttt cctctgttcc 7140tcattcagca cgttcacata gaatgcccgc acctgctcag agaaaagagc aagtgcagag 7200aattgaatca ccagtttatc accaacaaaa ttcacctact acaacactta ggaaatcaat 7260gataaaaaaa actttagaag ttaagaataa ttttaaattt taaatttggg ttgtgtcctt 7320cactttttgt tttaagcaaa ataagtaaaa ttcatttgtt aatagctcat acctgctttc 7380taataatatc ctttatagta actgctataa atctcttata aatagatcta caatttaaaa 7440cctcaccaca ttcttaatac tgacaagtct aaaatgtgca agctgccttt gaatgtaaac 7500ttagcacaat acctttgttc aattctccca gaaccatgga ggaaaattaa ctaatttagc 7560tagagatata atttgatata tagataatta tatctatata tagacatcta aaaaactacc 7620tcatttatac atgtgtatct gtagttattc agaagccaat atttcttaag caagacatat 7680
taatagtgat attttgctag attattgggt tgacctctaa aataaatatc cataaattaa 7740aatgaaaaat aggagcttag tatcagatat gtgaatccga gcagcctctg ccccattctg 7800aaatcaaaag gttgtagcta tgattttatt cttacatttc attcattcat tccactcatt 7860caacaaatat tgagtatcta taatgtgcga gactctgttc tacgtgctgt tctattaatg 7920tttatgaagt ccaataatat ccaattatcc aaagtatcaa cttcataaaa tattaagaga 7980tgcatcattt ccataagtca tcaaatatca ggctataatt atgtttttaa atttttgagt 8040aaagtttaaa cctgatacca aagttaatca gacattttcg attaacacaa tctaatcaaa 8100gtactatatc ctggggattt cctcagacct atctccaatt cactaattct ctcttcagct 8160gtatttgaca tattgcgtga aaacatcgac tgggtcacta tatctgttga ctttttattt 8220cacagattgt aatttttgtt tctagaaaat attatttggt tatttttcaa atctacctgt 8280ttttctcctc atatcctatt gtcttaataa tattcctttt ttgcatctct ttaaatatgt 8340atgtttattt taaagcctct ttccaattat catgtctatg attcttccat ctattattgc 8400atgtgtaatt tctcattgga tttccttgta tgtattctaa tttttcacta tgactcatca 8460gatgaagtag tcttgataac atctattgtt ctatcttcca attcactaat cttctcttca 8520gccatgttaa cctcctttaa aagccatcta ttaaattcta atttcagttg ttacattttc 8580tagttatgtc cattcaactc tttttctata gcttaaagtt ctcttactaa attcttcaag 8640cagtcatcta ttttcttttt tttttttttt tttttttttg agacggagtc tcgctctgtc 8700gcccaggctg gagtgcagtg gcgcgatctc ggctcactgc aagctccgcc tcccgggttc 8760acgccattct cctgcctcag cctcctgagt agctgggact acaggcgccc gccaccacgc 8820ccggctaatt ttttttttgt atttttagta gagacggggt ttcaccgtgt tagccaggat 8880ggtcttgatc tcctgacctc gtgatccgcc cacctcagcc tcccaaagtg ctgggattac 8940aggcgtgagc caccgcgccc agcccatcta ttttctcaaa cctattaatc agtcatttta 9000aaacctgtat ctgacagttc cattatttaa gcctccatta ggtttgtttc tactgtcagt 9060ttgtaggggg ttttttctcc ctcttgattt tcagtcataa ggtcttaatg tgttaggtgc 9120ctggtcattt attgttgaat gctgaacatt tccatataaa aaggtctaga atcatttgag 9180tttctatttt ccaccaaaga aaattttgtt tgcttctgac agatggcgta gaaagagatc 9240accttaatcc aatctgagac tgagcagagg caaagttatg tttcctgtat tgtgaaagca 9300agtttatttc atgtttgccc ttattcctag gcatggccct ttaaggattt caactgaaag 9360ccttgagtat aactagaggc tctgcttctt agcagacctt gaattccaat ttttgtccct 9420tcagactcat gagactgctg taaacaccac tcagcttctg gaccagtgct tacaaattaa 9480caaatacctt aagaggaaag gaaaccaaat gtcaagctta cttcactgca cttttttttc 9540ctgcacttct tttccatctt tgatcttggt cccttaaatc cttgttgctt tgttagctct 9600ccaaagcctt caaacaagtg ctttatgtat tttacctacc ttttcaatgt tctccatgaa 9660acggtaagta agatacaagc tagtctgcca tagacagatg caagcccaag tgaatcattt 9720ttaagagaat aaatctggac cttcttatgt atttcccatg tgatacatca tcacagaatt 9780atgctatgaa tctataacaa tagtattgtg attacttaaa aaccacacta tatcctatat 9840agtgataaga aattctctca ataagaatga gcacataata aattttcatg tgtaagcaat 9900agcctcatta atttttgcag gggttgtatg agctggttta atacctgtat tgacctcaca 9960taggcaaaat tctttgagag gcagggaatg tactgtaata tacttggtgt catctgcatc 10020accaaaaata atgcagttac ataaaaggta tgcaggaaat gttttaagct catctaaaaa 10080tggtttatat cccacaataa tgtaatttct tttttatata tacgtatata tgtatatacg 10140taaatgcttt tcaagcaaag atatcctcac agcgaattaa ttcatgtata agtatttttt 10200acttggaacc cacattcaca aactgagaaa ctagaaatag gttctaatct aatttaaata 10260ctaagtttaa cactaactgc tcaaacagag ctctagaaca actatacctt taactttatt 10320attttattgt gtgtggtata agttgcactg gacacattaa ggaggcagct gcccacctac 10380agcccttcca agtccaaggg cctccttcat agcatgtgct gaaacagctc ttagggcagc 10440cataggcaac tggaaagagg atgagcattt gccctggggc ggttaactag agcctgacca 10500aggccaatgg tgcaacctgg ggtgaaaaga ttagccaagt caataggatt ccatctctct 10560agaatctaga gatagacatg ttgagagaag gagtaaaagg tggtccaaaa aaaaaaagta 10620
