用于免疫治療的基于酵母的疫苗的制作方法

專利名稱：用于免疫治療的基于酵母的疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有異源抗原的基于酵母的疫苗在誘發體液免疫和細胞免疫，和一方面預防和治療多種動物癌癥中的用途。
背景技術：
導致新的、異常生長的瘤形成或快速細胞增殖過程是許多疾病的特征，這些疾病可能是嚴重的，并且有時是威脅生命的。通常，細胞和組織的瘤性生長以高于細胞的正常增殖為特征，其中即使誘發(instigating)因子(例如，腫瘤啟動子，致癌原，病毒)不再存在之后，細胞仍然繼續生長。細胞生長往往顯示出結構上缺乏組織和/或缺乏與正常組織的協調，并且通常產生一團可能是良性或惡性的組織(例如，腫瘤)。惡性細胞生長，或惡性腫瘤是世界范圍內死亡的最主要的原因，研發腫瘤性疾病的有效治療方法是大體研究的課題。雖然已經提出了多種治療和預防癌癥的創新方法，很多癌癥仍然具有高死亡率，并且可能難以治療或者對于常規療法相對無反應。
例如，肺癌是美國第二種最普遍的癌癥形式，占全部癌癥的15％和全部癌癥死亡數的28％。2002年，估計將診斷出177,000例肺癌新增病例，166,000人將死亡，死亡率高于結腸直腸癌、前列腺癌和乳腺癌的總和。80％的原發性肺部腫瘤是非小細胞肺癌(NSCLC)。由于多種藥物治療產生最小存活優勢和嚴重毒性，標準化療聯合仍然是相對無效的。
另有一例，多形性成膠質細胞瘤(神經膠質瘤)是成年人中最普遍的原發惡性腦腫瘤。盡管應用了外科手術，放療和化療，治愈率和平均患者存活數仍沒有改善。其它腫瘤也向腦部轉移，這種情況下，由于血腦屏障對藥物傳遞的限制使它們對外周化療的反應不太好。明確地說，需要更多的針對腦腫瘤的治療方法。這種方法的其中之一包括免疫療法。一段時間以來已知在外周致敏了的淋巴細胞能通過血腦屏障并靶向腦組織。腦腫瘤免疫療法的主要靶點是誘發針對在腦腫瘤細胞中特異性表達的新的或突變的抗原的免疫反應的疫苗。這個目標將提供一種疫苗方法，以提供廣泛的、有力的和長效的免疫保護作用對抗顱內腫瘤。
疫苗廣泛地用于預防疾病和治療確定的疾病(免疫治療疫苗)。蛋白抗原(例如，由于重組DNA技術使其研制成為可能的亞單位疫苗)，當不與佐劑一起給予時，誘發弱體液(抗體)免疫，并因此到目前為止是令人失望的，因為它們僅產生有限的免疫原性。亞單位疫苗與滅活病毒和重組活病毒疫苗的另一個缺點是當與佐劑一起給予時，雖然刺激強體液免疫反應，但不能誘發保護性細胞免疫。佐劑實驗性地用來刺激小鼠的有效免疫反應，并且希望用于人疫苗，但只有少數佐劑被批準用于人類應用。實際上，在美國批準使用的唯一佐劑是鋁鹽，氫氧化鋁和磷酸鋁，它們中沒有一個刺激細胞介導的免疫。鋁鹽制劑不能冷凍或凍干，并且這種佐劑不是與所有抗原都有效。另外，多數佐劑不會導致細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的誘導。CTL是殺死合成異常蛋白，包括病毒蛋白和突變“自身”蛋白的細胞所需的。正在大力研究刺激CTL的疫苗以用于對抗多種疾病，包括所有癌癥(例如黑色素瘤，前列腺癌，卵巢癌等)。因此總之需要總體刺激CTL和細胞介導免疫的佐劑。
酵母已用于亞單位蛋白疫苗的產生；然而，在這種情況中，酵母用于產生蛋白，但是酵母細胞或其亞細胞級分實際上不能傳遞給患者。也有在免疫之前用酵母喂飼動物，試圖以非特異性方式啟動免疫反應(例如，刺激吞噬作用以及補體和干擾素的產生)。結論是不明確的，并且這種方法不能產生保護性細胞免疫；參見例如Fattal-German等，1992，Dev.Biol.Stand.77，115-120；Bizzini等，1990，FEMSMicrobiol.Immunol.2，155-167。
1998年11月3日公布的Duke等人的美國專利US 5,830,463，描述了使用帶有至少一個能調節免疫反應的化合物的非致病性酵母，并證明了這種復合物對刺激細胞介導的免疫和刺激體液免疫都有效。具體的，US 5,830,463證明了當給予動物后，經遺傳改造表達異源抗原的酵母能誘發細胞介導的免疫反應和體液免疫反應。
盡管癌癥治療和疫苗技術目前有進展，仍然急迫需要研制安全和有效的疫苗和佐劑，它們是針對適用于免疫療法的疾病，包括瘤性轉化(癌)導致的疾病，特別是針對那些對使用常規癌癥療法和普通疫苗策略的治療特別耐受的癌癥。
發明概述本發明的一個實施例涉及一種保護動物對抗癌癥的方法，包括對已患有癌癥或可能發展為癌癥的動物給予疫苗，以減少或預防動物癌癥的至少一種癥狀。所述疫苗包含(a)酵母載體；和(b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)至少一種癌抗原；和(ii)與該癌抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。融合蛋白要滿足下述額外要求(1)融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；(2)融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；(3)融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和(4)融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。一方面，所述肽由至少2-6個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成。另一方面，所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列，其中X2是除甘氨酸，脯氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X3是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X4是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X5是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；和X6是除甲硫氨酸之外的任意一種氨基酸。一方面，X6是脯氨酸。另一方面，所述肽包含M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。
本發明的另一個實施例涉及一種保護動物對抗癌癥的方法，包括對已患有癌癥或可能發展為癌癥的動物給予疫苗，以減少或預防動物癌癥的至少一種癥狀。所述疫苗包含(a)酵母載體；和(b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)至少一種癌抗原；和(ii)與該癌抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。一方面，所述酵母蛋白包含用于鑒定和純化融合蛋白的抗體表位。
上述任意一個本發明的實施例，還要考慮下述額外方面。一方面，融合蛋白包含至少兩種或多種癌抗原。另一方面，融合蛋白包含一種或多種癌抗原的至少一個或多個免疫原性功能域。另一方面，癌抗原是與選自以下組癌癥相關的抗原黑色素瘤，鱗狀細胞癌，乳腺癌，頭頸癌，甲狀腺癌，軟組織肉瘤，骨肉瘤，睪丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮膚癌，腦癌，脈管肉瘤(angiosarcoma)，血管肉瘤(hemangiosarcoma)，肥大細胞腫瘤，原發性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃腸癌，腎細胞癌，造血細胞瘤形成及它們的轉移性癌癥。
