專利名稱：以dna回旋酶b亞基為靶點的抗結核藥物篩選模型及應用1的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種采用草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)野生株、新生霉素特異性超敏菌株M.phlei SS12和新生霉素特異性耐藥菌株M.phlei RR11建立的以DNA回旋酶B亞基為靶點的抗結核藥物的篩選模型以及所述篩選模型用于篩選新抗結核藥物的用途。
背景技術：
結核病是一種嚴重危害人們生命健康的疾病，隨著TB化療時代的開始及生活狀況的改善，其疫情逐年下降，但近年來結核病的發病率又有明顯的回升，結核與AIDS和瘧疾并稱為傳染病的三大殺手[1]。目前，我國有4億多人口感染了結核菌，其中有10％會發病，若不采取有效措施，在未來10年可能有3000萬人發生TB[2]。耐藥TB尤其是MDR-TB快速增長，已經嚴重威脅著人類的生命健康[1，2]，要解決耐藥結核菌感染問題，必須尋找新的不同作用機制的抗結核藥物。
DNA回旋酶是細菌中特有的一種拓撲異構酶，由A亞基和B亞基組成，分別由gyrA和gyrB基因編碼[3]，天然的活性酶是由兩個A亞基和兩個B亞基組成的四聚體[4～6]。DNA回旋酶的A、B亞基都含有其特定的結構和功能區，共同決定著酶的生物學功能[7]。已知喹諾酮類和香豆素類藥物是DNA回旋酶的抑制劑，前者作用于A亞基，后者作用于B亞基。香豆素類藥物，如新生霉素，與DNA回旋酶的B亞基具有高親和性，而且只有B亞基存在新生霉素的結合位點，他們的結合使酶分子的構象發生改變，形成一種穩定的與ATP有較低親和力的構象[8]，干擾了負超螺旋反應中ATP的能量耦聯，從而抑制了DNA回旋酶的活性。香豆素類化合物在體外對回旋酶具有較好的抑制作用，但不同的側鏈可使活性相差10倍左右[9]，由于側鏈的影響，使其穿透細胞膜的能力較低，同時他們對真核系統的拓撲異構酶II和線粒體有一定的抑制作用，未能應用于臨床。但其獨特的作用機制提示我們定向篩選這類化合物，有可能得到具有獨特作用機制的新型抗結核藥物。
由于DNA回旋酶的測定方法中對反應條件及測定樣品純度要求較高，大量發酵液樣品的測定需要輔之以簡便方法。本發明人成功的們建立了以草分枝桿菌野生株及其對新生霉素特異性超敏感株和耐藥株來共同檢測微生物代謝產物活性的篩選模型，根據這些檢定菌的活性差異，篩選出作用于B亞基的DNA回旋酶抑制劑。這類藥物與目前廣泛應用的抗結核藥物作用機制不同，并且能夠克服喹諾酮耐藥，具有較好的應用前景。
發明內容
1 材料和方法1.1 菌株檢定用菌株Mycobacterium phlei由中國藥品生物制品檢定所醫學細菌菌種保藏中心購得。臘樣桿菌、枯草桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌FDA209P、藤黃八疊球菌、大腸桿菌O-111、克氏肺炎球菌、變形桿菌OX-19、白色念珠菌、黑曲霉菌及日本清酒酵母(Sake)為本室保存。
篩選用菌株由本所篩選中心提供。
1.2 培養基125駱文氏雞蛋斜面培養基(1000ml)新鮮雞蛋(15-16個)625ml，2％孔雀綠液10ml，MgSO4·7H2O 0.375g，KH2PO4 1.5g，天冬素2.25g，甘油7.5ml，土豆粉18.8g，蒸餾水375ml。
檢定用培養基蛋白胨0.5％，牛肉膏0.3％，瓊脂1.2％，pH7.0～7.4。
放線菌發酵用培養基H1葡萄糖0.5％，麥芽膏1％，酵母浸膏粉0.4％，棉籽餅粉1％，CaCO3 0.3％，pH7.2～7.4。