ataatggaga aagacgccat aaaggagagt tttccattgt tgtggaagag ccacaaccat 10680gataaaacag aagctctgac gcagatagga gaaaacagga agctgtggta aaaataatca 10740attagcattg gcaagcagaa gcagacagat ggagaataag ccacgtgaag gacgagccct 10800gcagtggaaa cgcccacact cttgtggccg aggctcctgg agctattttg gatctctagt 10860tctagtcctt gaacctggac tgtcctgccc agattcttag atttgtctcc acgtaagctg 10920tacatgctca tttcttaaat tcccatgaga taactgtttc cccaatgccc cctccccata 10980tcccttcaat aaagtttgaa gaaactgaga cggagtctgc atgctttgag gcaaaagacc 11040agagtaatat aacccttcaa ctccacccag taaggggccc aatttactat tacagatgag 11100tcttccttga attcaattta agatacatca gacagttggg gcatttgcag ggagggggat 11160tatgcaggca ttgacaagga gaattagcag gtgacttcca tagcagataa agagaagtca 11220ttacctgagt aacgttatca tcattggcag tgttgaatct ccgcacttct ccagaatatt 11280ggatgctgtg ctccagggca gaaggctgtt gttccggagc accaaagctg ttggggtagt 11340aatttggagc accaccttca aaacaaaacc acccagatgc acttaggaat aagaaaagtc 11400aagtaagtct gcaaataatc actgtgatga gaaataaatt caagtggtaa tcaaatacac 11460acgtacacat acacagatat aaacacaacg cacacatatt atttttaatt tcccgcattt 11520agctacaggt agtatgaaga ttcttaggga acgctgccat ctgctaaatg cttgcacagg 11580ctgccgcact ttatgaatga atctcaaagt cccttttgac acttcaaagg gtctcatcta 11640tcaagtcttc tgaggggtac agcacatgta gaagtttata caggcttgat ttggccacca 11700tatagggatg aggctcaaag acacatttca aaattgactt gaaaaattgt gtcatttgga 11760cttgggctca attcaaacac tgcatcacaa aattcttgag ggaaatctga aagttctggt 11820tctgctcctt gaatctacag acacaagcat ggagctctgt gatgggacct gactgctgca 11880aggtcacacg gtagccagtg gtagatatgg ggttggaact ctgggttttt tgtctcctcc 11940agcccagcat atacagtatt tccattacag aactctactt tgctattccg taaagtgttt 12000ttaggattct cagggtatct ctcctttact gacaatgatg actttgttcc attgtagctt 12060cactttcata ccctccacag accaataaac aaagaatttt ttaaaatgtg gtaattgtat 12120atcagcactt acttatctgg acttataaga aacagtgaca aatacaatca aaatattttc 12180tatgactttt gaaataaatt ataaggcttt tttttcgttt tagcatattt attttctcaa 12240ctatgctttg gctgacatta gcagaagctt tcattacccg agcacacact gcctaaacag 12300gagtggccca gaaacatatt aagtggtttg agcaaaccaa tctggggttg gaattttagc 12360cagctcactg ccgtaataga ttatccacag tggataatca agaggtgcct atgtatgaca 12420ttcatcaaga caccaagtgt gtgtgtaggg gaaggaagaa caccatacta ttatagagcc 12480caattattca ctcaacaaat tcaacagatc agtcacatct acatgaaaag caaaatgctc 12540caaaaaccag ccatcacagt gttttcttca ttaagaacta gctctttgaa atgtgcctag 12600ttaattttta aaatcctact tccaaatgag ccctgacctt tactcaaagt ggtagttgtc 12660tttaaagcac tgaccacagg aacaattaag ctctttcact gagcttcagg gtcacagccc 12720aaatgctcta cttttacaat caagccaggc gcggtggctc atgcctgtaa tctcagcact 12780ttggggggcc aaagtgggtg ggtcacctga ggtcaagagt tcaggaccag cctggccaat 12840gaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaaa ttagctggcg tggtggcaca ctcctatact 12900tccagctact cgggaggctg aggcatgaga atctcttgaa cccagaggca gaggctgcag 12960tgagccaaga tcatgcactg cactccagcc tgggcaacag agtgagactc tgtctaaaaa 13020ataaataaat agataaataa atatagcaaa atgtaatagc tatgaccttt gggtgttggg 13080actatatggg aatttttctt ttttcttctt tttcctatat attccaaatt ttctttagga 13140cacttgtatt atttttatca tagaaaaata aactttgttt gaatatagac atctgtggct 13200ataaatataa atcatcagta aaatttctaa agggatcaat gcatgcagtc tatattacta 13260aaacacgtgt cctaaatggg aaaagaaaat aactaagatc tatattaaac tgtggaatag 13320taaaaggaaa aaactttaat caagcattct gcttgactta ttagaaaaag taattagaac 13380cagaggctgt ttgtatacga caccaaaaaa aaagtagtta aaagaaaaag atcctaagtt 13440tgataaatga gttccaaaaa acaaaaagtg gtaagttgat tcacctaact ttattcactt 13500aggaaaaaat gaagggaggg gaatcctttg acttgctctg cctcccctac tctcttctcc 13560
ccagccttcc ctgctaattc tagctcccct ccaaattcta gctagacctg ctcctccagg 13620gccacagcag aactgcaaag agaaacagaa gactccaact cttggctttc gcacttccaa 13680gggtctaagt cttggtgatt tcacagtgag ttaaggaatt gtccattttg gtgaagtgtc 13740ttcaaaacct aactcccaag ctggatgtta ctgtactcta gccagtgtga aagatctttc 13800tccctgcttt taactactgg atacaagtaa catctgaggt ggaaatgctc aataaaatat 13860ataaaataga taaaaagcat ggagagtcct caggcagcct aaatcttcac tgctgggcaa 13920aaaagcgccc agttagcagc acctggggag cacctttacc aagcaggagg tcctgcgggg 13980ccagcttgag agccactggc ctggcctccc gcccatctgc tccacgtgcc ctctgcccac 14040gcagggggag cccaacgtct ttaggcctac cctgattgtc ctgcatgcac atcgggccat 14100cacgctggta gttggccact cgagcacggt agggacagtt cacaggtata tgaagataat 14160tgggtcccag gcgatggcgg tgagtgtcag gataggcaaa aaggcggccc tgcagtaata 14220aatacaatag acactgacta ggggcagtaa catataacat aggaatgggc tgtaaacttc 14280attctgaaat ttgaagtaca aagcactctg tacatggtta ccacaaaatt ctgcctttcc 14340cgctacttaa gagtgaagcc tctactctta tgaaacgagt tctccctaac tgaacagttc 14400tgaatttccc aggccctctg gccaaccata aatcttcaca tctgtttttg gtaataatat 14460cttttttttt tccttctgca taacaagtta gtgtcttgtc ttatacagta ttacttccta 14520ttcccaagga agtattgcat tataaaataa atgtgctaga acgttaacta actgaaatat 14580tgaattaatt ctattcctcc tcattccccc actccaggga aggaaccaat catttgctct 14640ttacaaaaag caacacattt ctacaaaacc aacagcatgg gaaattcttc aaataagcac 14700ttccaactgg gcacagtggc ccatgcctat tataatccca gcactctgga aggccaaggt 14760gagaggatcg cttgggccca ggagtttgag accagcctgg gcaacacagc gagacctgtc 14820tctacaaaaa aaaaaattaa aacattagcc gagcatggtg gcatgtgcct gtagtcccag 14880ctactccaac aggctgaagt gggaggactg cttggcccag gggattgagg cagcagtgag 14940ctgcaatcgt gtcactgcaa tccagcctgg gcaacaaagc aagatcagaa aaaaaaaaaa 15000aaaaaaaaaa aaagtaccgc ccactcccat gctgccttct gaattatctc agaaacactt 15060tgagctctga gactttctag atataaacaa caataacaaa aaatctgtgg ttcaaaatga 15120aagccctaca atgccaaagg taatcaatct aagattaaat tatgttccat gttaatcaag 15180gcaaagatgg caagcatctt