另一方面，癌抗原是ras基因編碼的野生型或突變蛋白。例如，癌抗原可包括選自以下組的ras基因編碼的野生型或突變蛋白K-ras，N-ras和H-ras基因。一方面，ras基因編碼帶有單突變或多突變的Ras蛋白。另一方面，癌抗原包含片段，所述片段含有對應于野生型Ras蛋白位置12，13，59或61的氨基酸的野生型Ras蛋白的至少5-9個連續氨基酸殘基，其中位置12，13，59，或61的氨基酸殘基相對于野生型Ras蛋白發生了突變。
另一方面，癌抗原由含有多個功能域的融合蛋白構建體組成，其中每個功能域由來自癌蛋白的肽組成，所述肽由蛋白中所發現的突變氨基酸及其任意一側的至少4個氨基酸殘基組成，其中突變與致腫瘤性相關。這方面，融合蛋白構建體由至少一個與另一個突變腫瘤抗原在閱讀框內融合的肽組成，其中所述肽選自以下組(a)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置8-16的肽，其中SEQ ID NO3位置12的氨基酸殘基發生了突變；(b)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置9-17的肽，其中SEQ ID NO3位置13的氨基酸殘基發生了突變；(c)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置55-63的肽，其中SEQ ID NO3位置59的氨基酸殘基發生了突變；和(d)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置57-65的肽，其中SEQ ID NO3位置61的氨基酸殘基發生了突變。一方面，突變的腫瘤抗原是相對于野生型Ras蛋白序列含有至少一個突變的Ras蛋白。
上述任一方法的一個實施例中，疫苗施用到呼吸道。另一實施例中，以胃腸道外給予途徑給予疫苗。另一實施例中，疫苗進一步包含樹突細胞或巨噬細胞，其中表達融合蛋白的酵母載體傳遞到來自體內的樹突細胞或巨噬細胞，并且將包含表達癌抗原的酵母載體的樹突細胞或巨噬細胞給予動物。這個實施例的一方面，樹突細胞或酵母載體額外裝載了游離抗原。一方面，疫苗作為治療性疫苗給予。另一方面，疫苗作為預防性疫苗給予。一方面，動物已經患有或者可能發展為選自以下組的癌癥腦癌，肺癌，乳腺癌，黑色素瘤和腎癌。另一方面，動物患有癌癥，在通過外科手術切除動物的腫瘤之后再給予疫苗。另一方面，動物患有癌癥，在通過外科手術切除動物的腫瘤，并且進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植之后再給予疫苗。另一方面，動物患有癌癥，在通過外科手術切除動物的腫瘤，進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植，以及輸注同種異體的供體淋巴細胞之后再給予疫苗。
本發明的另一個實施例涉及一種保護動物對抗腦癌或肺癌的方法，包括將包含酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗施用到已患有或可能發展為腦癌或肺癌的動物的呼吸道，以減少或預防至少一種動物腦癌或肺癌的癥狀。這個實施例中，疫苗可包括上述任意一種融合蛋白和其它抗原。一方面，疫苗包含至少兩種或多種癌抗原。另一方面，癌抗原是含有至少一種或多種癌抗原的融合蛋白。另一方面，癌抗原是含有一種或多種癌抗原的至少一個或多個免疫原性功能域的融合蛋白。
這個實施例的一方面，疫苗以鼻內給予方式給予。另一方面，疫苗以氣管內給予方式給予。另一實施例中，酵母載體和癌抗原傳遞到來自體內的樹突細胞或巨噬細胞，并且包含酵母載體和癌抗原的樹突細胞或巨噬細胞施用到動物的呼吸道。
一方面，所述方法保護動物對抗腦癌，包括但不限于原發性腦癌，如多形性成膠質細胞瘤或來自另一器官的轉移癌。另一個實施例中，所述方法保護動物對抗肺癌，包括但不限于原發性肺癌(例如，非小細胞癌，小細胞癌和腺癌)或來自另一器官的轉移癌。一方面，疫苗作為治療性疫苗給予。另一方面，疫苗作為預防性疫苗給予。
本發明還有一個實施例涉及一種誘發動物的抗原特異性體液免疫反應以及抗原特異性細胞介導的免疫反應的方法。所述方法包括給予動物包含下述的治療性組合物(a)酵母載體；和(b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)至少一種抗原；和(ii)與抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。所述融合蛋白要滿足下述額外要求融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。一方面，所述肽由至少6個與抗原異源的氨基酸殘基組成。另一方面，所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列，其中X2是除甘氨酸，脯氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X3是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X4是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X5是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；和X6是除甲硫氨酸之外的任意一種氨基酸。一方面，X6是脯氨酸。另一方面，所述肽包含M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。一方面，抗原選自以下組病毒抗原，過表達的哺乳動物細胞表面分子，細菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原，蠕蟲(helminth)抗原，外寄生蟲抗原，癌抗原，帶有一個和多個突變氨基酸的哺乳動物細胞分子，出生前或剛出生時哺乳動物細胞正常表達的蛋白，通過插入流行病學因子(如病毒)而被誘導表達的蛋白，通過基因易位而被誘導表達的蛋白，以及通過調節序列的突變而被誘導表達的蛋白。
另一實施例涉及用于如上所述方法的疫苗。
本發明還有一個實施例涉及一種誘發動物的抗原特異性體液免疫反應和抗原特異性細胞介導的免疫反應的方法，所述方法包括給予動物包含下述的治療性組合物(a)酵母載體；和(b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含(i)至少一種抗原；和(ii)與該抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。一方面，所述酵母蛋白包含用于鑒定和純化融合蛋白的抗體表位。
本發明另一實施例涉及用于如上所述方法的疫苗。
本發明還有一個實施例涉及一種治療癌癥病人的方法，包括(a)用能有效建立穩定混合的骨髓嵌合狀態的不引起骨髓重度抑制的干細胞轉移來治療癌癥病人，其中干細胞由同種異體的供體提供；(b)將從同種異體的供體處獲得的淋巴細胞給予病人；和(c)在步驟(b)之后，將含有酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗給予病人。一方面，所述方法還包括在步驟(a)之前，將含有酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗給予同種異體的供體。另一實施例中，所述方法包括在進行步驟(a)之前，切除病人的腫瘤。
