專利名稱：過氧化氫酶基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及過氧化氫酶基因(catalase，CAT)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)及其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
高血壓是指收縮壓或舒張壓升高的一組臨床癥侯群。血壓的升高與冠心病、腎功能障礙、高血壓心臟病及高血壓并發(fā)腦卒中的發(fā)生存在明顯的因果關(guān)系。高血壓最新的診斷標(biāo)準(zhǔn)是收縮壓≥19kpa(140mmHg)或舒張壓≥12kpa(90mmHg)，符合其中一項者可確診為高血壓。
大多數(shù)的高血壓患者在血壓升高早期僅有輕微的自覺癥狀，如頭痛、頭暈、失眠、耳鳴、煩燥、工作和學(xué)習(xí)精力不易集中并容易出現(xiàn)疲勞等。隨著病情的發(fā)展，特別是出現(xiàn)并發(fā)癥時，癥狀逐漸增多并明顯，如手指麻木和僵硬、多走路時出現(xiàn)下肢疼痛，或出現(xiàn)頸背部肌肉酸痛緊張感。當(dāng)出現(xiàn)心慌、氣促、胸悶、心前區(qū)疼痛時表明心臟已受累，出現(xiàn)夜間尿頻、多尿、尿液清淡時表明腎臟受累、腎小動脈發(fā)生硬化。如果高血壓患者突然出現(xiàn)神志不清、呼吸深沉不規(guī)則、大小便失禁等提示可能發(fā)生腦出血，如果是逐漸出現(xiàn)一側(cè)肢體活動不便、麻木甚至麻痹，應(yīng)當(dāng)懷疑是否有腦血栓的形成。
高血壓早期無明顯異常體征出現(xiàn)。當(dāng)腦、心、腎等重要器官出現(xiàn)輕度損害時可有異常的體征出現(xiàn)。常見的心臟異常表現(xiàn)有心尖搏動左移、心前區(qū)有抬舉樣搏動感，聽診心尖區(qū)第一心音增強、主動脈瓣區(qū)第二心音增強且有收縮期雜音和舒張期雜音，表明已發(fā)生動脈硬化和左心室肥厚，如果在心尖區(qū)聽及奔馬樣心律可能表明有心力衰竭的出現(xiàn)。另外還常見耳垂出現(xiàn)折痕、毛細(xì)血管搏動、橈動脈出現(xiàn)硬脈或無脈及下肢間歇性跛行等。
此外，由于某些誘發(fā)因素或高血壓本身的發(fā)展，可導(dǎo)致一些高血壓患者血壓顯著或急驟升高，同時伴有腦、心、腎、視網(wǎng)膜等重要器官功能損害，嚴(yán)重危及生命，出現(xiàn)一系列臨床特殊征象，稱為高血壓急癥。高血壓急癥的發(fā)病率占高血壓人群的5％，常見有高血壓腦病、腦出血、急性左心衰竭、可樂寧急性停藥綜合征、急性心肌梗塞、急進型惡性高血壓等。
高血壓患者中約5％左右無自覺癥狀，也不知道血壓何時升高，更不知道什么時候已產(chǎn)生了血管和器官損害的并發(fā)癥，有些患者甚至在發(fā)生了心血管意外之后才知道自己患有高血壓。所以，找出高血壓發(fā)病的遺傳原因，及早的進行預(yù)防以及檢測，可以有效控制高血壓的發(fā)病，將疾病對人體的傷害減到最小。
原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)也叫高血壓病，是一種獨立的疾病，有著自己的病因、發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸的規(guī)律和臨床表現(xiàn)。臨床上主要表現(xiàn)為動脈血壓的升高。占人群高血壓患者的90％以上，目前發(fā)病機理尚未完全明了，主要依據(jù)排除了其他疾病導(dǎo)致的高血壓后才能診斷為原發(fā)性高血壓(高血壓病)。動脈血壓的升高主要是因外周小動脈阻力增高所致，同時有不同程度的血容量和心輸出量的增加。晚期常導(dǎo)致心、腦、腎等臟器受累發(fā)生高血壓心臟病、心力衰竭、腎功能障礙、腦出血等嚴(yán)重并發(fā)癥。原發(fā)性高血壓的治療主要是降低血壓同時防止并發(fā)癥的發(fā)生。原發(fā)性高血壓患者致死原因為腦血管意外、心血管意外和腎功能不全，我國以腦血管意外為多見，心力衰竭和尿毒癥次之，而歐美國家以心力衰竭多見，腦血管意外和尿毒癥次之。
原發(fā)性高血壓作為最常見的心血管疾病，其發(fā)病率逐年上升，并可引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，是腦卒中和冠心病的主要危險因素。EH是一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找EH相關(guān)基因進而闡明高血壓發(fā)病的遺傳機制已經(jīng)成為目前研究的熱點。
雖然已有許多關(guān)于各種基因多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的研究，但沒有證實CAT基因與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報道，更沒有證實CAT基因的SNP與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的報道。
綜上所述，為了最終實現(xiàn)治療高血壓，本領(lǐng)域迫切需要尋找原發(fā)性高血壓易感基因，并開發(fā)檢測原發(fā)性高血壓的方法、試劑盒，以及相關(guān)的治療藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種診斷(尤其是早期診斷)高血壓的方法及檢測試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療高血壓的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種治療高血壓的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高于正常人群。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測的是CAT的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常CAT核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性19131位G→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在過氧化氫酶基因CAT的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用CAT基因特異性引物擴增樣品的CAT基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性19131位G→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，且含有SEQ IDNO1中第19131位。