真菌發酵用培養基H甘油1％，KH2PO4 0.03％，葡萄糖2％，蔗糖1％，黃豆粉0.2％，聚乙二醇6000 0.25％，NaNO3 0.3％，蛋白胨1％，(NH4)2SO4 0.03％，pH6.01.3 生化試劑和藥品山梨醇(EEC公司)；麥芽浸出粉、酵母浸出粉、Polypepton、胰化蛋白胨(OXIOD公司)；甘油(日本和光純藥株式會社)；VitaminB(Sigma公司)；聚乙二醇6000(上海化學試劑廠進口分裝)。
Novobiocin、Tetracycline、Vancomycin(Sigma公司)；PenicillinG(Merck公司)；Streptomycin Sulfate、Ampicillin(華北制藥廠)；Neomycin、Cephalothin(中國藥品生物制品檢定所)、NorcardicinA(Fujusawa公司)、Nalidixic acid(Fluka公司)、Isoniazid(北京結核病防治所)、Norfloxacin(本所合成室提供)。
1.4 新生霉素特異性敏感和耐藥突變株的誘變與篩選[10，11]將用NTG溶液和紫外線處理的M.phlei菌液進行適當的稀釋，吸取0.1ml涂布到營養肉湯瓊脂培養基平板上(每平板細菌數為100-200個)，37℃培養3天，計算殺菌率。并將長出的菌落依次接種到不含新生霉素及分別含有10μg/ml和2μg/ml新生霉素的平板上(野生型M.phlei的MIC為6μg/ml)，37℃培養。選出在不含有新生霉素的平板上生長，在含有2μg/ml新生霉素的平板上不生長的菌株，即為敏感菌株；在含有10μg/ml新生霉素的平板上都能夠生長的菌株即為耐藥株。
1.5 模型的建立用出發菌株M.phlei，超敏菌株M.phlei SS12，耐藥菌株M.phleiRR11作為檢定菌，建立篩選模型，對微生物發酵液進行初步篩選。其中，符合第一和第二組情況的可能為新生霉素一類的作用于B亞基的DNA回旋酶抑制劑；第三組可能為非新生霉素類的DNA回旋酶抑制劑。第四組對三株檢定菌都有活性，但活性沒有差異，可能為其它作用機制的抗分枝桿菌的化合物。
表1 采用本發明所述篩選模型的檢測結果測試菌株組別M. M.phlei M.phleiphleiSS12 RR11I-+-II +++ -III +++ ±～+IV +++模型的使用方法將分離得到的放線菌和真菌用各自的發酵培養基進行發酵，用出發菌株M.phlei，超敏菌株M.phlei SS12，耐藥菌株M.phlei RR11作為檢定菌，檢測其120小時的發酵液上清液的活性。方法是將出發菌株M.phlei，超敏菌株M.phlei SS12，耐藥菌株M.phlei RR11分別接種于含有甘油培養基的試管中，震蕩培養48小時，得到用于檢測的檢定菌培養液備用；各自取1ml制備好的檢定菌液，加入到100ml檢定培養中，制備成分別含1％發菌株M.phlei、超敏菌株M.phlei SS12、耐藥菌株M.phlei RR11的檢定菌培養基的平板；用8mm直徑的紙片浸取發酵液上清液，置于含有不同檢定菌的平板上，37℃培養48小時，測定其活性。判定標準為其中符合表中第I、II、III組情況的即為可能含有DNA回旋酶B亞基抑制劑的發酵液；符合第IV組情況的為可能含有其它作用機制但能有效抗分枝桿菌的抑制劑的發酵液。表中的+、分別表示對檢定菌的作用情況±，表示有微弱的活性，抑菌圈直徑＜10mm；+，表示有明顯的活性，抑菌圈直徑10～15mm；++表示有較強的活性，抑菌圈直徑＞15mm；表示沒有活性。
1.6 模型的可行性驗證采用紙片法，測定不同作用機制的藥物對出發菌株M.phlei，超敏菌株M.phlei SS12，耐藥菌株M.phlei RR11的作用。用紙片浸取一定濃度的藥液，放于分別含有1％三種不同菌液的平板上，37℃培養，測定抑菌圈的直徑，以檢測超敏菌株M.phlei SS12和耐藥菌株M.phlei RR11對新生霉素是否具有特異性，由此可確定其作為初篩方法用于篩選以DNA回旋酶B亞基為靶點的抗結核藥物的可行性。
