專利名稱：周期浸沒氣升式的植物細胞培養方法及其培養裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中使用生物反應器進行植物細胞的規模化培養，特別涉及一種周期浸沒氣升式的植物細胞培養方法及其培養裝置。
背景技術：
植物細胞、組織、器官大規模培養技術是生產有用次生代謝產物的一條有效途徑，近年來已取得了很大的發展。用于植物細胞、組織、器官培養的生物反應器是從培養微生物細胞的反應器改進、發展而來的，但具有適應植物細胞生長的獨特的特點，主要分為機械攪拌生物反應器、非機械攪拌生物反應器、鼓泡塔及氣升式生物反應器、填充床生物反應器、流化床生物反應器，膜生物反應器等。由于植物細胞的固有性質，如細胞容易聚集、易分化，細胞的脆弱性、代謝途徑和代謝產物形成與細胞生長的復雜性等，選擇合適的反應器構型及操作方法極大地關系到植物細胞的代謝產物合成。如日本的三井石油化學公司采用750L攪拌式反應器二步法培養紫草細胞，實現紫草寧的工業化生產(Noguchi et al.，Plant tissue culture and itsbiotechnological application，1977，pp.85.)。德國建立了75L、750L、7500L、15000L和75000L系列攪拌式生物反應器組成的植物細胞培養工廠，并利用這些反應器培養紫松果菊(Echinaceapurpurea)細胞，生產免疫活性多糖(Mavituna F，Recent advancesin biotechnology，1992，pp.209-226)。
對于植物組織和器官的大規模培養，如叢生芽、毛狀根、體胚及幼苗等，由于這些器官和組織體積大、形態特殊、在培養過程中流動性差、易堆積、對剪切力更為敏感以及長期浸泡更易產生玻璃化和變異等，國內外科研人員根據培養對象的不同采用了多種不同類型的生物反應器進行植物組織和器官的培養，如Rodrigueg-Mendiola等報道了一種9立升的植物毛狀根培養反應器(M.A.Rodrigueg-Mendiol et al.，Bioreactors for growth of plant roots，Enzyme Microb.Technol.1991，Vol.13，pp.697-702)，此反應器部分解決了毛狀根的接種及堆積問題，但未根本解決接種的均勻性，從而影響了混合特性和傳質、傳熱過程，而且該反應器為全浸沒式，易造成培養物的玻璃化和變異。針對植物細胞、組織和器官生長代謝特性，本申請人的一種氣升式周期浸沒光照植物細胞組織器官培養反應器(1999年11月13日授權，專利號為98205797.0)，該反應器主要由反應器主體、篩板隔板、接種管、氣體分布器、光源、儲液槽、電磁閥、氣液循環管和氣液分配管組成，是一種適于大規模培養的生物反應器，可以實現植物組織和器官培養的均勻接種、克服植物組織器官長期浸沒產生的玻璃化和變異現象，反應器內培養物供養充分，還可以實現氣液交替半浸沒周期、光照周期的調節和控制，具有良好的混合、傳質、傳熱特性，但是，這種生物反應器更適于植物的組織和器官的培養，如不易流動的叢生芽、毛狀根、苗等，對于某些需要控制細胞聚集體大小以及需要固定化和懸浮培養相結合的植物細胞，則有不能同時實現固定和總體循環流動的缺點。
發明內容
本發明的目的是克服現有的植物細胞組織器官培養反應器僅適于植物的組織和器官的培養，不能控制細胞聚集體的大小、存在的次生代謝產物產量低的缺點，以及現有反應器過于復雜的問題，從而提供一種周期浸沒氣升式的植物細胞培養方法及其反應器，以適于大規模地培養植物細胞。