該方法一方面，疫苗包含至少兩種或多種癌抗原。另一方面，癌抗原是含有一種或多種癌抗原的融合蛋白。另一方面，癌抗原是包含一種或多種癌抗原的一個或多個免疫原性功能域的融合蛋白。另一方面，癌抗原由包含多個功能域的融合蛋白構建體組成，其中每個功能域由來自癌蛋白的肽組成，所述肽由蛋白中所發現的突變氨基酸及其任意一側的至少4個氨基酸殘基組成，其中突變與致腫瘤性相關。另一方面，酵母載體表達癌抗原，其中癌抗原是融合蛋白，包含(a)至少一個癌抗原；和(ii)與該癌抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工其中融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。另一方面，酵母載體表達癌抗原，其中癌抗原是融合蛋白，包含(a)至少一個癌抗原；和(ii)與該癌抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。
這個實施例的一方面，疫苗以鼻內給予方式給予。另一方面，疫苗以胃腸道外給予方式給予。另一方面，酵母載體和癌抗原傳遞到來自體內的樹突細胞或巨噬細胞，并且包含酵母載體和癌抗原的樹突細胞或巨噬細胞施用到動物的呼吸道。
上述任意一種本發明的方法和組合物中，涉及酵母載體的下述方面也包括在本發明中。一個實施例中，酵母載體選自以下組完整的酵母，酵母原生質球，酵母胞質體，酵母空胞，以及亞細胞性酵母膜提取物或級分。一方面，用編碼抗原的重組核酸分子轉化用來制備酵母載體的酵母細胞或酵母原生質球，使酵母細胞或酵母原生質球中重組表達抗原。在這方面中，重組表達抗原的酵母細胞或酵母原生質球用來制備包含酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或級分的酵母載體。一方面，酵母載體來自非致病性酵母。另一方面，酵母載體來自選自以下組的酵母糖酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，克魯維酵母(Kluveromyces)，漢遜酵母(Hansenula)，假絲酵母(Candida)和畢赤酵母(Pichia)。一方面，酵母是釀酒酵母(S.cerevisiae)。
總之，酵母和抗原可通過本文所述的任意技術結合，一方面，酵母載體在細胞內裝載了(load)癌抗原。另一方面，癌抗原與酵母載體共價或非共價結合。另一方面，通過混合使酵母載體和抗原結合。另一方面，由酵母載體或衍生出酵母載體的酵母細胞或酵母原生質球來重組表達抗原。
附圖簡述

圖1是柱形圖，顯示基于酵母的Ras61-VAX疫苗在體外控制預先存在的烏拉坦(urethane)誘導的肺部腫瘤。
圖2是柱形圖，顯示當經皮下和鼻內途徑給予時，基于酵母的RasV-VAX疫苗提供對抗肺部腫瘤生長的特異性保護。
圖3是柱形圖，顯示當以鼻內給予方式而不是皮下給予方式給予時，表達Gag的基于酵母的疫苗能防護顱內腫瘤。
圖4是存活曲線圖，顯示當經皮下和鼻內給予時，表達EGFR的基于酵母的疫苗(EGFR-tm VAX)能防護表達EGFR的顱內腫瘤的攻擊。
圖5是柱形圖，顯示接種表達乳腺腫瘤抗原的基于酵母的疫苗聯合不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植能防護腫瘤攻擊。
圖6是柱形圖，顯示接種表達黑色素瘤抗原的基于酵母的疫苗能防護表達該抗原的黑色素瘤的腫瘤攻擊。
圖7是用于本發明基于酵母的疫苗的各種突變Ras融合蛋白的構建示意圖。

發明內容
本發明涉及治療和/或預防多種適用于免疫療法的疾病和狀態的組合物和方法，一個具體實施例涉及治療和/或預防動物癌癥的組合物和方法。本發明包括使用包含酵母載體和選擇用來誘發動物抗原特異性細胞免疫反應和體液免疫反應的抗原的基于酵母的疫苗，用于預防性和/或治療性接種以及預防和/或治療多種疾病和狀態。特別是，發明人在此描述了使用基于酵母的疫苗以在體內減小(reduce)多種不同形式癌癥中的腫瘤，包括肺癌，腦癌，乳腺癌和腎癌。本文還描述了對用于癌癥治療和各種免疫治療方法和組合物的基于酵母的疫苗的改進。
發明人以前描述過能誘導有效的細胞介導免疫，包括細胞毒性T細胞(CTL)反應的疫苗技術。所述疫苗技術包括使用酵母及其衍生物作為疫苗載體，其中酵母被改造成表達相關抗原或者裝載了相關抗原，來誘發抗該抗原的免疫反應。US 5,830,463概括描述了這種技術并且全部引入本文作為參考。本發明采用了US 5,830,463中描述的現有酵母疫苗技術，并提供了對以下內容的具體改進一種使用酵母載體和挑選的癌抗原減輕癌癥方法，包含具有提高的穩定性的新蛋白的新酵母疫苗，和使用新酵母疫苗治療任意疾病或狀態的方法，對于這些疾病或狀態誘發免疫反應可能具有治療益處。對可用于本發明各個實施例中的酵母疫苗的概括描述在未審結的系列申請US09/991,363中也有描述，全部引入本文作為參考。
特別是，本發明人發現雖然多種免疫途徑對于在外周破壞腫瘤可能效果相當，而本發明所使用的基于酵母的疫苗能夠致敏肺部獨特的效應細胞。因此，雖然其它給予途徑仍然有效，將酵母疫苗經過呼吸道(如鼻內，吸入，氣管內)給予能產生驚人的強免疫反應和抗腫瘤效果，這是迄今所研究的其它給予途徑不能實現的。特別是，本發明人發現將酵母疫苗施用到呼吸道對減小肺癌腫瘤的效果明顯好于將該疫苗施用到外周的效果。可能在腦腫瘤中獲得的結果甚至更驚人，當將酵母疫苗施用到呼吸道時，能在迄今所研究的全部試驗模型中誘導有效的抗腫瘤反應，外周(皮下)給予疫苗對于誘導腦部抗腫瘤反應不太有效，并且在至少一個腦癌的試驗模型中，外周給予沒能在腦部產生明顯的抗腫瘤效果。因此，本發明的基于酵母的疫苗能致敏肺部獨特的免疫效應細胞前體，這種免疫細胞能特別有效地通過血腦屏障，影響顱內腫瘤的生長進程。不被理論束縛，本發明人相信免疫途徑可能是設計針對至少是腦部腫瘤和肺部腫瘤的有效疫苗的一個重要因素。因為本發明的基于酵母的疫苗能非常容易的應用于多種免疫途徑，所以該疫苗必將以迄今未被認識到的治療某些癌癥的潛力，唯一地激發高度特異性的免疫反應。
本發明人還發現，在Luznik等，(Blood 101(4)1645-1652，2003；全部引入本文作為參考)先前描述的混合同種異體骨髓嵌合的一種新修改方案中使用本發明的酵母疫苗，能在體內極好地誘導治療性免疫和抗腫瘤反應。重要的是，不需使用來自受者的全部腫瘤制備物，不需用生物學反應改良劑，如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)加強疫苗，不需使用常規的佐劑，也能獲得該結果。另外，使用本發明的酵母載體在選擇抗原和抗原組合方面有極大的靈活性，并能顯著增強針對抗原的細胞免疫。此外，通過用本發明的酵母疫苗以可控的、選擇性的方式免疫供體，產生了額外的增強作用。
另外，本發明人利用能穩定異源蛋白在酵母載體中的表達和/或防止所表達的異源蛋白的翻譯后加工的新的融合蛋白改進了基于酵母的疫苗技術。具體的，本發明人在此描述了一種在酵母中表達異源抗原的新構建體，其中所需抗原性蛋白或肽的氨基末端與下述物質融合(a)合成肽；或(b)內源性酵母蛋白的至少一部分，其中任一融合伙伴(partner)能顯著增加蛋白在酵母中表達的穩定性和/或防止酵母細胞對蛋白的翻譯后加工。融合肽還提供了設計用來為選擇性物質，如抗體識別的表位，并且不會消極影響針對構建體中的接種抗原的免疫反應。這種物質適用于鑒定、篩選和純化用于本發明的蛋白。
另外，本發明預計使用與抗原構建體C末端融合的肽，特別用于篩選和鑒別蛋白。這種肽包括，但不限于任何合成的或天然的肽，如肽標記(如6×His)，或任何其它短表位標記。根據本發明的附加在抗原C末端的肽，可在添加或不添加如上所述N末端肽的情況下使用。
最后，本發明人在此描述了用于提供來自相同構建體中一個或多個抗原的多個免疫原性功能域的基于酵母的疫苗中的新融合蛋白抗原。當希望在單一疫苗構建體中包含在抗原的一個或幾個位置天然發生的幾個不同的突變和/或突變組合時，這種融合蛋白特別有用。例如，已知ras基因家族的癌基因中有幾個與天然腫瘤細胞表現型相關的不同突變。發現在78％的胰腺癌，34％的結腸直腸癌，27％的非小細胞肺癌和24％的卵巢癌中，編碼Ras蛋白12位氨基酸的密碼子發生突變。還發現多種癌癥中在13位，59位和61位有不同的突變。本發明人在此描述了采用基于酵母的疫苗的方法制備融合蛋白，包括但不限于基于ras突變的融合蛋白，使得在相同的抗原疫苗內，在相同的位置有幾個突變和/或在一個以上的位置有不同的突變組合。