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測高血壓的試劑盒，它包括特異性擴增CAT基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第19131位的擴增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第19131位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第19131位的突變限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性19131位G→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的CAT蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了CAT基因的部分SNP與高血壓密切相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能CAT的改變將導(dǎo)致高血壓，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在CAT第19131位的SNP(19131位G→C)在病例和對照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.05)，因此可作為檢測高血壓的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
CAT基因過氧化氫酶基因(catalase，CAT)的詳細(xì)序列可參見登錄號為AL035079的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO1所示。
過氧化氫酶(CAT)基因?qū)儆谝粋€結(jié)構(gòu)和功能上已經(jīng)比較清楚的過氧化物酶。1986年Quan等人分離人的這一基因并闡述了此基因的特征(Quan et al.NucleicAcids Res.145321-5335，1986.)。基因全長34Kb，由13個外顯子組成?；虍a(chǎn)物是由60Kd的四亞基組成，每個亞基包含一個高鐵血紅素基團，分子量為240Kd。過氧化氫酶能把有毒的H2O2分解成H2O和O2使細(xì)胞免受氧化壓力的毒害。這種蛋白最早從老鼠的紅細(xì)胞中被分離得到，隨后在人體內(nèi)的紅細(xì)胞也分離得到了該蛋白。過氧化氫酶和SOD以及谷胱甘肽還原酶組成了細(xì)胞內(nèi)的主要抗氧化體系。
過氧化氫酶是存在目前已知的生物體內(nèi)的廣泛存在的蛋白酶，并在肝臟，腎細(xì)胞以及紅細(xì)胞中表達豐度較高。過氧化氫酶蛋白和SOD以及谷胱甘肽還原酶共同組成了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化體系，在紅細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶發(fā)揮了主要的抗氧化作用。有研究表明，日本人的過氧化氫酶缺乏癥與紅細(xì)胞中的過氧化氫酶濃度過低有關(guān)，這種疾病紅細(xì)胞中過氧化氫酶的濃度只有正常人的0.2-4％(Ogata，M.Aatalasemia.Hum.Genet.86331-340；1991)，并且是由于剪接突變造成的(第四個內(nèi)含子的第五個堿基G→A)。匈牙利人中發(fā)現(xiàn)在上游調(diào)控區(qū)域有多態(tài)存在(-21，A→T，翻譯起始位點為1；(Goth.L et al.Electrophoresis.1997jun18(7)1105-8)。截止到目前為止關(guān)于過氧化氫酶基因還很少有大家所認(rèn)可的共同多態(tài)，大部分發(fā)現(xiàn)的是具有民族特征的多態(tài)。
多年的研究表明氧化壓力失衡會導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生如動脈粥樣硬化等以及一些老化病等(Jose M et al.，Biochemistry，32(8)，595-603，1999)。作為紅細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶，過氧化氫酶在抗氧化作用發(fā)揮了很大的作用(Gaetani GF，et al.，Blood 871595，1996)。
2000年Goth L和Eaton JW發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶缺陷會導(dǎo)致較高的糖尿病的發(fā)生(Goth et al，Lancet 2000 25；356(9244)1820-1)。
由于過氧化氫酶能夠降解有毒的H2O2避免對細(xì)胞造成氧化壓力的危害，因此作為高血壓病的候選基因在中國的隔離群體進行篩查。
本發(fā)明人對CAT基因中的幾乎整個區(qū)域進行了測序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與高血壓易感性并不相關(guān)，然而關(guān)聯(lián)研究表明19131位G→C卻是與高血壓易感性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。該SNP位于CAT的第7號內(nèi)含子中，提示對CAT的轉(zhuǎn)錄后的剪接過程有影響，進而導(dǎo)致影響過氧化氫酶的表達，并最終導(dǎo)致攜帶者的高血壓易感性明顯高于正常人群。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，CAT蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療CAT蛋白功能低下或喪失所致的疾病(如高血壓)，和用于篩選促進CAT蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。