gaaatttctt tcagttaatg ctcaaacaaa agctttatga 15240taaattctgc attaatctta atatctaatt attgaactat tctcattatt catactcctt 15300ttctatgagc aatttttctt ccattgaatt tatcattggc cttgaacctt aaaagtattt 15360ttatatccct aattctatga ggcaaaataa aaaccaaatt gaatagggca acttaagcaa 15420taactttgtt ccaaatcact gataccaaca gacttaatcc agtcccagtg ttctgtcaat 15480attttgcttt tggctgaatg actccctctt atcatcattt caaatagcct aaggtcatat 15540ttagatgact agccatgcgg ccatgaccaa aactcagcta taggttggaa gctggttgtc 15600tcctttggct caaaaagttg tgctcttgac tccatcaaca ggataggaga tacaatcctg 15660ccatgggcag ctcctggatg tagcctctat cacctaattc tgattttgtg tcaccctgtg 15720tttatcaggc aaccttaccc cacctatggg tggagaccaa caaaggttgg gaaatgggca 15780cagtgaggcc ataccctgac accagcttga atctaggcct tccccaaggc cctgtgcctg 15840aactcccttg ctggacctgc gtgagtggga aagcctttcc cacccaagca accggcccaa 15900cttctccaac tcttggcaaa atgcagagaa tgagagcaag aaaggctgca cctgtgtcct 15960caggtactca ggggacagga cagtctctct atgacttgta ttatattatt tgtccatttc 16020accatggtgt ggctcaccac tttggataaa gttataaaac ttaataacat gaccttgtta 16080aaaggcacct gtaaacactg cccattaata tatcaaccgc cactgcctag gctacaatac 16140tcatgagctc tcagcaggaa taaccccaaa gcccccctaa ctggctttcc acttcctgtc 16200caacaagaca atctacatat tccctactca cctactcaaa aaatctcaaa tcattcctta 16260atggtcacca aatggctaaa tgagtacaac agtccttccc caactgtatg gctcctcaca 16320ggctccatgg tattggaact gatagctaaa tgacctaaga aggatggggg aaagctaggc 16380tagaaacaat aactcgacaa acttatgaaa gctctttcga acagtttcta aaactcattt 16440aaaaaaaaaa caacctataa agagtacact gaatttaaaa tagatatatt tgccagaact 16500
aaaattaata ctaacagaaa ttatattact ttctacttgt catccttttt cagaactctc 16560ttccccactg tttgaatagc tgccttagac atttgctttc ttaggaatgt agagaatacg 16620tatttgcttt gcagtccttt tcccgggggc ctagttctcc attcaaatct tcattgttct 16680tcaaattata tgactcagtg ctgctgactg cctcacggtc ccactgtggt tccagagacc 16740catggtgact tggattcttg tgaaaagagt ttaggtaacc ttgtattcct caatccgttc 16800cctccctggg taaccagggt tatgcagcct ctgctctgcc catgacaatt tcatgccttg 16860gcaaatccca ttagcctcat cctctcacag ttcagccacc aggtagggag ttttagggcc 16920caggattacc ttgttttggc ttcctctact ccctggtttc aatgcaaact tctgcttttc 16980ctctgagaac tgcctgactt tccttttgct attcccaatc cctagttgtc gctttttcta 17040tttatcacca agaggagtga ttctactcaa tatatcccag accacacttc tcaaaactga 17100agaaagcttt tcactcctac tcaagcattt aaggtcccct ctgacatata ctcaatgaac 17160ctacccaaac tctattcttc tcattcagga gagagtgact gtttatagtt tcaacacacc 17220taacatgtcc cacctttgtg cctatactca tgtccttctc ctgccgcatt ttacctacta 17280aaaatcaaaa tcctatctat tcttcaaaac aatctcaaat gctacctcgt tcatgaaact 17340tcgtggctga cctcctatca gacaaaattt tgctttctgg atcaccatgg cattctgcct 17400tacattatgg cacccaagac agtccaccat acacaacaga caggtactca atttgtaaca 17460gttgaattgg actaaaaact aatgaaaaac ttactttcta taaaagcctc agatgttccc 17520caatgtcata agcaaaaaag ttatttttta aaaacggaat cttagcttgt cctccatgca 17580gactgaaacc tgaactggaa tcagatactt acataagaag taaccttcag tcgctgtggt 17640ctgatttagg gtacaatctt taacctttgt ttcaaggtca cagtctaaaa ccacaaaaga 17700ttgatttata cagtaattat taagccaatt attttcttac tgattctgat ccaaagtaca 17760atttttcact cttggtactc ttgaaagaga tattaaaaag tgatgtaaaa catactgatg 17820gcttaacatt agcaaggtga atggttaatc cactgctttt atcactggca gcatacatgt 17880agttcataaa gatcatccct agatctcttt ttacaaatgg aaaaattcaa gcatcaccat 17940gaaacagaaa atgaggccag ccacggtggc tcacgcctat aatccagcac tttgggaggc 18000ggaggcaggc agatcacttg aggtcaggag tttgagacca gcctggccaa cagggtgaaa 18060ccccgtctct actaaaaata caaaaattag ctgggcatgg tggcgggcgc ctgtagctaa 18120tcaagaggct gaggcaggag gatcgcttga acctgggagg cggaggttgc agtgagccga 18180gatcatgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagcaaga ctctgtcaca aaaaaaaaaa 18240aaaaaaaaaa aaaaagaaca agaaaataaa gttaggctta ccaaggtatt ataattaatt 18300aaccatactt cagctacaga cagaacaaac catgcttcac tctatcaata cttaaggtat 18360ttctattatg tctttttttt ttaattaaga gagtaagtat tcttgtcttc acatatgtag 18420ggatcttacc atggactttt gtttatactt ggtttactca aggaatgctc attgaagaat 18480agttcacctc agtgaatccc acaaggtaac caagcaccca gattaaagtt taagtaatgt 18540tcttgttaat tcctcacata aagatcatgc caagctgcat attttgtgtg tgcatgctca 18600catggacacc tgcctcagaa catctcaatc caccaggctc acctgaagca ttttgtcagg 18660actggcctca atgccaggtg gcatgttgct tgggtcgaag gctatctgtt caacctcagc 18720aaagtaatta actggattcc ggtttaagac cagtttacca actgggatga gagggtagtc 18780cttgtgaggc caaacctgaa aatgatgtca tattcacaat taccaggcaa tcaactgaag 18840gaaatcaaag ctacccacaa aaataccaga tttcaaatac aatcaagcca atgaaaataa 18900tttttaaatc caataaaaca taagaattta agatgagtgc cttagttaaa tctttcacaa 18960tagtaagtgg taaatactga cagtttcccc aggaaaaagt acatcagctt ttcataatct 19020gttccctgtt aataacaata tatgaagcca catacacata ctcaatgaaa tgacaaacag 19080gaacgtggaa gtaagatgct ggtaagcact cattcacagc ttaggacact ctgaagtggt 19140accctctgta ttttgtatat gacttcccca ttattataat tgtttgacta gatttttttt 19200ctaattaggt aagaagagac ttaaaaaaga aaacaatata gttgtttact gactcacctt 19260ggtgagatcg aatggattaa atggaaaagt ttctgcctga ttaaatgtca tgacctggat 19320gtaaaaagtc caggaggggt actttcctgt ggcaatggcg ttaaaaagat cccggatgcc 19380atagtcagga tcttcctggg aaagtctcgc cgcatcttca acagaaaggt ttttgatgcc 19440