作為本發明所使用的方法和組合物的概括描述，此處所述的疫苗和方法將使T細胞高效活化的有效抗原傳遞整合在一個不需要附加的佐劑成分或生物調節劑的強效疫苗制劑中。本文所述的疫苗具有許多使其成為理想疫苗候選物的其它屬性，包括但不限于容易構建，大批制備時費用低，生物學穩定和安全。對小鼠，大鼠，兔，豚尾猴(Macaca nemestrina)，獼猴或免疫缺陷CB.17scid小鼠，以完整酵母進行初次免疫或重復給予時，沒有出現嚴重的不良反應(觀察結果未公布)。此外，如系列申請US 09/991,363(出處同上)所述，酵母抗原復合物使樹突細胞成熟為有效的抗原遞呈細胞(APCs)，同時將抗原有效傳遞到MHC I類和MHC II類加工途徑的能力表明，基于酵母的疫苗載體將提供一種有效的誘導對抗多種傳染性疾病和癌癥靶的細胞介導免疫的有效策略。實際上，本文所述的數據以及基于酵母的疫苗技術的進步也證明了這個一般原則，同時提供了對以前未被重視的技術的重要改進。
根據本發明，酵母載體是可與本發明的疫苗或治療性組合物中的抗原聯合使用的或作為佐劑使用的任意酵母細胞(如全部的或完整的細胞)或其衍生物(見下文)。因此酵母載體包括，但不限于，活的完整的酵母微生物(即，具有其全部成分包括細胞壁的酵母細胞)，滅活的(死的)完整的酵母微生物，或其衍生物，包括酵母原生質球(即缺少細胞壁的酵母細胞)，酵母胞質體(即缺少細胞壁和細胞核的酵母細胞)，酵母空胞(即缺少細胞壁、細胞核和細胞質的酵母細胞)，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分(以前也稱作亞細胞酵母顆粒)。
通常，通過酶消化酵母細胞壁制備酵母原生質球。例如Franzusoff等，1991，Meth.Enzymol.194，662-674描述了這種方法，并全部引入本文作為參考。通常，通過從酵母細胞摘除細胞核制備酵母胞質體。例如Coon，1978，Natl.Cancer Inst.Monogr.48，45-55描述了這種方法，并全部引入本文作為參考。通常如下制備酵母空胞，重新密封經透化處理的或溶解了的細胞，并可以包含但不是必需包含該細胞的至少一些細胞器。例如Franzusoff等，1983，J.Biol.Chem.258，3608-3614和Bussey等，1979，Bioclaim.Biophys.Acta553，185-196描述了這種方法，每一個都全部引入本文作為參考。亞細胞性酵母膜提取物或其級分指缺少天然細胞核或細胞漿的酵母膜。該顆粒可以是任意大小，包括從天然酵母膜的大小到微顆粒的大小，所述微顆粒是用超聲處理或本領域技術人員已知的其它膜破裂方法，隨后重新密封制備的。制備亞細胞性酵母膜提取物的方法如Franzusoff等，1991，Meth. Enzymol.194，662-674所述。還可使用酵母膜提取物級分，它含有部分酵母膜，并且在酵母重組表達抗原時在制備酵母膜提取物之前含有目標抗原。
可用任意酵母菌株制備本發明的酵母載體。酵母是單細胞微生物，屬于下述三綱之一子囊菌綱(Ascomycetes)，擔子菌綱(Basidiomycetes)和半知菌(Fungi Imperfecti)。雖然致病酵母菌株或其非致病突變體都可用于本發明，但優選非致病酵母菌株。優選酵母菌株的屬包括糖酵母屬，假絲酵母屬(可能是致病的)，隱球菌屬(Cryptococcus)，漢遜酵母屬，克魯維酵母屬，畢赤酵母屬，紅酵母屬(Rhodotorula)，裂殖酵母屬和西洋蓍霉(Yarrowia)，更優選糖酵母屬，假絲酵母屬，漢遜酵母屬，畢赤酵母屬和裂殖酵母屬，特別優選糖酵母屬。優選酵母菌株的種包括釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，白色假絲酵母(Candidaalbicans)，乳酒假絲酵母(Candida kefyr)，熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)，羅倫隱球菌(Cryptococcus laurentii)，新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)，異常漢遜酵母(Hansenula anomala)，多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)，脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)，馬克斯克魯維酵母乳酸變體(Kluyveromyces marxianus var.lactis)，巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)，深紅類酵母(Rhodotorula rubra)，栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和Yarrowia lipolytica。應該知道許多這些菌種包括屬于上述種的多種亞種，型，亞型等。更優選的酵母種包括釀酒酵母，白色假絲酵母(C.albicans)，多形漢遜酵母(H.polymorpha)，巴氏畢赤酵母(P.pastors)和栗酒裂殖酵母(S.pombe)。特別優選釀酒酵母，因為它相對來說容易操作并且用作食品添加劑“通常被認為是安全的”(“GRAS”)(GRAS，FDA提出的規則62FR18938，4月17，1997)。本發明的一個實施例是能使質粒復制到相當高的拷貝數的酵母株，如釀酒酵母cir°(S.cerevisiae cir)株。
一個實施例中，本發明優選的酵母載體能與該酵母載體和抗原被傳遞到的細胞(如樹突細胞或巨噬細胞)融合，從而顯著影響酵母載體的有效傳遞，在很多實施例中是顯著影響酵母載體將抗原有效傳遞到細胞。本文中，酵母載體與靶細胞的融合是指酵母細胞膜，或其顆粒與靶細胞(如樹突細胞或巨噬細胞)膜融合，形成合胞體的能力。本文中，合胞體是細胞合并產生的原生質多核團(mass)。各種病毒表面蛋白(包括免疫缺陷病毒，如HIV，流感病毒，脊髓灰質炎病毒和腺病毒的表面蛋白)和其它促融劑(如卵子和精子融合時涉及的促融劑)能影響兩個膜之間的融合(即病毒和哺乳動物細胞膜之間的融合或哺乳動物細胞膜之間的融合)。例如，在其表面上產生HIVgp120/gp41異種抗原的酵母載體能與CD4+ T-淋巴細胞融合。然而要注意，雖然在某些情況下需要將尋靶部分摻入到酵母載體中，但這不是必需的。本發明人以前證明了本發明的酵母載體很容易被樹突細胞(以及其它細胞，如巨噬細胞)攝入。
利用本領域技術人員已知的許多技術，可以將酵母載體配制到本發明的組合物中，包括直接給予病人的制品或首先裝入(load)載體中(如樹突細胞)的制品。例如，將酵母載體暴露于液氮或干冰，通過凍干或冷凍干燥酵母載體。將酵母包裝成塊狀或片狀，正如將酵母用于烘焙或釀造操作時所做的，也可制備含有酵母載體的配制劑。另外，在裝入樹突細胞之前，或與抗原以其它類型給予方式給予之前，酵母載體可與藥物可接受賦形劑，如宿主細胞耐受的等滲緩沖液混合。這種賦形劑包括，例如水，鹽水，林格(Ringer′s)溶液，葡萄糖(dextrose)溶液，Hank′s液，以及其它的含水生理平衡鹽溶液。也可使用非水介質，如不揮發油，芝麻油，油酸乙酯，或甘油三酯。其它的有用制劑包括含有增稠劑，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇，甘油或葡聚糖的懸液。賦形劑還可包含少量添加劑，如增加等滲性和化學穩定性的物質。緩沖液的例子包括磷酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液和Tris緩沖液，防腐劑的例子包括硫柳汞，間(m-)甲苯酚或鄰(o-)甲苯酚，福爾馬林和苯甲醇。標準的配制劑是可注射的液體或是能用合適的液體溶解為注射用懸液或溶液的固體。因此，在非液體配制劑中，賦形劑包括，例如葡萄糖，人血清白蛋白，和/或防腐劑，在給予之前加入無菌水或無菌鹽水。