1.7 真菌及放線菌發酵液的初篩應用建立的模型對微生物發酵液的進行初步篩選。將真菌接種于發酵培養基H中，28℃振蕩培養4天；放線菌接種于H1發酵培養基，28℃振蕩培養4天。用三種檢定菌測定其活性，篩選可能作用于DNA回旋酶B亞基的活性物質。
2 結果2.1 突變菌株的篩選結果用1000μg/ml的NTG溶液處理103倍稀釋的M.phlei菌液30分鐘，使其殺菌率達到98.7％(此條件下NTG具有高誘變率)，篩選得到新生霉素特異性超敏感菌株M.phlei S1和耐藥菌株M.phleiR1，MIC值分別為2μg/ml和25μg/ml。
將M.phlei S1和M.phlei R1在30W紫外燈，燈距30cm，照射時間為20秒的條件下處理，使其殺菌率分別為49.3％和44.7％(此條件下紫外線具有高誘變率)，得到新生霉素特異性超敏菌株M.phlei SS11、M.phlei SS12、M.phlei SS13和耐藥菌株M.phlei R11、M.phlei R12、M.phlei R13、M.phlei R14，新生霉素對各菌株的MIC值及抑菌圈的大小見表2和表3。
出發菌株M.phlei的MIC值為6μg/ml，經過誘變篩選到的超敏菌株M.phlei SS11-SS13，其MIC值均有不同程度的下降，其中SS12在0.4μg/ml左右，敏感性提高了15倍；耐藥菌株的MIC值均有不同程度的上升，其中M.phlei RR12、RR14的MIC值在100μg/ml左右，M.phlei RR11的MIC值大于100μg/ml，耐藥性提高了20倍左右。選定M.phlei SS12和M.phlei RR11作為初篩的檢定菌，二者對新生霉素的敏感性相差200多倍。
表2.突變菌株與親本株對新生霉素的MIC比較
表3.突變菌株對新生霉素的敏感性
2.2 各種抗生素對出發菌株M.phlei，超敏菌株M.phlei SS12和耐藥菌株M.phlei RR11的抑制作用表4.多種不同抗生素對突變株和親本株的作用直徑(mm)濃度抗生素M.phlei(μg/ml) M.phlei M.phlei SS12RR11新生霉素 100 28.7 35.6 -青霉素G 200 -- -四環素 2020.0 18.4 21.3萬古霉素 100 16.8 18.8 18.4硫酸鏈霉素 2022.3 23.6 21.5氨芐青霉200 -- -素新霉素 2019.5 19.6 20.2頭孢菌素 200 -- -Norcardici200 -- -nANorfloxaci2023.1 23.7 25.4nNalidixic2020.3 21.6 22.0
acidIsoniazid1022.121.423.6由表4可以看出，100μg/ml的新生霉素在耐藥菌株M.phlei RR11的檢定培養基平板上無抑菌圈的出現，而在同樣的條件下，對超敏菌株M.phlei SS12的抑菌圈可達35.6mm二者差異非常顯著。而其它作用機制的抗生素對超敏菌株和耐藥菌株的抑菌圈沒有明顯的差異。尤其是，作用于DNA回旋酶A亞基的喹諾同類藥物萘啶酸和氟哌酸對三種檢定菌的作用效果沒有差異，排除了突變位于A亞基的可能。由此可見，M.phlei SS12對新生霉素的敏感具有特異性，M.phlei RR11對新生霉素則特異性耐藥。因此，以出發菌株M.phlei，超敏菌株M.phlei SS12和耐藥菌株M.phlei RR11作為檢定菌進行定向篩選作用于DNA回旋酶B亞基抑制劑是可行的。