本發明的技術方案如下本發明提供的植物細胞的周期浸沒氣升式培養方法，其步驟如下1)將植物細胞置入滅菌后的透明反應器主體中的多層可轉動篩板上；2)對植物細胞周期性交替地進行培養液全浸沒的循環懸浮培養和培養液非浸沒的固態培養，直至培養完成；所述的培養液全浸沒的循環懸浮培養為在植物細胞處于培養液全浸沒的狀態下，轉動可轉動篩板使其與水平面呈45°-75°角，此時，篩板上的植物細胞懸浮在培養液中，在來自反應器主體底部氣體分布器氣體的吹動下進行培養液全浸沒的循環懸浮培養1-8小時；所述的培養液非浸沒的固態培養為將篩板轉動并固定至水平位置的同時，將培養液從反應器主體的底部放入位于其下方的儲液罐中，此時，植物細胞下落到呈水平態的可轉動篩板上進行培養液非浸沒的固態培養10-60分鐘；所述周期性交替進行的培養液全浸沒的循環懸浮和培養液非浸沒的固態培養在位于培養器主體外圍的外置光源的光照下進行，其光照強度為1000-4000Lux，光照時間為每天8-24小時。
本發明提供的植物細胞的周期浸沒氣升式培養裝置，包括一透明材料制造的反應器主體，其上的補液口通過一閥門與一補液罐相連通，反應器主體內底部安裝一與氣源相通的氣體分布器，反應器主體的下方設置一與反應器主體底部相通的儲液罐，該儲液罐與氣源相通，其特征在于，還包括安裝在反應器主體內的可在與水平面呈45°-75°角范圍內進行轉動的篩板；反應器主體內還可安裝一篩板支撐架，所述的篩板通過支撐軸固定在篩板支撐架上，篩板繞支撐軸在與水平面呈45°-75°角范圍內轉動；一端部穿出反應器主體頂蓋的拉桿與所述篩板的外邊緣固定，伸出反應器主體外的拉桿端部與使拉桿做上下運動的手柄相連；所述伸出反應器主體外的拉桿端部與使拉桿做上下運動的電磁拉桿裝置相連，所述電磁拉桿裝置由線圈內放置一電磁拉桿后密封而成，所述拉桿的端部與電磁拉桿固定在一起，所述線圈與一時間控制儀相連，經時間控制儀控制即可實現多層篩板的周期性自動轉動。電磁拉桿裝置的頂部設置有排氣管，以利于電磁拉桿主體的散熱及斷電后瞬時磁場的快速消除，保證篩板的快速回落；所述儲液罐與氣源之間的連通管道上安裝一與時間控制儀電連接的電磁閥，儲液罐進氣口和反應器主體空氣出口的連通管道上安裝一與時間控制儀電連接的電磁閥，兩電磁閥的開/閉狀態相反，以實現培養液的全浸沒液體培養與非浸沒固態培養交替進行；還可在所述反應器主體的周圍均勻分布有外置光源，其光照強度為1000-4000Lux；在所述儲液罐的四周套裝一恒溫水夾套，用以調控培養液的溫度；在所述的儲液罐上設置取樣口，可隨時測定培養液的pH、各種營養物質的含量，對反應器主體內的培養情況進行監控。
本發明的優點在于本發明的周期浸沒氣升式的植物細胞培養方法及其反應器，可實現多植物細胞進行周期性浸沒、通氣、周期性光照，更適于植物細胞生長的特點和生物節律，各層篩板周期性的自動轉動使細胞周期循環，保證浸沒培養期的細胞均勻懸浮于整個反應器內，細胞獲得充分的營養，而且，循環時適宜的剪切力作用，可以抑制細胞聚集體過度增大；非浸沒培養期的細胞則可均勻附著于各層篩板上，有利于細胞聚集體長大。本發明實現了細胞固定化和懸浮循環培養的交替進行，對細胞聚集體可以進行有效調控，使聚集體大小控制在一定范圍內，這有利于細胞間的生物信息傳遞和營養物質包括氧和二氧化碳的傳遞，該反應器有利于細胞的生長與代謝，具有優良的混合、傳質、傳熱特性。
圖1為本發明的培養裝置的結構示意圖；圖2為使用本發明的培養裝置和培養方法對植物細胞進行培養時，植物細胞處于培養液全浸沒循環懸浮培養期時的細胞聚集體流動示意圖；圖3為電磁拉桿裝置結構示意圖；其中反應器主體1篩板架2氣體分布器3接種口4通氣口5拉桿6排氣管7補液罐8空氣出口9第一電磁閥10 儲液罐11 輸液管12儲液罐進氣口13 恒溫水夾套14 膜式空氣過濾器15a膜式空氣過濾器15b 第二電磁閥16 氣體流量計17a氣體流量計17b 進氣分流管18 空氣過濾柱19儲氣罐20 取樣口21 外置光源22時間控制儀23 蒸汽進口24 硅膠片25線圈26 電磁拉桿27 電磁拉桿裝置28具體實施方式