用表達的重組人CAT蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能刺激人CAT蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對人CAT DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人CAT基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人CAT基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人CAT蛋白的分子，也包括那些并不影響人CAT蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，純化的人CAT基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達人CAT蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人CAT蛋白功能的抗體以及不影響人CAT蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人CAT基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人CAT基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
抗人CAT蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人CAT蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗CAT抗體是不識別正常CAT但識別突變CAT的抗體，或者識別正常CAT但不識別突變CAT的抗體。利用這些抗體，可以方便地進行蛋白質(zhì)水平的高血壓易感性檢測。
利用本發(fā)明CAT蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與CAT蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明CAT蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑等，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的CAT多肽可直接用于疾病治療，例如，用于高血壓治療。在使用本發(fā)明CAT蛋白時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明CAT蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的CAT蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
人CAT蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的?；蛑委熂夹g(shù)可用于治療由于CAT蛋白的無表達或異常/無活性的CAT蛋白的表達所致的細(xì)胞增殖、發(fā)育或代謝異常。構(gòu)建攜帶CAT基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組人CAT基因可包裝到脂質(zhì)體中，然后再轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。
多聚核苷酸導(dǎo)入組織或細(xì)胞內(nèi)的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內(nèi)組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質(zhì)粒等)先將多聚核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植到體內(nèi)等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人CAT蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。
一種檢測檢測樣品中是否存在CAT蛋白的方法是利用CAT蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與CAT蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在CAT蛋白。
CAT蛋白的多聚核苷酸可用于CAT蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，CAT蛋白的多聚核苷酸可用于檢測CAT蛋白的表達與否或在疾病狀態(tài)下CAT蛋白的異常表達。如CAT DNA序列可用于對活檢標(biāo)本的雜交以判斷CAT蛋白的表達異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用CAT蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測CAT蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測CAT基因的突變也可用于診斷高血壓。檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。CAT蛋白突變的形式包括與正常野生型CAT DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用CAT基因特異性引物擴增樣品的CAT基因，得到擴增產(chǎn)物；然后檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性19131位G→C，其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了CAT基因的SNP與高血壓的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在19131位G→C。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對具有SEQ ID NO2和3的序列。
雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQ ID NO1中第19131位。