ctggtcagtc tacaaaatga aagaaagaag ctccaatgga aacttattgt caaagttatc 19500aaaatttcat cagtaattca ttgaaggatt atgagtaaca ctgcccaaag aatgaacttt 19560ctttacaaca atacttctat tgttcaaatc tgatactaat gaatttatca acaagaaatt 19620ctacttgatt atcccaatac ttttaaatgt caagggaatc ccatctacac atttcatatt 19680taaaatcagt cctatctttc cctttatgta ttctattatt tgaattttta cactcatgtt 19740actttccaaa tcagaaaaat caaaatatac ttaaaagtag gcaaaagatt aataaaatta 19800aaggactact tgccttttat catgaagtaa tgttttaatt ccatttcatg acagctcaaa 19860tcaattactg agactgtgct cggccagtat cccttcaccc ctgtcctatt cctttttttt 19920ttttttttaa taaatcatag aatcatagct catagagttg aaaagaactt cagtacagcc 19980acctggaact agttctctga ctatgagcag gcaaaattaa tattctgact ttccaagcaa 20040gacattaaaa cccagagaag ctgtgtcact tcataagtgc tcctgttatc atatcatact 20100gttctttgat ggactgacca tgtgatctta ttctcaaaga cctcccaaca agccaagtgc 20160cgcagaaaga tttccttagc aaaaatcaac tctgaacgct ggtctatttc taccacagaa 20220atcccaactg tctcatcagt gaaaaggttt gaactcttac tactgaacaa gaagtaaagc 20280caccttcagg attaaaacaa tgaaggtcac catgtacaga tcgcccaaag agctaatata 20340ttaagtagta caataacact gcaatacctt tctgatttta actgaatcct ttaggtttag 20400aaaagaataa tcttaggtca gaataatcca gactgatgaa tccatgtaga tctcaggcta 20460ccttagggcc ctaggataaa agacccacaa gcaatccaat ctttccagga cttgtatagc 20520tggtaatatt atgccaactt cacagtgaaa agaactggag ctcaaagaac ttttaatact 20580atgcccaagg ccacaattat ctaggagagt agaaatttga gttcaggctg gcataactcc 20640aaggctacca actagactgg ctgtcctaga tacaaccact tagtcttatt ctaagtaata 20700ctacattgac ccttttggca attacaagcc aatgggtcaa ctgtttcata aaatttttcc 20760ttgtcaaata ttatagatcc aagttatgaa tataaaaaga ggtgatagtt ttcctgtttg 20820atatacctac attaaattgt tcagataaag aagaaagcag gatagaagaa aatagggctt 20880ttggatgtca ctaagagaga gattatccag tactggtcac gagcccactt ctttctgctt 20940atcttagcag cagtatttgg aaacagaggt tctcaggctt gtttctgact agcccttggg 21000agttctctgg gaatatcact aacatgccag ggttcactgg caatattgct cattgtaaca 21060aatgccatgc ttataccaaa agagggccct ttataatatt tcagttgatt aaaacattct 21120caaaaccctc cccagatgta actgatttga tctggctata tgaatgcaaa tttttaaaaa 21180cagtataatt ttgttttctg acatttgtaa ttgattttac ttatatgcct tgttcataat 21240aaaacctcaa taaatgctaa gtaaatagat ggatgactta aaaagttaaa agaaatgata 21300ttggaaagac actattggat gttggaagtg ataatgagat tgggatacgc tccaaggtcc 21360tcagatggta gccaacaaaa tcagtactga tcaatgagat caatacttcc caactttggg 21420gatggaggtg agggaaaagt gggagaagcc ttaatctttg ctcaatcctt caggaaaaat 21480aaggaggtat gcggtaggag ccttgtaccc tctgccccaa aggtaacaca taccttataa 21540tggaatttgc aataaactgc ctccccattt gcattaacca gcttgaaagt atgtgatcca 21600tatccattca tgtggcgatg tccatctgga atcccccgat cactgaacaa gaaagaaacc 21660taaagaacag aaatataaag cctaaaatgt tttcatttaa atcaaaacat ccttgatttt 21720taagatattc cttagtttcc agaaagtccc ttaatgacat aaaacatact agccaatttc 21780ccatgggaag ggttaccatt attatttcac ttgtagaaaa taacaaacag aaaaatttta 21840aatcaaaatg atatgcaaat cactaatact atgactcaaa attctatgaa ggaaagccaa 21900aacaacctga aaactggcct aatttgttat tcaaaattta tttgcatagc aaatttgttt 21960ggtactactt tccccccact tccttaatac agagctttac cttacactac agactttcat 22020ccttactact gctaaatatc aactgacaat gttgctagct atctatcatc atcatcatca 22080tcatttaagg ccgatgaatg ggggatgatt agtaaagcca gttactacaa aactcttcac 22140gatcaagaaa tctgaggaag ctgattccaa taaaatagcc aaaactggag agacacttta 22200tgaagaggca taattaaaca ctgcatccca ggtgatataa tacaatggca aaaaagggtt 22260catacctgat gcagagactc aggacgtagg ctccagaagt cccagaccat gtccggatcc 22320ttcagatgtg tctgaggatt tctcttttgg ctgtggataa aagatggaaa ctaaatagaa 22380
aaaagagaga aaaaaatcca aaaactaagt ttacaggaat tatggtgtct ttcattatat 22440atgcctatta ctaggtttat ggattataat tctaaataca atcctagaat tttaaactgc 22500caaaccataa tatgaaattt actcagcata gacaactagc atctaagata ccctaaagta 22560tttcaaatat actcaaaact atagtctttt cttttttttt ttttttaaga cagggtctca 22620ctctgtcacc caggctgatt gcaatggcat gatcacagct cactgcagct ttgacctcct 22680gggctcaagc aaatctccca cctcagcctc ccaagtagct gggactatag gcatgagcca 22740ccacacttgg ctaatttttg tatttttttg cagagatatg gttttgccat gttgcccagg 22800ctggtctcga actcatggac tccagtgatc tgcctgcctt ggcctcccaa agtgctggga 22860tttatagtat ttcttcacgg aaaaaatata cccaccctcc cgcatgcgcg cacgcacaca 22920caccccctcc tgctgactca gagcatgtag agacaccctc tgcttgtttc caaagtaaag 22980tccctctttt tactaatctt cgatgctctg caaggaaaac taaactcact tcccattaag 23040tcaatctgtc ttaaaatgac aaatctaaga ccaatggtaa ctgttcttac tttatcttat 23100taaatacaga aaaatgtgtt gaaaaaagta gtccagacaa ctcgcattct tttctttctg 23160cctttcccac ggcttctcct caaatgccaa cctatttgaa atcaatttaa gtcaacaaac 23220atttgttgag