2.3 初篩結果應用該模型對1600株真菌和100株放線菌發酵液的進行了初篩，得到符合表1中I、II、III組篩選要求的菌株共有38株，陽性率為2.4％。經過重復發酵測定，只有X-1787，X-2118，3277，3502，3993的活性比較穩定，復篩陽性率為0.3％。其中，X-1787，X-2118，3993只對超敏菌株有作用，可能產生新生霉素一類的作用于B亞基的DNA回旋酶抑制劑；3502和3277對三者都有作用，但活性有明顯的差異，可能為非新生霉素類的DNA回旋酶抑制劑。將3277和3502分別稀釋10倍后，對超敏菌株仍有活性，因此我們選定活性最強、活性成分含量最高，有可能產生作用于DNA回旋酶B亞基的抗結核藥物的菌株3277做進一步的研究，對其活性成分進行了初步分離，得到了X1和X2兩個活性化合物，根據二者的分子量和特征性紫外吸收，經MPMS數據庫及PubMed聯機檢索，確定X1，X2可能為新化合物。
表5.陽性發酵液測試菌株的活性發酵液 測試菌株
M.phleiM.phlei SS12M.phlei RR11X-1787 - 16.4-X-2118 - 18.1-3277 29.7 32.324.5稀釋的3277 - 20.6-3502 25.6 27.820.6稀釋的3502 - 14.3-3993 - 16.0-3 討論本實驗采用草分枝桿菌野生株、對新生霉素特異性超敏感株和耐藥株三個菌來檢測發酵液活性超敏菌株可檢測出含量較低的小組份，超敏菌株與野生株的活性差異可排除其它作用機制的藥物，獲得與新生霉素作用機制相同的活性化合物；若同時對耐藥株有活性，則有可能是香豆素類以外的作用于B亞基的藥物。
分枝桿菌細胞壁不同于普通革蘭氏陽性細菌的肽聚糖結構，在體外以酶為靶點篩選到的很多有效的藥物往往不能進入細胞，從而顯示不出抗結核活性。而且許多藥物也是在全細胞內才有作用，或者受到體內某些酶的活化(Isoniazid)，或者是受到細胞內特定的生理環境的影響(Pyrazinamide)。正是由于分枝桿菌細胞壁及體內生理生化的特異性，為了篩選到能進入細胞并在胞內有抗結核活性的藥物，我們沒有在蛋白質水平上直接尋找酶抑制劑，而是選擇建立細胞水平的模型。
通過超敏菌株和耐藥菌株對各種抗生素敏感性的分析，確定了初篩模型的可行性，利用此模型得到了陽性菌株。并對陽性菌株3277的活性成分進行了初步分離提取和純化，得到了兩個可能與新生霉素作用機制相同的抗結核化合物X1和X2。它們在抗結核方面顯示了較強的作用，進一步的研究其確定其分子結構和作用機制將是非常有意義的。
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1.一種以DNA回旋酶B亞基為靶點的抗結核藥物篩選模型，其特征在于采用Mycobacterium phlei野生株、新生霉素特異性超敏菌株M.phlei SS12和新生霉素特異性耐藥菌株M.phlei RR11進行篩選。
2.權利要求1所述抗結核藥物篩選模型用于篩選新型抗結核藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種采用Mycobacterium phlei野生株、新生霉素特異性超敏菌株M.phlei SS12和新生霉素特異性耐藥菌株M.phlei RR11建立的以DNA回旋酶B亞基為靶點的抗結核藥物的篩選模型以及所述篩選模型用于篩選新抗結核藥物的用途。
文檔編號C12Q1/68GK1651578SQ20041000118
公開日2005年8月10日 申請日期2004年2月4日 優先權日2004年2月4日
發明者肖春玲, 張明, 姚天爵, 余利巖, 司書毅 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所