實施例1本實施例的2L體積的植物細胞的周期浸沒氣升式培養裝置，結構如圖1，由圖1可知，培養裝置包括一透明材料制造的反應器主體1，其上的補液口通過一閥門與一補液罐8相連通，反應器主體1內底部安裝一與氣源20相通的氣體分布器3，反應器主體1的下方設置一與反應器主體底部相通的儲液罐11，該儲液罐11與氣源20相通，在反應器主體1內的可在與水平面呈60°范圍內進行轉動的2層篩板；所述的篩板可通過支撐軸固定在篩板支撐架2上，再將篩板支撐架2用硅膠片25安裝在反應器主體1內，篩板也可以其它方式轉動固定；一端部穿出反應器主體1頂蓋的拉桿6與所述篩板的外邊緣固定，伸出反應器主體1外的拉桿6的端部與使拉桿6做上下運動的電磁拉桿裝置28相連，其結構為伸出反應器主體1外的拉桿端部與固定在一置于線圈26內的電磁拉桿27上，該線圈26連接一時間控制儀23，在電磁拉桿裝置28主體的頂部還設有排氣管7；所述儲液罐11與氣源20之間的連通管道上安裝一與時間控制儀23電連接的第二電磁閥16，儲液罐進氣口13和反應器主體空氣出口9的連通管道上安裝一與時間控制儀電連接的第一電磁閥10，兩電磁閥的開/閉狀態相反；所述反應器主體1的周圍均勻分布有外置光源22(管狀熒光燈)，其光照強度為1000Lux。所述儲液罐11的四周套裝一恒溫水夾套14；氣體分布器3與外部的空氣壓縮機相連，其連接管道上安裝有膜式空氣過濾器15a、氣體流量計17a、進氣分流管18、空氣過濾柱19和儲氣罐20；在反應器主體1的下方放置儲液罐11，并用一輸液管12連通儲液罐11和反應器主體1的底部，儲液罐11頂部的進氣口13通過一根進氣管連接到膜式空氣過濾器15b上后，通過第二電磁閥16和氣體流量計17b與進氣系統相連，在進氣口13管路上接出的另一根通氣管通過第一電磁閥10與反應器主體法蘭蓋上的通氣口9相連，兩個電磁閥及線圈26與時間控制儀23相連，以實現培養液的浸沒與非浸沒交替循環以及多層篩板的周期自動轉動。
實施例2用實施例1的培養裝置和本發明的培養方法對植物細胞(水母雪蓮)進行培養在無菌環境下將植物細胞(水母雪蓮)加入反應器主體1中的各層篩板上，并交替進行培養液的全浸沒循環培養和非浸沒固態培養，其具體操作步驟如下首先，將線圈26取下，再將整個反應器系統放到蒸汽消毒鍋中用高溫蒸汽滅菌，滅菌后，待培養液溫度降至室溫后，將反應器系統取出，在培養室內安裝好，并裝上線圈26；然后，電磁閥10與電磁閥11同時斷電，上液時，電磁閥10為關閉狀態，電磁閥11為打開狀態，打開氣體流量計17b，將培養液由儲液罐壓入反應器主體1中，打開接種口4封帽，在無菌環境下將植物細胞(水母雪蓮)加入反應器主體1中的各層篩板上，蓋好封帽，植物細胞浸沒在液體培養基中；同時，線圈26通電數分鐘，拉動拉桿，使各層篩板與水平方向成一定角度，再打開氣體流量計17a通入無菌空氣，植物細胞在反應器主體1內進行培養液的全浸沒循環懸浮培養，其培養時間見表1；此時，植物細胞在反應器主體1內進行培養液的全浸沒循環懸浮培養期的細胞聚集體流動狀態如圖2所示。
全浸沒循環培養之后，將線圈26斷電，各層篩板落下成水平態；第一電磁閥10與第二電磁閥16同時通電，此時第一電磁閥10為打開狀態，第二電磁閥16為關閉狀態，培養液從反應器主體1回落到儲液罐11中，植物細胞下落到各層篩板上，進行培養液的非浸沒固態培養，其培養時間見表1；將上述的培養液的全浸沒循環懸浮培養和培養液的非浸沒固態培養交替進行若干次，直至培養完成；第一電磁閥10與第二電磁閥16同時通電、斷電，實現培養液在反應器主體與儲液罐之間的周期循環，簡化了原有的采用4個電磁閥的反應器裝置。電磁拉桿裝置28、第一電磁閥10和第二電磁閥16的開關均可以由時間控制儀23自動控制。