tgcaaaatac tctattacct accaatatgg gatccctgat gaagaaaatg 23280ggggtgttat ttccaacgag atcccagtta ccatcttctg tgtaaaattt cactgcaaac 23340ccacgagggt cccgaactgt gtcagctgaa cccgattctc cagctacaat attcaaatgg 23400aaacaggaag cataagccac agcactttgc atccaagaag cctggagaca taaagaagca 23460cctggatcca tcctttctaa tccacttcca agaactaaat taggtattta agtgcccggg 23520ttattatttc tacccaccag ctaattcagt ccacaaatca aacaaaataa ttaattgaga 23580gcaataagag aacacatgta ataacagctg acaatgtcat tcatttacca taataagata 23640actttgttca aacaggtaat tgaactttta attaaaataa gggaagaaaa taattatgag 23700gcttaaagta gtgacaaaca gaataagtga gttgtcaaaa tgatgaggtt aacattaaga 23760aaatgagtta aaatattggt tcttagttct taatttcatt tatttttaca ttccacagta 23820tttttaaaat gcagagactg acacagaaac ggaactagtg aagcactagg tatgttgaaa 23880tatagtatga tagatctaat actatctctg taacgtgaga aacatcactt agcctctcaa 23940aaataaaaag aatcccactc tgcaaagtag atctacaaat cagagattat atctgtaaag 24000cacctaacca cagttggcac agaattaatt ctcaataaag gtcagctgta ggcatagtta 24060ttaaataaga tttccactct attcttctgt tagaggcaac cacttttagg aaagctcttt 24120ccaaatgtca cagaattgca gaggtagcct ctgtgtaagt gtgatttcct aagacctcaa 24180caaacagaaa tacaagtaac ttcctatgtg tctccaaata tgtcttctac tgtaaaacct 24240tgacataatt tggagaagtg cttgcttcct attttctaat aactttttct ttaagttata 24300aacatcccca aaaggtgaag ttgagttaag ccataccaat cacgccaata aaccaactta 24360ccaacagtgg agaaccgaac tgcgatggga gtcttctttc caatatgctc aaataccttt 24420gccttggagt atttggtaat gtcatgtgtg acctcaaagt agccaaaggc ccctaacgag 24480aaagacacag aaatccttac catgagacca ttactcagac attcaggtcc tcaacaggca 24540cctgggtgac aagagaaaat gatggttagc accagccttc tgggagcttc cagtatgttg 24600gaggaagggg aaatgcccaa acacaaaata aagagggtga aatgcaaagc cctattctat 24660cattcagtgc taagtcgaat gccacatagc tggagccaag agaaggaggt gagtgaggct 24720agaagtcgtc aaggttggcc caaggacaca gggtctcaga ggggcctgaa gtacaggtag 24780gacctatgag agaaagtgaa gaacagagag aagaggagat gaaaacataa gagaaagaat 24840cttttcaaca cttagcaacg atgatacaaa gcaagcaata aactaaacaa gtcaagatgg 24900aaaaatacac acaaaccact ggagaagatg gggagaaacc ttatccagga agaagagatg 24960aagaaatgca gaagtcctaa ctggaagtcc aagtcagcaa gctaagagaa aaacttcctt 25020tctgtggagc tctttttcca actgagtttt tcactttctt tcaaatacca cccccatctt 25080ttgtgtctga tataacagcg ataaagaaag ttttacagaa attgttggaa aaaaggaaag 25140gaaaaatcat cacaaaccca ccaccctaac ataactaccc caaattttgc agctcattcc 25200agtaattacc cagtaagtac atcatttaaa cttagttgca attgcagtgc atgtgtctat 25260gtctgtattt ctgtacagca ggtcctcaaa caacattgtt ttgttcaacg ttgtttcatt 25320
ataacgttga tgagaaaaaa atctattcct agctgaggcc accatctgtg tggagtctgc 25380atgttctccc catgtctaga taggttttct cctggtactc cagcttcccc ccacatccca 25440aagatgtgcg tgttaggtga actggcatgt ctgaatggtc ccagtgtgag tccaccctgc 25500aatggacagc atcctgtcca gggctggctc ttgccttgta ccccaacctg ccaggacagg 25560ctctggcctc ccaccacctt gaactggaat aagctagtaa ataactatct tattttacta 25620atctttctta aaggtatgta tggctcacat ttatttcaat gtttaatata agaggtattt 25680tgagtctcta tttagaagtt tgatgatgtt ttatcaatca gaaatatgcc ataggaactt 25740aactcttgct tacgtcaatt agcctatcat aaaattggtt tcattacatg tcgtttaaag 25800tcaaagtttc caagaaccta ttgatgttaa gtgaggactt attgtatttt tattccttca 25860atgatgggag aaatggaaga ctgctatttt taaaagaaac tattttatat ataatgttta 25920acctgaggaa ataaccatca tttatttact aatttcccta ctgctggatg tttttccttt 25980ctcccacaaa tggagatttg acacttgtgt taaaggtctt ccaatccttt gggaaataac 26040acttgaccca ggtgctgtga aacaatcttt ttacagcaaa taaacacagc acttacctgc 26100tcctttagca tgcacaactc tctcaggaat tctctctcgg tcaaaatgag ccatttcatc 26160agtgaaaacc acatcctgaa caagaagggg cccacggggc cctactgtaa taacattaag 26220tttgtctcct actgggttac cagctccagt ggtcaggaca tcagctttct acaggaacac 26280agaaagaaag tgcaggagag ttagcacaat caaacctttc atttacactg tcacgggtac 26340atagctttgc aatgtttata ccatctgccc tcttttttaa tttcctgtgt ccaaagtact 26400aaaatctgac aggatgggcc attgcctgaa acttttagtg atgccccaga aacccttgac 26460aaatctcaac actaatctgc taagaaactt gctctgaaga gcagaaagat gattttggag 26520cctgaaaatg tgctcagcac ctgctccaga gaaagccact gggttctgca aagctcccag 26580tcagagaggt gcccaaaagc gtcctacaag cttaacagtg aaatgtccaa tccagcaatg 26640agaagacggt ctccagggaa gctgtgctgg tcaatacttt actcagaact tacaaacgct 26700ttattactgc cacgatcttc aagtgcgcta ccttgtttag tgcatctcaa gaaatgtaca 26760ccagctattt gcaacatctc ttttcaatta aaaaaaaaaa gtcaatggct ttcactgtca 26820ctaaaagtaa actgttactg gtaaggtgga ttatagtatt aatgttttaa agatagcaaa 26880tgtctctgaa atgggatagg ttattttact gtaataaata attaatttta atccacctga 26940ttctccaatt tcagttacat cagaagacac tcagctgtcc ctcctctagg gttagagcgg 27000cattcttcta gccccacatg atcctggaag ctcatagctt catctagttc catggtcaga 27060gaatactttt gaccacagac aactgcctct gcagtgtctt ccccgggtca ctggaaatca 27120ggagagacac gtaagtgacg caaagctacg ccacctccac ctgggagagg aactcaacgc 27180tgtctatgac aaaactcaac agaccaactt cacacacaga gaaaagcact atttttagta 27240tttccacaca cctagagtgg