本發明的治療性組合物或疫苗的一個成分包括至少一種免疫接種動物的抗原。所述組合物或疫苗可根據需要包括，一，二，幾個，一些或大量抗原，所述抗原包括一個或多個抗原的一個或多個免疫原性功能域。根據本發明，本文通常使用的術語“抗原”指天然存在的或合成衍生的蛋白的任意部分(肽，部分蛋白，全長蛋白)，細胞成分(完整的細胞，細胞溶解物或破裂的細胞)，生物體(完整生物體，溶解的或破裂的細胞)或碳水化合物或其它分子，或其部分，其中抗原誘發抗原特異性免疫反應(體液和/或細胞免疫反應)，或作為耐受原，針對在給予所述抗原的動物的細胞和組織內碰到的相同或相似抗原。
本發明的一個實施例中，當需要刺激免疫反應時，術語“抗原”可與術語“免疫原”交換使用，并用來描述誘發體液和/或細胞免疫反應的(即，是抗原性的)蛋白，肽，細胞成分，生物體或其它分子，因此給予動物免疫原(例如，通過本發明的疫苗)可產生針對動物組織中碰到的相同或相似抗原的抗原特異性免疫反應。因此，一個實施例中，接種動物以對抗特定抗原意味著給予該抗原的結果是誘發抗所述抗原的免疫反應。優選免疫接種產生保護效果或治療效果，其中隨后暴露于抗原(或抗原來源)將誘發抗所述抗原的(或來源的)減輕或防止動物的疾病或狀態的免疫反應。免疫接種的概念是本領域已知的。通過給予本發明的治療性組合物誘發的免疫反應可以是，與不給予疫苗時比較，免疫反應的任意方面的任意可檢測的變化(例如，細胞反應，體液反應，細胞因子的產生)。
另一實施例中，當需要抑制抗指定抗原的免疫反應時，抗原可包括耐受原。根據本發明，耐受原用來描述以減輕或改變針對抗原的免疫反應的給予形式，給予量或給予途徑提供的蛋白，肽，細胞成分，生物體或其它分子，優選與耐受原或表達或遞呈這種耐受原的細胞接觸時，基本無應答，無反應性，其它失活作用或清除免疫系統細胞。
“接種抗原”可以是免疫原或耐受原，它是疫苗中所用的抗原，誘發抗接種抗原的生物學反應(免疫反應的誘發，耐受)。
指定抗原的免疫原性功能域可以是當給予動物時作為免疫原的包含至少一個表位的抗原的任意部分(即，肽片段或亞單位)。例如，單個蛋白可包含多個不同的免疫原性功能域。
本文中表位定義為指定抗原中足夠誘發免疫反應的單個免疫原性位置，或指定抗原中足夠抑制，消除或滅活免疫反應的單個耐受性位置。本領域技術人員知道T細胞表位在大小和組成上與B細胞表位不同，通過MHC I類途徑遞呈的表位不同于通過MHC II類途徑遞呈的表位。抗原可以如單個表位一樣小，或稍大，可包含多個表位。因此，抗原的大小可以是約5-12個氨基酸(如，肽)一樣小，或像全長蛋白，包括多體和融合蛋白，嵌合蛋白，完整細胞，完整微生物或其部分(如完整細胞的溶解物或微生物提取物)一樣大。另外，抗原包括可裝入酵母載體或本發明的組合物的碳水化合物，如癌細胞表達的碳水化合物。一些實施例中(即，當酵母載體從重組核酸分子表達抗原時)，抗原是蛋白，融合蛋白，嵌合蛋白，或其片段，而不是全細胞或微生物。一個優選實施例中，抗原選自腫瘤抗原或傳染性疾病病原體抗原(即病原體抗原)。一個實施例中，抗原選自病毒抗原，過表達哺乳動物細胞表面分子，細菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原，蠕蟲抗原，外寄生蟲抗原，癌抗原，帶有一個或多個突變氨基酸的哺乳動物細胞分子，出生前或剛出生時哺乳動物細胞正常表達的蛋白，通過插入流行病學因子(如病毒)而被誘導表達的蛋白，通過基因易位而被誘導表達的蛋白，以及通過調節序列的突變而被誘導表達的蛋白。
根據本發明，適合用在本發明組合物或疫苗的抗原可包括來自相同抗原的兩個或多個免疫原性功能域或表位，來自相同細胞，組織或生物體的兩個或多個抗原免疫原性功能域或表位，或來自不同細胞，組織或生物體的兩個或多個不同抗原，免疫原性功能域或表位。優選抗原是與酵母菌株異源的(即，并非是在不進行遺傳或生物學操作時，酵母菌株天然產生的蛋白)。
本發明的一個實施例涉及用作本發明疫苗的抗原的幾個改良的蛋白。具體的，本發明提供了能穩定異源蛋白在酵母載體中的表達和/或防止所表達的異源蛋白的翻譯后加工的新的融合蛋白構建體。通常，這些融合蛋白多數由酵母載體以重組蛋白的形式表達(例如，通過完整的酵母或酵母原生質球，它任選的進一步處理成酵母胞質體，酵母空胞或酵母膜提取物或其片段)，一個或多個這種融合蛋白可以裝入酵母載體或與上述構成本發明疫苗的酵母載體復合或混合，這只是本發明的一個實施例。
用于本發明的一個這種融合構建體是融合蛋白，包含(a)至少一種抗原(包括全長抗原的免疫原性功能域和抗原表位，以及本文其它部分所描述的各種融合蛋白和多抗原構建體)；和(b)合成肽。所述合成肽優選與癌抗原的N末端連接。該肽由至少兩個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。合成肽和抗原的N末端部分一起形成滿足下列要求的融合蛋白(1)融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸(即合成肽的第一個氨基酸是甲硫氨酸)；(2)融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸(即合成肽的第二個氨基酸不是甘氨酸或脯氨酸)；(3)融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸(即所述蛋白或合成肽的一部分的位置2-6的氨基酸，條件是合成肽少于6個氨基酸，都不包括甲硫氨酸)；(4)融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸(即所述蛋白或合成肽的一部分的位置2-5的氨基酸，條件是所述合成肽少于5個氨基酸，都不包括賴氨酸或精氨酸)。合成肽可以只有兩個氨基酸，但更優選至少有2-6個氨基酸(包括3，4，5個氨基酸)，可以比6個氨基酸長，總長直至約200個氨基酸。
一個實施例中，所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列，其中M是甲硫氨酸；X2是除甘氨酸，脯氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X3是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X4是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X5是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；和X6是除甲硫氨酸之外的任意一種氨基酸。一個實施例中，X6殘基是脯氨酸。增強抗原在酵母細胞中表達的穩定性和/或防止蛋白在酵母中的翻譯后加工的示例性合成序列包含M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO1)的序列。除了增強表達產物的穩定性，本發明人相信這個融合伙伴不會消極影響抗構建體中接種抗原的免疫反應。此外，合成的融合蛋白可被設計成提供為選擇性物質，如抗體識別的表位。
根據本發明，“異源氨基酸”指不是天然發現的(即不是在自然界和體內發現的)特定氨基酸序列側翼的氨基酸序列，或與特定氨基酸序列的功能不相關的氨基酸序列，或當基因中出現位于編碼特定氨基酸序列的天然存在核酸序列的側翼的核苷酸時，不應由該核苷酸編碼的氨基酸序列，條件是在天然存在的序列中的此核苷酸是采用衍生指定氨基酸序列的生物體所使用的標準密碼子翻譯的。因此，與癌抗原異源的至少兩個氨基酸殘基是任意兩個不天然存在于癌抗原側翼的氨基酸殘基。