本實施例還可將一個恒溫水夾14環繞在儲液罐上，培養過程中由恒溫水夾套14控制培養液溫度，間隔一定時間從儲液罐取樣口21處取少量的培養液，測定培養液的pH、殘糖濃度、碳源、氮源消耗、各種營養鹽離子濃度，以對反應器主體1內的培養情況進行監控。
本實施例中，各層篩板均由10目的不銹鋼網固定在不銹鋼圈制作的篩板支撐架上后轉動固定在篩板架上的轉動軸上，各層篩板間及篩板與反應器頂部與底部間均有一定間距，10目的不銹鋼網可保證培養液內氣泡的自由通過，培養裝置具有良好的混合傳質特性。使篩板繞軸轉動的轉動裝置不僅僅限于本發明涉及的拉桿轉動裝置，還會有許多使篩板轉動一定角度的裝置，這屬于本專業技術人員應知應會。
表1為本實施例所采用培養參數
上述實驗結果表明，在全浸沒循環培養時間為8小時，非浸沒固態培養時間為15分鐘時，細胞聚集體大小合適，細胞生物量高達10.4克/每升(干重)，細胞的黃酮含量可達4.8％，黃酮產量可達0.5克/每升。
實施例3制備一50L的多層自動轉動篩板的周期浸沒氣升式植物細胞培養反應器，如圖1所示，將具有5層不銹鋼篩板的篩板架沿軸向同軸固定在反應器主體1中心，儲液罐11側壁底部增設一蒸汽進口24，其它與實施例1的2L反應器結構相同。
用實施例2所述的50L多層自動轉動篩板的周期浸沒氣升式植物細胞培養反應器培養植物細胞時，其培養方法與實施例1基本相同。不過在反應器系統滅菌過程中，使蒸汽發生器產生的121℃蒸汽從增設的儲液罐蒸汽進口24進入，從反應器主體1的通氣口5排出進行原位滅菌。培養液滅菌后即打開氣體流量計17b，將培養液由儲液罐11壓入反應器主體1，經氣體流量計17a通入少量無菌空氣進行保護，待培養液溫度降至室溫后打開接種口4封帽，在無菌環境下將培養物種子加入，蓋好封帽，通入無菌空氣進行培養。培養過程中間隔一定時間從儲液罐取樣口21處取少量的培養液，測定培養液的各種理化參數，對反應器主體內的培養情況進行監控。
其步驟如下原位滅菌后，把儲液罐中的培養液壓入反應器主體中，拉動拉桿帶動固定在拉桿上的篩板使得篩板和水平方向成75°角，篩板上的植物細胞培養物浸沒在培養液中，在氣體分布器3通入的無菌空氣的作用下循環流動，浸沒培養1或8小時；再拉動拉桿使得篩板回復到水平位置，再將反應器中的培養液下到儲液罐中，植物細胞培養物落到篩板上后，非浸沒培養10或60分鐘；重復浸沒培養和非浸沒培養，直到培養工作完成。
本實施例中，如圖3所示，電磁拉桿27置于一線圈26內，通電后，線圈26控制電磁拉桿27做上下運動，帶動與之相連的拉桿6控制篩板轉動；線圈26還連接到時間控制儀23上，通過時間控制儀23控制篩板的自動轉動，線圈26帶電，在電磁場的作用下，電磁拉桿27向上運動一段距離，通過反應器主體1內的拉桿6帶動篩板轉動；時間控制儀斷電時，線圈26斷電，磁場消失，電磁拉桿27下落回復到自然狀態，反應器主體1內的篩板也隨之回落到水平位置。在電磁拉桿裝置頂部設置一排氣管，以有利于電磁拉桿主體的散熱及斷電后瞬時磁場的快速消除，保證篩板的可快速回落到水平位置。
作為本發明植物細胞培養方法的另一種改進，通過一外置光源對培養物植物細胞進行光照，光照時間為8-24小時，光照強度為1000-4000Lux；還可將外置光源22連接到一時間控制儀23上，通過時間控制儀23控制光照時間。
表2為本實施例所采用培養參數
比較實施例2的結果可知，隨著反應器體積的增大，篩板轉動時對細胞的不利影響減小，培養的效果還會進一步提高。
總之，本發明的周期浸沒氣升式的植物細胞培養方法及其反應器，可實現植物細胞進行周期性浸沒、通氣、周期性光照，特別是對于某些需要控制細胞聚集體大小以及需要固定化和懸浮培養相結合培養的植物細胞，采用本發明所提供的方法和裝置，更加有利于細胞間的生物信息傳遞和營養物質包括氧和二氧化碳的傳遞，有利于細胞的生長與代謝，具有優良的混合、傳質、傳熱特性。
權利要求