agtctgtagt tttactcccc atgcatgtct gtcctgtaca 27300ttaaaataaa ttcctgcctc ttctctagaa ggcaatacgg tggggagtag gcacttacaa 27360aaccacaaaa gatctgtgag ctgtttgaaa aaagatattg aataaaggag accgtgcaat 27420ttgcaaaact aataaacaag accctctcac acactagtaa atgcccttgc cactagagtt 27480atatcttcat ccaagtagga agaggccaac atggcagcag ggagaaacta tgagtgccag 27540cactagagcc tgggtccaac ttccagttct accaattacc agctatgtag ctgctggtaa 27600gttacttatt tatgagtctc cattttcatc tgcaaaatag aataataagt acctcctaag 27660gttaacacat gaattaaaag agttaaatgt aaaatgcaag ccacacattc aacacatata 27720tgctgtcact tcactggctg tgagaacatg acctcgcagc agaaggagca aagcatttga 27780agttttattt ttctagtaat catgacagat gcatactcct ccatccacac tctctcactc 27840taccatctct gtccctaaac ccatctagca aagccccttc taaactgtca cagtttaagg 27900gtccaatcaa cacttaccac ccagtcacat cactcttttg aagatacata tgttgctaat 27960acgtgtgacc ctctgtgacg tgctaatacg tgttaccctc tgtaggttta tttttaattt 28020aaagtagaaa atgaaccaga aaaaaaattt ctactttcta aagtagaaaa tgaaccagaa 28080aaagagcaat ttcaccttta gtttaaacct aaagccttgg ttttcaacct tggcaatgca 28140ctaaaatcac ctgaggagct ttttaaagcc tcctgatgcc tgggccatcc cccctagaga 28200tgtctgatag aagtgccctg ggtgaggcct gggctatttt taaatgactc ctgttcaagc 28260
taggattgaa aaccactaac ctagaactat tgggtgataa caaagttaaa ataattagag 28320agccagagca aaccaaatct gttcactctt taaatgctct tttcaactta caaacaaggt 28380atttaaggaa gcctttaaaa aataaaggga catccaggct gggcgcggtg gctcacacct 28440gtaatcccaa cacttcggga ggctgcagca ggtggatcac ctgagatcag gagttcgaga 28500ccagcctgac caacatggag aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaatt agtaccaggt 28560gcagtggagg ggtgactgta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga gaatcgcttg 28620aacccagcag gcggaggttg cggtgagctg agatcgtgcc attgcactcc agcctgggca 28680acagcagcga aactccgtct caaaaaaaaa aaggggggga catcccataa aaggtacaag 28740tatgagaaaa gataccaaga agctcagtaa aaggaacgct aaacagatga gagtgttatt 28800tacatgccag cattcttaac gtggggaggg agctgcccct aaggcagaga tgagagcaca 28860tcacatgttc ccttctggtt accgggtcag ggtgatatgg tcaagaataa ataccacacc 28920caaaggcagc aggtgcagag ttggataaat gaataaagta ctaaagcttg aggtggtctt 28980tcctgatgac actgactatt aagagtggga atgctggaat tatggcagtc ctccctcctg 29040cccaatgaag gaatcccctc cttaacatca atcctgttaa gaaatgaaac ctgagttttt 29100aagttacaaa tggaggcttc agaatctctt ccatttcccc actctaacag ttagatcaat 29160tgtcctcatt tatataacag ctttccccac aagctcatgt atatacaatt taccttcaaa 29220gccagtgggg caggaaagct tcaacagtca gcaacagaaa agggaagcca gggagcaaaa 29280actagaaagg aaaagatccc ccaacttcag gggatgttta gcgcaacatt ggataagagg 29340aactgatcta aactgaaaga tagagtatta atattagaag gtgaggagca ggatgcggtg 29400tatttaagat gaaaataatt aatgcaatga agatttacta gatgaaatga gagggtgggg 29460ctagaaaacg gaccacgcaa gttatctcac ttaagcctgt caataatcca gagatcaata 29520ttattaatcc catttaatgg gcgatactac aaactcagaa aacttaagta actttgcaga 29580gatgtcagtg ttgtggcaca ggtttacttg ttacatgtaa cacgtaagga caggcaaaga 29640gatttcctcc aacttgcaat tattgttttt aactcaatga ataactttag agccagaata 29700tttttaaaga gagaaaagct tctctatggc tggataattt taagacctct ctctggagag 29760gtccttgtta acatgtttac atcttcctgg ctgctagctc ccatgacatc catacgtacc 29820tctcctgaac tgctctctct accctgcccc acaccactca tgaagcaggg ccaagggcat 29880cttcttgtgc cccatataac aaaatattgt aattgcctgt ttatgtcact gtttttcttt 29940tttttttttt tttttttttt ttttgagatg gagtctcgct ctattgccca ggctggagtg 30000cagtggcatg gtctcagctc actgtaacct ccacctcctc ccgggttcaa gcaattctcc 30060cgtctcagcc tcccaagtag ttgggattac aggcgaccac caccacaccc agctaatttt 30120tgtattttta gtaaagacag ggttccatca tgttggccag gctgatgatc tcaaactcct 30180gacctcaaga aatccgccca tcttggcctc ccaaagtgct gggattatag gcgtgagcca 30240ccgcgcccag cctgtcacta tttttcctct ctagactgtg tactcctttt acatctatat 30300acctgatccc taatacactg ctcaatatac taacaaacat aaaacaaatg tgtgtggatt 30360cagcatgcaa ataaactaaa ccacggacca atatgatatg gccaagagcc tttctaacaa 30420gcaggaggaa gcagcaacag tctatccctc tccctgcatc gcccctccaa aaaatgagag 30480aaatatttta atttataaat tctgatcaaa cacctttaga cacacttgtt atgaaaactg 30540ccacagaaat tagcttggct aaaaactagc acaattatta gaagtaggga cttaaagtaa 30600aattctattt tgactttgct gcctttatag gcttcttttg gccagagcta atacataaat 30660gaagaagttt tcctgggagg agtaaggttg gcttcatctg gtgaaatatt ttatcaacat 30720attacacttt ccacttagta gttcccttca ctcacagaag tttcaagaac ctaaacatat 30780tcttccactt ttaattaaaa gattggttaa tgcaaattgc ccatcagtcc cagaggagtc 30840ataatgacgt cttttcattc tgtgataaag aatgtgccta gcgttttcta gcaaataact 30900gcctaacatt ctccatttat tcaacaaaga ttcaagtgcc tacaacgtat acacccacgt 30960acaggaaacc aaagactgtc ctgaccttca aatttcttgg tctgtgggaa aataataagg 31020gtggtctaga tattgactgc tgtggaagct aaagcaattc cgtcttagat actgatccac 31080catgctgact tctgattaac tccagtttta agatttccag tttatctatt attccttgtg 31140aaagagcccc tatttactat aaatcctgcc ctgaggtcaa acaaccttga cattatcata 31200