本發明的另一個實施例涉及一種融合蛋白，包含(a)至少一種抗原(包括全長抗原的免疫原性功能域和表位，以及本文其它部分所描述的各種融合蛋白和多抗原構建體)，并與(b)內源酵母蛋白的至少一部分融合。內源酵母蛋白優選與癌抗原的N末端融合，并顯著增強蛋白在酵母中表達的穩定性和/或防止酵母細胞對蛋白的翻譯后加工。另外，內源酵母抗原與合成肽的這種融合伙伴不會消極影響抗構建體中接種抗原的免疫反應。已能獲得或很容易制備選擇性結合內源抗原的抗體。最后，如果需要將蛋白定位到具體的細胞位置(例如，進入分泌途徑，進入線粒體，進入細胞核)，那么構建體可使用酵母蛋白的內源信號，以確保細胞結構最適于傳遞系統。
內源酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成(或最多22kDa)，所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。任何適合的內源酵母蛋白都可用于這個實施例，特別優選包括但不限于下述的蛋白，SUC2(酵母轉化酶；這是一個良好的候選物，因為它能在胞質(cytosolically)表達蛋白或將蛋白引入來自相同啟動子的分泌途徑，但依賴于培養基的碳源)；α因子信號前導序列；SEC7；CPY；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1；磷酸甘油激酶PGK和磷酸丙糖異構酶TPI基因產物，因為在葡萄糖中的抑制性表達和胞質定位；Cwp2p，因為它在細胞壁中分布和貯留；熱休克蛋白SSA1，SSA3，SSA4，SSC1和KAR2，對細胞進行熱處理能誘導這些蛋白的表達并使這些蛋白更加耐熱；線粒體蛋白CYC1，因為它能進入線粒體；BUD基因，因為在子細胞形成的初始期，它位于酵母細胞芽；ACT1，因為它錨定在肌動蛋白束上。
一個實施例中，內源酵母蛋白/肽或合成肽包含用于鑒定和純化融合蛋白的抗體表位。優選，獲得或制備可選擇性結合融合伙伴的抗體。根據本發明，術語“選擇性結合”指本發明的抗體，抗體結合片段或結合伙伴優先結合特定蛋白的能力。更具體的，術語“選擇性結合”指一個蛋白與另一個蛋白(例如針對抗原的抗體，其片段，或結合伙伴)的特異性結合，當通過任何標準試驗(例如，免疫測定法)測量時，其結合水平統計學上顯著高于試驗的背景對照。例如，當進行免疫測定時，對照通常包括含有抗體或僅僅抗原結合片段(即缺少抗原)的反應孔/反應試管，其中缺少抗原時抗體或其抗原結合片段的反應量(例如，與孔的非特異性結合)作為背景。測量結合可采用各種現有技術中的標準化方法，包括酶免疫測定(例如，ELISA)，免疫印跡測定，等。
抗體的特征是含有免疫球蛋白功能域，并因此是蛋白的免疫球蛋白超家族的成員。本發明的分離的抗體可包括含有這種抗體的血清，或已純化到不同程度的抗體。本發明的完整抗體可以是多克隆的或單克隆的。或者，本發明還可使用完整抗體的功能等價體，如其中一個或多個抗體功能域被截短或缺失的抗原結合片段，(例如，Fv，Fab，Fab′，或F(ab)2片段)，以及遺傳改造的抗體或其抗原結合片段，包括單鏈抗體或與超過一個表位結合的抗體(例如雙特異性抗體)，或與一個或多個不同抗原結合的抗體(例如，雙特異性或多特異性抗體)。
通常，制備抗體時，將合適的試驗動物，例如但不限于，兔，綿羊，倉鼠，荷蘭豬，小鼠，大鼠，或雞暴露于所需抗體針對的抗原。通常，用有效量的注射到動物內的抗原免疫動物。抗原的有效量指誘導動物產生抗體所需的量。動物的免疫系統隨后經過一段預設時間后發生反應。可以重復進行免疫過程直到發現免疫系統制備針對抗原的抗體。為了獲得抗原特異性多克隆抗體，從動物收集含有所需抗體的血清(或如果動物是雞的情況時，可從蛋中收集抗體)。這種血清可用作試劑。通過，例如用硫酸銨處理血清，可以從血清(或蛋)進一步純化多克隆抗體。
單克隆抗體可根據Kohler和Milstein(Nature 256495-497，1975)的方法制備。例如，從免疫動物脾臟(或任何合適組織)收集B淋巴細胞，然后與骨髓瘤細胞融合，獲得在適合培養基中能連續生長的雜交瘤細胞群。通過檢測雜交瘤所產生的抗體與所需抗原結合的能力，來篩選產生所需抗體的雜交瘤。
本發明還擴展到有時稱作結合伙伴的非抗體多肽，它被設計成特異性結合本發明的蛋白，并且根據需要激活或抑制本發明的蛋白。具有規定的配體特異性的這種多肽的設計實例見Beste等(Proc.Natl.Acad.Sci.961898-1903，1999)，全部引入本文作為參考。
本發明另一個實施例中，疫苗的抗原部分制備成含有兩個或多個抗原的融合蛋白。一方面，融合蛋白可包含一個或多個抗原的兩個或多個免疫原性功能域或兩個或多個表位。在一個特別優選的實施例中，融合蛋白包含抗原的兩個或多個免疫原性功能域，優選多個功能域，其中多個功能域共同擁有在抗原的一個或幾個位置天然發生的幾個不同突變和/或突變組合。這對提供一種針對非常特異性抗原的疫苗特別有利，已知所述抗原在多種病人中發生不定的突變。這種疫苗可對廣泛范圍的病人提供抗原特異性免疫。例如，用于本發明的多個功能域融合蛋白可具有多個功能域，其中每個功能域由來自特定蛋白的肽組成，所述肽由蛋白任意一側的至少4個氨基酸殘基組成，并包括所述蛋白中發現的突變氨基酸組成，所述突變與特定疾病(例如，癌癥)相關聯。
Ras是癌基因的一個實例，已知其中的一些突變發生在特定位置并且與一種或多種類型癌癥的發展相關聯。因此，可以購建由含有已知在某種癌癥中發生突變的特定殘基的肽組成的融合蛋白，其中每個功能域包含在那個位置的不同突變以便涵蓋那個位置已知的幾個或全部突變。例如，關于Ras，可以提供含有任意一側至少4個氨基酸，包括12位的氨基酸的免疫原性功能域，其中每個功能域具有非突變Ras蛋白中正常發生的對甘氨酸的不同取代。一個實施例中，癌抗原包含片段，所述片段含有對應于野生型Ras蛋白位置12，13，59，或61的氨基酸的野生型Ras蛋白的至少5-9個連續氨基酸殘基，其中位置12，13，59，或61的氨基酸殘基相對于野生型Ras蛋白發生了突變。一方面，融合蛋白構建體由至少一個與其它突變腫瘤抗原在閱讀框內融合的肽組成(例如，含有至少一個相對于野生型Ras蛋白序列的突變的Ras蛋白)，其中所述肽選自以下組(a)一種肽，其至少含有SEQ IDNO3位置8-16的肽，其中SEQ ID NO3位置12的氨基酸殘基發生了突變；(b)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置9-17的肽，其中SEQ ID NO3位置13的氨基酸殘基發生了突變；(c)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置55-63的肽，其中SEQ ID NO3位置59的氨基酸殘基發生了突變；和(d)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3位置57-65的肽，其中SEQ ID NO3位置61的氨基酸殘基發生了突變。注意，這些位置也對應于SEQ ID Nos5，7，9，11或13的任一，因為人和小鼠的序列在蛋白的這個區域是同一的，并且K-Ras，H-Ras和N-Ras在這個區域也是同一的。
特別適用于本發明這種策略的其它抗原對本領域技術人員是顯而易見的，包括但不限于任意癌基因，TP53(也稱作p53)，p73，BRAF，APC，Rb-1，Rb-2，VHL，BRCA1，BRCA2，AR(雄激素受體)，Smad4，MDR1，和/或Flt-3。