1.一種植物細胞的周期浸沒氣升式培養方法，其步驟如下1)將植物細胞置入滅菌后的透明反應器主體中的多層可轉動篩板上；2)對植物細胞周期性交替地進行培養液全浸沒的循環懸浮培養和培養液非浸沒的固態培養，直至培養完成；所述的培養液全浸沒的循環懸浮培養為在植物細胞處于培養液全浸沒的狀態下，轉動可轉動篩板使其與水平面呈45°-75°角，此時，篩板上的植物細胞懸浮在培養液中，在來自反應器主體底部氣體分布器氣體的吹動下進行培養液全浸沒的循環懸浮培養1-8小時；所述的培養液非浸沒的固態培養為將篩板轉動并固定至水平位置的同時，將培養液從反應器主體的底部放入位于其下方的儲液罐中，此時，植物細胞下落到呈水平態的可轉動篩板上進行培養液非浸沒的固態培養10-60分鐘。
2.按權利要求1所述的植物細胞的周期浸沒氣升式培養方法，其特征在于，所述周期性交替進行的培養液全浸沒的循環懸浮和培養液非浸沒的固態培養在位于培養器主體外圍的外置光源的光照下進行，其光照強度為1000-4000Lux，光照時間為每天8-24小時。
3.一種植物細胞的周期浸沒氣升式培養裝置，包括一透明材料制造的反應器主體，其上的補液口通過一閥門與一補液罐相連通，反應器主體內底部安裝一與氣源相通的氣體分布器，反應器主體的下方設置一與反應器主體底部相通的儲液罐，該儲液罐與氣源相通，其特征在于，還包括安裝在反應器主體內的可在與水平面呈45°-75°角范圍內進行轉動的篩板。
4.按權利要求3所述的植物細胞的周期浸沒氣升式培養裝置，其特征在于，反應器主體內安裝一篩板支撐架，所述的篩板通過支撐軸固定在篩板支撐架上，篩板繞支撐軸在與水平面呈45°-75°角范圍內轉動。
5.按權利要求4所述的植物細胞的周期浸沒氣升式培養裝置，其特征在于，一端部穿出反應器主體頂蓋的拉桿與所述篩板的外邊緣固定，伸出反應器主體外的拉桿端部與使拉桿做上下運動的手柄相連。
6.按權利要求4所述的植物細胞的周期浸沒氣升式培養裝置，其特征在于，一端部穿出反應器主體頂蓋的拉桿與所述篩板的外邊緣固定，伸出反應器主體外的拉桿端部與使拉桿做上下運動的電磁拉桿裝置相連，所述電磁拉桿裝置由線圈內放置一電磁拉桿后密封而成，所述拉桿的端部與電磁拉桿固定在一起，所述線圈與一時間控制儀相連。
7.按權利要求6所述的周期浸沒氣升式植物細胞培養反應器，其特征在于，所述電磁拉桿裝置的頂部設置有排氣管。
8.按權利要求3所述的周期浸沒氣升式植物細胞培養反應器，其特征在于，所述儲液罐與氣源之間的連通管道上安裝一與時間控制儀電連接的電磁閥，儲液罐進氣口和反應器主體空氣出口的連通管道上安裝一與時間控制儀電連接的電磁閥，兩電磁閥的開/閉狀態相反。
9.按權利要求3所述的周期浸沒氣升式植物細胞培養反應器，其特征在于，所述反應器主體的周圍均勻分布有外置光源，其光照強度為1000-4000Lux。
10.按權利要求3所述的周期浸沒氣升式植物細胞培養反應器，其特征在于，所述儲液罐的四周套裝一恒溫水夾套。
全文摘要
本發明的周期浸沒氣升式的植物細胞培養方法及裝置，將植物細胞置于反應器中的多層可轉動篩板上，篩板轉動一角度時，細胞處于培養液全浸沒的循環懸浮培養期；篩板回落成水平態時放掉培養液，細胞處于培養液非浸沒的固態培養期，兩種培養期周期交替進行直至完成培養。通過拉桿將各篩板串聯固定在電磁拉桿裝置的電磁拉桿上，時間控制儀控制篩板的周期性轉動和回落；電磁閥控制培養液對細胞的浸沒與非浸沒的交替和通氣及光照的自動控制；其優點在于實現了細胞固定化和懸浮循環培養的交替進行，有效調控細胞聚集體，使聚集體大小得以控制，有利于細胞間的生物信息傳遞和營養物質的傳遞，適宜細胞的生長與代謝，具有優良的混合、傳質、傳熱特性。
文檔編號C12N5/04GK1648240SQ20041000079
公開日2005年8月3日 申請日期2004年1月20日 優先權日2004年1月20日
發明者王玉春, 袁曉凡, 趙兵, 王曉東 申請人:中國科學院過程工程研究所