cttcagtcat gccatacctc ccttctgaat cgcccttccc tatggtatta agccctgggt 31260ctgaggggta atggtatggg atccaccatc ttgtctcgcc aacacgcaag acacagacat 31320ggtttctggt cctaagtccc tactaaacat ttctttctga gaaacttgat ttgtcagcct 31380ctttctttgg cctctcagct tcctcagact ttgggggtag gtttgcatag acctacccac 31440catgcaaaag ctaaaaaaaa gaaatgaaac cttaaaaatt tctgtcccat ctcccatagt 31500ctctcccact gcacataatg acttagcgat tccataccta ggtatatttc aggagaaatg 31560aaagcacatg tggaccaagg gttaagtcac tcagtcaccc cttctccatc ccaaatgtta 31620gcagtgtaac atcaatgcag ttattaccag gattacccta aaaaaatata gaccctcaca 31680ggctataatg cataggcaac tcactgacag aaatggatag tctaagactt aacctctctc 31740ccaggtaata agagaactgt ataaaaaggt aaggtttgaa atgttcaaat tctcccattt 31800taaagggatc agaggctact tattaacatt tcccatttac ccccaagaaa agagcactgg 31860cagcaagctg cacttaaaaa aaaaaaaagg aaatgggtta aaggtaagta tctcaaaaga 31920agagcccatg gcattctaag cagtgagcaa taaagttccc atttaagttc ccttcaaagt 31980ggctgggaat acctgcacaa ccacctccct cctgccaaga gagaaaaaga aataagaatt 32040tttaagtgga tcgaggtcat actcatgaac acatctgact caatgctcac ttattaaagt 32100ttacaaaact cccaattcac ctgtcagcaa accaaatctg accacagaag atacgcccaa 32160taaattgctt tcacatggtt gactgtgttt ccaaaatagg acactctgat tcttgagaga 32220ggaggcaaca gagtgttcgc ctatagtagt cccaaaccat aaagctctcc tagatcagta 32280aagcatcaca actaattggg aagtggaaga catcatatta gcacaaagct gcccacttag 32340ataaaagcat ttaccaagca aggggagatt tttttttaat accatctgtt actgtcataa 32400ttttctaaca gaatatctta atgtcagaaa gtaaaaatga catattcttt aaaaagaaat 32460tatgttgcat gtccattgcc gcatcacaag aaaatggctg gacagatttt caccaaatat 32520gaaatgtacg ctttggataa tatagtagag tcagcttcct ggacaggggg tagactaccc 32580caggtgtggc ctgtaacaga gttctagcca acagaatgta agtggcagtg accctggacc 32640ctaaaccttc ccacactcat atacccttct ccacgctctt gagccttctg tgctggacag 32700tgacgcccat aaaagccatg tttgaccaag ggggagcttc cttcagcctg gtgccctcaa 32760taactgtggg aagcagagca cccacccacc tccttcaacc tcaaaccact ttgggccatt 32820catgtaggaa aggaatacat ttcttttttt ttctttttga gatggagttt cactcttgtt 32880gcccaggctg gagtgcaatg gcaggatctc ggcttactgc aacctccgcc tccagggttc 32940aagtgattat cctgcctcag cctcccaagc agctgggatt acaggcatgt gccaccacgc 33000ccagctaatt ttgtattttt agtagagaca gggtttctcc atattggtca ggctagtttt 33060gaactcctga cctcaggtga tccgcccacc tcagcctccc aaagtgctgg attataggtg 33120tgagtcactg cacccggcca taaatttcta atatgtttat accatgatac atgttgagat 33180ttattattat aacacttagc ctacacatga ttccacatga ttgaacttaa aatatgggct 33240atgaattaat aatttaaaag caattcaatt tttaaaaaga cagaaaattt gaacatatac 33300ttcaaaggaa tatataccaa tggtcaataa gcatgtaaaa agatgctttg catcattagt 33360catcagagca aagcaaatta aaaccataat gagataccac tgcacaccca acaactaaat 33420gtaaaagact gacaacacca aaagttggta ggatgtggag caactggaac tcccatacac 33480tgctgatgaa gtataaaatg gtacaaccac tttggaaaaa ggctcagcag tttctcataa 33540cacattcact taccttatga cccaataaat ctactcctag gtatttccta agagaaataa 33600aaccacctgt gcacaaaaag acttatgtaa gaatttttat agcagcttta tttattttta 33660atttttaaga cagggtctcc ctctgtcacc caggctagag tgcagtcatg taatcatggc 33720tcactgcagc ctccacaccc caagctcaag caatcctccc aactcaactt cccgagtagc 33780tgggactaca ggcatgtgtc accatgtctg gctacttctt ttatttgttg tagagatggg 33840ttttcaccat gttgcttagg ctggtctcaa ctcctgagct caaactatcc tcccacctca 33900gcctccaaaa gtggtagggt tataggcata agccttcatg cccagccaca gcagctttac 33960ttacaataga aaaaaaatta aatagcccag gtgtccagca acaggatatc caaatggtgg 34020tatattcaaa taatggaatc ttactcagca atgaaaagaa caaactgcta atacatgaaa 34080caacttgaat gaattaaagg atggacagac agatggagta acgtaataaa agacacaggg 34140
caaaatgttc cttgtagaat ctagatggca gatatataga tatacactgc aaaatttttt 34200caacttttct gaatatttga aatttttcat ttaaaaaaag tgtttgaaaa ttatataggc 34260tataaggcat atgcataatt ccttttggag ggccctgggt ggagggagaa gtgcctaaaa 34320gaagtaagcg gtttttacta agagcagcta aaactgagga acagtaagac atcaatgtga 34380ctgccaatca ggacgatgta cacagtgccc tgagatgtca tggacaaagg ggatggctgt 34440atttcaatta agagcctccc aactatagat gtgttttgga gtcagccatt tctcacatgg 34500gcaactatgt aaggtaaatc aacagcaggg acttcaacag ttcatgattc tcccaaacaa 34560ggaagaaggc agctagtctc agaataaagg ggagtccttt aaaaatgaaa atattacacc 34620tgtaatctcg gtactttggg aggccaaggc gggcagatct cctgaggtca ggagttccag 34680tccagcctgg ccaacatggt gaaaccccat ctctactaaa aatacaaaaa ttagctgggt 34740gtggtggtgg acacctgtaa tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aattgcttga 34800atccgggagg cggagtttgc agtgagtgga gatcatacca ctgcactcca gcctgggcaa 34860cagagcaaga ctccgtctca aaaaaaaaaa aagaaaagaa aagaaaaaga aaaagaaaat 34920attttgtttt gtaaaaatct cactactttg tccacacttt tctcaattca ccgagtattc 34980atgaaaactt cagtgtgaac caggatttgc acccactggg taaggaaaga gtcttgggtc 35040caagaagctg aattctaacc ttgtctctgc cagtaagtag tggcacatcc tttactaaga 35100ctctacctct ctctggttta ctttaagagc tcatgaacca acctaatggt atataacaaa 35160gaacagggcc aagaggggag attttccagg cccttggagg agaatggcag ccttttccca 35220aacagggaac cattaaagca atccatgagc acttagcatt