由于本發(fā)明的SNP與高血壓具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期較準(zhǔn)確地診斷原發(fā)性高血壓，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施(如在飲食上采取相應(yīng)控制)，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價值和社會效益。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例11.1研究對象由于血壓是多基因參與的受多種環(huán)境因素影響的數(shù)量性狀，必然在分析相關(guān)基因時要考慮遺傳異質(zhì)性的問題。選擇遺傳背景相對比較單一的隔離人群作為研究多基因疾病的材料將有助于降低遺傳異質(zhì)性的影響，同時由于這些群體具有比較固定的生活環(huán)境和較為一致的生活習(xí)慣使得環(huán)境因素的影響大大降低。選擇這樣的群體，不論是用于連鎖不平衡分析，還是從中選取家系進行家系分析，都有助于提高高血壓易感基因位點的檢測靈敏度。因此在本實施例中選定隔離群體作為研究對象(隔離群體具有遺傳背景的相對一致性，奠基者數(shù)目比較少的優(yōu)點)。
在知情同意的基礎(chǔ)上隨機收集了324個年齡在50歲以上的漢族個體，均來自于安徽省岳西縣大別山響腸鎮(zhèn)。80％的個體只有6個姓，奠基者數(shù)目應(yīng)該比較少，并且同一性別的個體來自于同一個奠基者。選用的高血壓樣本要求收縮壓不低于140mmHg，舒張壓不低于90mmHg，測量血壓兩次取平均值。
挑選其中的11％位于血壓分布的最頂端(37例個體；SBP＞178mmHg)和有7％位于血壓分布的最底端的(22個個體；SBP＜104mmHg)共59個個體，通過直接測序的方法進行SNP的檢測。
1.2實驗方法和結(jié)果1.2.1 DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴增。
1.2.2 PCR及測序引物的設(shè)計根據(jù)GenBank中CAT的基因組序列，設(shè)計和合成以下引物。具體引物如下表1所示。
表1引物序列表
1.2.3 CAT基因的PCR擴增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。
結(jié)果，獲得328bp的擴增產(chǎn)物。
1.2.4 SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP19131位G→C。
1.2.5 SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測序法進行SNP基因分型。即在高血壓病人和正常血壓對照組中進行分型和關(guān)聯(lián)分析。
等位基因的頻率統(tǒng)計出來以后進行卡方檢驗，通過對血壓最高的11％和最低的7％個體數(shù)據(jù)進行比較，初步確定是否等位基因的頻率和血壓水平連鎖。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO1中19131位的G型SNP在高血壓個體中的頻率為16.7％，而在低血壓人群中的頻率為30.5％。兩者之間的頻率差為13.8％，證實了SEQ IDNO1中19131位的G/C型SNP與高血壓的發(fā)生存在著相關(guān)性。
實施例2原發(fā)性高血壓易感性檢測試劑盒如實施例1所述，SEQ ID NO1中19131位G→C的突變與高血壓疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個突變設(shè)計CAT基因特異性引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測。
制備一試劑盒(100人次)，它含有
抽取待檢測男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將高血壓檢測試劑盒中的PCR引物稀釋到1ìmol/ìl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
或者，將擴增產(chǎn)物與正常對照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進行色譜分析，也可檢測出19131位G→C。
檢測結(jié)果，含19131位G→C的檢測對象的高血壓易感性高于正常人群。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>復(fù)旦大學(xué)上海人類基因組研究中心<120>過氧化氫酶基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性<130>040165<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38100<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1gatctcccct cctcagcctc ccaaagtgct gggcttacag gcatgaacca ccgtgcctgg60ccgaattaat gtgtttttaa accaaaatcc tgacatttat ttgaaacaaa ctaggcaatc 120cttcacagtg cttctaaaag cccagaccaa gccctccttt tagaagagca agtctcatga 180gcagcgtgag gtcagagatg atcaggtcca tgcacatttg tgtctttcca caatgtctga 240ctttcttgaa gtaatctcaa tcacaaaagc cacgagctgc acggagttcc taaggaggca 300gtttgcctca gtgcttccca tttgctcgat agtcagagct gcagtcacac aggctcaagc 360cactccacaa gtcagtcaat gtggcagatc atacataata gtatacttaa aatataaatg 420ttatagatta aacatgccac aacaaagtaa tattgaacat caaaagaaga aggataggaa 480gaaagggtta atgaatcaat tcagggagag cgactaaggc aaaaagaatc tcctggtctg 540cgccaggcag tccgagagcc ttcagtggca gatgccaggt gattatcatg attaacagca 600agatggtgta gttaagacgg ccatttcaag ctgcgcaagt cctgttcttt ttatagccac 660agtcctctag