本發明的一個實施例中，本文所描述的任一氨基酸序列可從至少一個至約20個附加的、異源的、位于特定氨基酸序列C端和/或N端側翼的氨基酸制備。獲得的蛋白或多肽可被稱作“基本含有”特定氨基酸序列。如上所討論的，根據本發明，異源氨基酸指不是天然發現的(即不是在自然界和體內發現的)位于特定氨基酸序列側翼的氨基酸序列，或與特定氨基酸序列的功能不相關的氨基酸序列，或當基因中出現位于編碼特定氨基酸序列的天然存在核酸序列的側翼的核苷酸時，不應由所述核苷酸編碼的氨基酸序列，條件是在天然存在的序列中的所述核苷酸是采用衍生指定氨基酸序列的生物體所使用的標準密碼子翻譯的。類似的，術語“基本含有”，當用于本文的核酸序列時，指編碼特定氨基酸序列的核酸序列，它側接于編碼特定氨基酸序列的核酸序列的5′和/或3′端的每端的至少一個至約60個附加的異源核苷酸。異源核苷酸不是天然發現(即不是在自然界和體內發現的)出現在天然基因中時位于編碼特定氨基酸序列的核酸序列的側翼，或不編碼賦予蛋白任意額外功能或改變具有特定氨基酸序列的蛋白的功能的蛋白。
用于本發明的腫瘤抗原可包括腫瘤抗原，如來自腫瘤細胞的蛋白，糖蛋白或表面碳水化合物，來自腫瘤抗原的表位，全腫瘤細胞，腫瘤細胞混合物，及其部分(例如，溶解物)。一個實施例中，用于本發明的腫瘤抗原可從自體的腫瘤樣本中分離或衍生得到。自體腫瘤樣本來自給予了治療性組合物的動物。因此，癌癥中將存在要誘發的免疫反應所針對的的抗原。一方面，疫苗提供的腫瘤抗原從至少兩個，優選從相同組織學腫瘤類型的多個同種異體腫瘤樣本分離或衍生得到。根據本發明，多個同種異體腫瘤樣本是從同物種的兩個或多個動物中分離的相同組織學腫瘤類型的腫瘤樣本，所述動物至少在主要組織相容性復合物(MHC)方面有遺傳學差異，通常在其它基因位置有遺傳學差異。因此，如果一起給予，多個腫瘤抗原可以代表衍生出抗原的任意個體中出現的基本全部腫瘤抗原。本發明方法的這個實施例提供了一種疫苗，所述疫苗補償了個體病人在表達相同組織學腫瘤類型的腫瘤的腫瘤抗原上的天然變異。因此，給予這種治療性組合物能有效誘發抗各種腫瘤抗原的免疫反應，因此相同的治療性組合物可以給予各種不同的個體。一些實施例中，可給予動物來自不同組織學腫瘤類型的腫瘤的抗原，以提供一種非常廣泛的疫苗。
優選，從中分離或衍生獲得抗原的腫瘤是任意腫瘤或癌，包括但不限于，黑色素瘤，鱗狀細胞癌，乳腺癌，頭頸癌，甲狀腺癌，軟組織肉瘤，骨肉瘤，睪丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮膚癌，腦癌，脈管肉瘤，血管肉瘤，肥大細胞癌，早期肝癌，肺癌，胰腺癌，胃腸癌，腎細胞癌，造血細胞瘤形成和轉移癌。可用于本發明疫苗的具體癌抗原的例子，包括但不限于MAGE(包括但不限于MAGE3，MAGEA6，MAGEA10)，NY-ESO-1，gp100，酪氨酸酶，EGF-R，PSA，PMSA，CEA，HER2/neu，Muc-1，hTERT，MART1，TRP-1，TRP-2，BCR-abl，和p53的突變癌基因形式(TP53)，p73，ras，BRAF，APC(腺瘤結腸息肉)，myc，VHL(yon Hippel′s Lindau蛋白)，Rb-1(視網膜母細胞瘤)，Rb-2，BRCA1，BRCA2，AR(雄激素受體)，Smad4，MDR1，Flt-3。
根據本發明，癌抗原可包括上述任意腫瘤抗原，以及與癌癥獲得或發展的可能性相關的任意其它抗原，或抗該抗原的免疫反應對癌癥有治療益處的任意其它抗原。例如，癌抗原包括但不限于，腫瘤抗原，帶有一個或多個突變氨基酸的哺乳動物細胞分子，出生前或剛出生時哺乳動物細胞正常表達的蛋白，通過插入流行病學因子(如病毒)而被誘導表達的蛋白，通過基因易位而被誘導表達的蛋白，以及通過調節序列的突變而被誘導表達的蛋白。一些這種抗原也可作為其它類型疾病(例如自身免疫性疾病)的抗原。
本發明的一方面，用于本發明組合物的抗原是來自病原體(包括完整病原體)的抗原，特別是來自與傳染性疾病相關聯(例如，導致或促成)的病原體。來自傳染性疾病病原體的抗原可包括具有被T細胞識別的表位的抗原，或具有被B細胞識別的表位的抗原，由病原體唯一性表達的抗原，以及由病原體和其它細胞表達的抗原。病原體抗原可包括完整的細胞和整個病原生物體，及其溶解物，提取物或其它級分。某些情況中，抗原可包括通常不認為是對動物致病的，但針對它的免疫接種是需要的生物體或其部分。抗原可包括一個，兩個或多個抗原，它們代表了給予的疫苗所針對的傳染性疾病病原體中存在的基本全部的抗原。其它實施例中，可使用來自相同病原體的兩個或多個不同菌株的抗原或來自不同病原體的抗原，以增加疫苗的治療效果和/或效力。
根據本發明，病原體抗原包括，但不限于，由細菌，病毒，寄生蟲或真菌表達的抗原。優選用于本發明方法的病原體抗原包括引起動物慢性傳染性疾病的抗原。一個實施例中，用于本發明方法或組合物的病原體抗原包括來自病毒的抗原。用于本發明疫苗的病毒抗原的例子包括，但不限于，env，gag，rev，tar，tat，免疫缺陷病毒(例如HIV，FIV)的核衣殼蛋白和逆轉錄酶；HBV表面抗原和核心抗原；HCV抗原；流感病毒核衣殼蛋白；副流感病毒核衣殼蛋白；人乳頭瘤16型的E6和E7蛋白；EB病毒LMP-1，LMP-2和EBNA-2；皰疹LAA和糖蛋白D；以及來自其它病毒的類似蛋白。特別優選用于本發明的抗原包括，但不限于，HIV-1 gag，HIV-1 env，HIV-1 pol，HIV-1 tat，HIV-1 nef，HbsAG，HbcAg，丙型肝炎核心抗原，HPV E6和E7，HSV糖蛋白D，和炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)保護性抗原。
包括在本發明組合物(疫苗)中的其它優選抗原包括能抑制不需要的，或有害的免疫反應，如由例如變應原，自身免疫抗原，炎性物質引起的免疫反應的抗原；GVHD，某些癌癥中涉及的抗原，感染性休克抗原，和移植排斥涉及的抗原。這種化合物包括，但不限于，抗組胺劑，環孢菌素，皮質激素，FK506，與產生有害免疫反應所涉及的T細胞受體對應的蛋白，Fas配體(即，與細胞Fas受體的胞外區或胞質區結合，從而誘導細胞凋亡的化合物)，以影響耐受或無反應性的方式遞呈的適合的MHC復合物，T細胞受體，和自身免疫抗原，優選與能增強或抑制細胞和/或體液免疫的生物學反應調節劑聯合。
用于本發明的其它抗原和抗原組合對本領域技術人員是顯而易見的。本發明并不局限于使用如上描述的抗原。
根據本發明，術語“酵母載體-抗原復合物”或“酵母-抗原復合物”通常用來描述酵母載體和抗原的任意聯系。這種聯系包括酵母(重組酵母)表達抗原，將抗原引入酵母，抗原與酵母的物理結合，和將酵母和抗原一起混合在如緩沖液或其它溶液或配制劑中。下文中詳細描述了這些類型的復合物。
一個實施例中，用編碼抗原的異源核酸分子轉化用來制備酵母載體的酵母細胞，使酵母細胞表達所述抗原。這種酵母在本文中也稱作重組酵母或重組酵母載體。酵母細胞隨后作為完整細胞被裝入樹突細胞，或酵母細胞被殺死，或可衍生如形成酵母原生質球，胞質體，空胞，或亞細胞顆粒，上述任一隨后都被裝入樹突細胞。也可用重組核酸分子直接轉染酵母原生質球(例如，從完整的酵母制備原生質球，然后轉染)，以制備表達抗原的重組原生質球。
根據本發明，分離的核酸分子或核酸序列是與其天然環境分離的核酸分子或核酸序列。因此，“分離的”不能必然地反映核酸分子的純化程度。用于轉染酵母載體的分離的核酸分子包括DNA，RNA，或DNA或RNA的衍生物。分離的核酸分子可以是雙鏈或單鏈。用于本發明的分離的核酸分子包括編碼蛋白或其片段的核酸分子，只要所述片段包含至少一個用于本發明組合物的抗原表位。
轉化到本發明酵母載體中的核酸分子包含編碼一個或多個蛋白或其部分的核酸序列。這種核酸分子可包括部分或全部編碼區，調節區，或其組合。酵母菌株的一個優點是攜帶許多核酸分子的能力以及能夠產生許多異源蛋白。優選本發明酵母載體所產生的抗原的數量是酵母載體所能適當產生的抗原的任意數量，通常從至少一個到至少約5個或更多，優選從約2個至約5個化合物。