aataccccag ttcacgaacc 35280tgagttttga gcaagagcac taggcagaat agggaaaaca gggctgcagt cctctgtcta 35340ccattaacca gcagccaggg aacagggcaa gacctttaga ctccctgggc caatctgcca 35400acagtagact cagaccagat gtggtctcat ctaatccaac ctcctcatag atgccctctg 35460agactctgca gccgtgggca caggccagga atgcctcccc caccaccaag ttaaaatcct 35520actcatttaa aaaaattcct gttcaaatgt cacctgcttt gtccggccca cctggtcact 35580ccctctacat tctacagata acctctatta gagccctcac cacgctggag tgtaatcatc 35640tgtttatgtg tctcgtctcc cagactagac tctcagcttc tcaagggtgt tgttcttgcc 35700gcactggaat ttgtacacct tgccccgaac agtgcctagc acctacaggt gctcaaagaa 35760tagaataaac gcattaatca atccctaatg tcacccccca gctctaaaat gctaggcttg 35820acattttgaa gtgcaaatga gacaatgaat gtaaaagttc ttttatttag tcgtttaata 35880atgtgcatag tacgtaccag tcactgtgac tggtgctgga gacctcaaga ttgtaaaaca 35940caatccctgc cctgctggga ccccacaact atgaaagcgt gtaaacagta tttcaagaag 36000ggcaccatta gagcctggtt ccacttctcc cctcactgac ttccttgcag ctgcagctct 36060ctgcctcttt ccccatgagc cctcaatctg tcctcaagct gcgacctctg tcccagttgg 36120caaaagtgca aaattctgaa gcaaccaccc gagcctgtcg cggacaacaa agcctgcagt 36180cccgcgcccc actacccgga cccccctccc ctgcttcggc gaatgtaaaa gtccgtctgc 36240accgaagggg atcccccctg cccagtgagc cgcggtacag tccctccaag cgccgccccg 36300ggggaagccg ggcctttact tgccgacgcc cccgctttct aaacggacct tcgggcccgc 36360tcggggagca cagagtgtac ctgcgcggcc cgctgctcct tccagtgctg catctggtcg 36420ctggcgggat cccggctgtc agccatagcg tgcggtttgc tgtgcagaac actgcaggag 36480gcctcggctc gtgggtctcc accctcagca ggcaaatctg cctgttgccc cgagtccgtg 36540gcgacttcag gctcagccaa tcagcaccac cccctcgtcc cgccccctcg ggaggactgc 36600cttctgattg gctgctcggc gctaggcagg ccaagattgg aagcccaatg ggctcggagc 36660agggctctcc gaaggaggcc tgaagaccgg agatacccag gagggtgcgg aaaggaaggg 36720tcccgctctg gcccagcaat tggagagcct cgccccgccg gcccggggtg cccgggatag 36780ccgaacccag ggcggggctc ccggttatca gcatccttca ggccgccctg ggacgcggcc 36840gttggtggcc tgccagtttt gcagacggaa tacttagacc ctgctgggtg gggccttgcg 36900ctccatagct atgctttctc agctcttaaa aagtcagcaa tcctgggtta aattactctg 36960tacaaaatta aattttgcca tacgctaatg taagtattat ttgcaaccaa aggatggatg 37020gatgcttttc tttttctttc ttagctcttc ttaacttatt cgtggattat cacttactag 37080
actagtatac taattattta atataaaaac actctgaaac gtttatctcc gtacagatgg 37140gtgttgattt cctcctttac cagagaaaaa caacttaact tagatgggaa aaatgtattc 37200ccttgtgatg ggaaaaatgt attcaactct ggtacactgc caaattggct tctttaaaca 37260ctggagaaat ctgcttcccc aaattttacc cccaggtaag caggaatttt gaaaagcttt 37320gtgtctttaa aaagctatgt tgaagagtaa aatacttagt aatatatagt acaatattta 37380gtaagttact gactagtttg tcattgtaat caaagagttt gaatgatttc tacacctcct 37440caggtgctag gatttatctt taagcacctt aatatatata catagtatat accatcatct 37500tcaaattaaa agttatcagc ttttaatttt ttccagtaca actacatata atgggtggat 37560atataatagt ggaaacttca catgttgttc ttgatcttac aaaagtatga taagaatctt 37620gggcataaaa gtggaacttt agcagttcat tggaaaagaa agccacaaat tgatctttag 37680caccctatac ttttcctata ttaaaaacaa ttataaagat gctgttggct gtgtaatttg 37740gtgtcttttt ctacctgccc gatccatact gccaagactg taaactccat gtgggtcagg 37800atcctcccat ccataattta ttgagcactt actatatacc agggactatt ctcagctttt 37860tgtatatttg cttagttaac cctcccaaca accctatgag ttagatacta atattatctt 37920cattttacag attaggaaac agaggtatag ggaggttaaa taacttgccc aaagttacac 37980agctattaag ggatagtcag gattctagct tcagctgttc atctccaaag tccacagttt 38040gttgaataaa taaatgttga aataatcgag caaatcatct tcttaactaa ccaacacaaa 38100<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ttttcaaagt tggggcattt 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3taacttgagc accgtcatgg 20
權(quán)利要求
1.一種體外檢測樣品是否存在過氧化氫酶基因CAT的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用CAT基因特異性引物擴增樣品的CAT基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性3369位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQID NO2和3的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第3369位。
4.一種檢測高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增CAT基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第3369位的擴增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第3369位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第3369位的突變限制性內(nèi)切酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性3369位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
8.一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高于正常人群。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測的是CAT的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常CAT核苷酸序列比較差異。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性3369位T→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測個體的過氧化氫酶基因CAT、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患原發(fā)性高血壓的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1661083SQ200410016608
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者金力, 黃薇, 姜正文, 王穎, 張晨輝, 李艷平, 王志敏, 肖君華, 盧大儒 申請人:復(fù)旦大學(xué), 上海人類基因組研究中心