tgaggactga gagtggaaaa gtgtgcttgt tgatgtcctc atctggttgg 720atgcagtctt tatttattaa gcaaacatct tgtccctgtt cgcaaagtgc cctatgaaat 780ataagatgga gtctctaaga tggagttact tatgtcaagg ggcttgacac agcaaaagaa 840cagattttta tatattaaga gtctaatatt tacattttta gatagtggtg tggcagagtg 900taggtgaaaa acaccttttt ttttttttga gacggagtct cgctctgtca cccaggctgg 960agtgcagtgg cgcaatcggc tcactgcaac ctccgcctcc caggttcaag caattttcct 1020gcctcagcct cctgactggc tgggattact ggcgcctgcc accacgccca gctaattttt 1080ttttgtattt ttattagaga tggggtttca ccatagtggc caggctgctc ttgaactctt 1140gacctcgtga tccgcccgcc tcagccttcc aaagtgctgg cattacaggt ggcagccacc 1200gcacccagcc agaaaaacac cttttaagat gagaatgcaa gaaatgaaaa tgttatgtcc 1260acacaaaaat atgtacagaa atgttcatac cagcactatt cataatagcc aaaaagtaga 1320aacaatccaa atgtccatca aatgataaac ggataaataa aacatagtaa atccataaaa 1380tggaatatta tttggcaatt aaaaaaatga agcactcata gatgctacaa tatgtaagaa 1440tcttgaaaat attatgctaa gtgaaagaag ccagtcacaa aagaccacat actatattat 1500tccatttaaa tgaaacatgc agagtaggca aatcttagat tcatgatggc ctagggctgg 1560ggactaggtt aagaaagaaa tggagagtgg ctgctgatag gtacaggttt ccctttgggg 1620tgatgaaaat gctccaaaat tgattgtggt gatggttgcg caattctgtg aatatacaaa 1680aaaaatttac tcgtacactt taaatgggtg gtttttacgg tatgtgaatt atatctcaat 1740aaagctctta ttttaaaaaa gagagagaag aaaaaaggaa gaaggaagaa aaaaaaagga 1800
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<221>misc_feature<223>引物<400>3aatcaggcag aaacttttcc a 2權(quán)利要求
1.一種體外檢測樣品是否存在過氧化氫酶基因CAT的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用CAT基因特異性引物擴增樣品的CAT基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性19131位G→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQID NO2和3的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第19131位。
4.一種檢測高血壓的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增CAT基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第19131位的擴增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第19131位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQ ID NO1中第19131位的突變限制性內(nèi)切酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性19131位G→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO2和3的序列。
8.一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測該個體的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的CAT基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個體患高血壓的可能性高于正常人群。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測的是CAT的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常CAT核苷酸序列比較差異。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性19131位G→C；其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID NO1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測原發(fā)性高血壓易感性的方法，它包括檢測個體的過氧化氫酶基因CAT、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患原發(fā)性高血壓的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1661080SQ20041001660
公開日2005年8月31日 申請日期2004年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月27日
發(fā)明者金力, 黃薇, 姜正文, 王穎, 張晨輝, 李艷平, 王志敏, 肖君華, 盧大儒 申請人:復(fù)旦大學(xué), 上海人類基因組研究中心