酵母載體中的核酸分子編碼的肽或蛋白可以是全長蛋白，或是功能等價蛋白，其中氨基酸被刪除(例如截短的蛋白)，插入，倒置，取代和/或衍生(例如乙酰化，糖基化，磷酸化，被磷脂酰甘油肌醇(GPI)錨定蛋白束縛)，使經修飾的蛋白與天然蛋白的生物學功能基本相似(或如果需要，與天然蛋白比較，修飾蛋白具有增強的或被抑制的功能)。可用現有技術中已知的技術進行修飾，所述技術包括，但不限于，直接修飾蛋白或用，例如標準或重組DNA技術影響隨機突變或定向誘變來修飾編碼蛋白的核酸序列。用測量蛋白生物活性的試驗篩選功能等價蛋白。
用本領域技術人員已知的技術實現本發明酵母載體中抗原的表達。簡單來說，將編碼至少一個所需抗原的核酸分子，以核酸分子與轉錄控制序列可操作連接的方式插入表達載體，以便當轉化到宿主酵母細胞時，能夠影響核酸分子的組成型表達或可調型表達。編碼一個或多個抗原的核酸分子可以是與一個或多個轉錄控制序列可操作連接的一個或多個表達載體。
本發明的重組分子中，核酸分子與表達載體可操作連接，所述表達載體包含調節序列，如轉錄控制序列，翻譯控制序列，復制起始點，和與酵母細胞相容并控制核酸分子表達的其它調節序列。特別是，本發明的重組分子包括與一個或多個轉錄控制序列可操作連接的核酸分子。術語“可操作連接”指將核酸分子與轉錄控制序列連接，使得當轉染(即，轉化，轉導或轉染)到宿主細胞時，該分子能夠被表達。
控制所產生的蛋白的量的轉錄控制序列包括控制轉錄起始，延伸和終止的序列。特別重要的轉錄控制序列是控制轉錄起始的序列，如啟動子和上游激活序列。任何適合的酵母啟動子都可用于本發明，并且多種這種啟動子是本領域技術人員已知的。用于在釀酒酵母中表達的優選啟動子包括，但不限于，編碼下述酵母蛋白的基因的啟動子醇脫氫酶I(ADH1)或II(ADH2)，CUP1，磷酸甘油酸酯激酶(PGK)，磷酸丙糖異構酶(TPI)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH；也叫做TDH3，指磷酸丙糖脫氫酶)，半乳糖激酶(GAL1)，半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶(GAL7)，UDP-半乳糖差向異構酶(GAL10)，細胞色素c1(CYC1)，Sec7蛋白(SEC7)，和酸性磷酸酶(PHO5)，更優選如ADH2/GAPDH和CYC 1/GAL 10的雜合啟動子，甚至更優選當細胞中葡萄糖濃度較低(如，約0.1％至0.2％)時被誘導的ADH2/GAPDH啟動子。同樣，很多上游激活序列(UASs)，也稱作增強子，也是已知的，用于在釀酒酵母中表達的優選的上游激活序列包括，但不限于，編碼下述蛋白的基因的UASsPCK1，TPI，TDH3，CYC1，ADH1，ADH2，SUC2，GAL1，GAL7和GAL10，以及由GAL4基因產物激活的其它UASs，特別優選ADH2 UAS。因為ADH2 UAS被ADR1基因產物激活，當異源基因與ADH2 UAS可操作連接時，優選過表達ADR1基因。用于在釀酒酵母中表達的優選的轉錄終止序列包括α-因子，GAPDH和CYC1基因的終止序列。在甲基營養酵母中表達基因的優選的轉錄控制序列包括編碼醇氧化酶和甲酸脫氫酶的基因的轉錄控制區。
核酸分子對本發明酵母細胞的轉染可通過將核酸分子引入細胞的任意方法來實現，所述方法包括，但不限于，擴散，主動轉運，超聲波浴，電穿孔，顯微注射，脂質轉染，吸附，和原生質體融合。用本領域技術人員已知的方法可以將轉染的核酸分子整合到酵母染色體中或保留在染色體外的載體上。本文詳細描述了帶有這種核酸分子的酵母載體的例子。如上所述，酵母胞質體，酵母空胞，和亞細胞性酵母膜提取物或其級分也可如下所述重組制備用所需的核酸分子轉染完整的酵母微生物或酵母原生質球，在其中產生抗原，然后用本領域技術人員已知的技術進一步處理微生物或原生質球，以制備含有所需抗原的胞質體，空胞或亞細胞性酵母膜提取物或其級分。
制備重組酵母載體和酵母載體表達抗原的有效條件包括能培養酵母菌株的有效培養基。通常有效培養基是含有可同化的碳水化合物源，氮源和磷酸鹽，以及適宜的鹽，礦物質，金屬和其它營養素，如維生素和生長因子的含水的培養基。培養基可包含復合營養素或是確定的極限培養基。本發明的酵母菌株可以培養在各種容器中，包括但不限于，生物反應器，錐形燒瓶，試管，微量滴定皿和培養皿(Petri dish)。在適合酵母菌株的溫度，pH和氧濃度條件下進行培養。這種培養條件是本領域技術人員的專業知識(參見，例如Guthrie等(eds.)，1991，Methods in Enzymology，vol.194，Academic Press，San Diego)。
本發明一個實施例中，作為酵母載體重組表達抗原的另一種情況，用酵母載體在細胞內裝載蛋白抗原或肽抗原，或用碳水化合物或其它作為抗原的分子。隨后，將現在細胞內含有抗原的酵母載體給予病人或裝入如樹突細胞的載體(下文描述)。如本文所用，肽含有少于或等于約30-50個氨基酸的氨基酸序列，蛋白含有超過約30-50個氨基酸的氨基酸序列；蛋白可以是多嵌合的。用作抗原的蛋白或肽可以如T細胞表位一樣小(即長度超過5個氨基酸)，也可是超過包含多表位的蛋白，蛋白片段，全長蛋白，嵌合蛋白或融合蛋白長度的任意合適大小。可以天然地或合成地衍生蛋白和肽；這種修飾包括，但不限于，糖基化，磷酸化，乙酰化，十四烷基化，異戊二烯化，棕櫚酰化，酰胺化和/或附加磷脂酰甘油肌醇。通過本領域技術人員已知的技術可以將肽和蛋白直接插入本發明的酵母載體，例如通過擴散，主動轉運，脂質融合，電穿孔，吞噬作用，凍融循環和超聲波浴。可直接裝載肽，蛋白，碳水化合物，或其它分子的酵母載體包括在制備之后，但在裝入樹突細胞之前裝載了抗原的完整酵母，以及原生質球，空胞或胞質體。或者，用裝載了抗原的完整酵母，然后由此制備原生質球，空胞，胞質體或亞細胞顆粒。這個實施例中，酵母載體中可裝入任意數量的抗原，從至少1，2，3，4或直至總數為數百或數千的抗原，正如通過裝載微生物，裝載哺乳動物腫瘤細胞，或其部分所提供。
本發明另一個實施例中，抗原與酵母載體物理結合。抗原與酵母載體的物理結合可通過現有技術中任何適合的方法，包括共價和非共價結合方法來實現，所述共價和非共價連接方法包括，但不限于，將抗原化學交聯到酵母載體的外表面或通過，例如使用抗體或其它結合伙伴將抗原與酵母載體的外表面生物連接。化學交聯可通過例如下述方法完成包括戊二醛連接，光親和性標記，碳化二亞胺處理，用能連接二硫鍵的化學制劑處理，用現有技術中其它標準交聯化學制劑處理。或者，化學制劑與酵母載體接觸，改變酵母膜脂質雙層的電荷或細胞壁的組成，使酵母的外表面更容易與具有特定電荷特征的抗原融合或結合。尋靶物質，如抗體，結合肽，可溶性受體，和其它配體也可摻入抗原作為融合蛋白或者與抗原結合來使抗原與酵母載體結合。
另一實施例中，通過一種較被動的，非特異性或非共價結合機制，如通過將酵母載體和抗原一起輕柔地混合在緩沖液或其它適合的配制劑中，使酵母載體和抗原彼此結合。
本發明一個實施例中，酵母載體和抗原都在細胞內被裝入，如樹突細胞和巨噬細胞的載體，形成本發明的治療性組合物或疫苗。下文詳細討論了在其中進行裝載兩種成分的各種形式。本文所用的術語“裝載”及其派生詞指將成分(例如，酵母載體和/或抗原)插入，引入或進入細胞(例如，樹突細胞)。在細胞內裝載成分指將成分插入或引入細胞的細胞內區室(例如，通過質膜并至少進入細胞漿，吞噬體，溶酶體，或細胞的一些細胞內空間)。將成分裝入細胞可參考任意技術，通過所述技術，成分被強制進入細胞(例如通過電穿孔)或被放置在環境中(例如，與細胞接觸或臨近細胞)，在此處經過一些過程(例如吞噬作用)成分將基本進入細胞。裝載技術包括，但不限于，擴散，主動轉運，脂質體融合，電穿孔，吞噬作用，和超聲波浴。一個優選實施例中，采用被動機制用裝載了酵母載體和/或抗原的樹突細胞，這種被動機制包括樹突細胞對酵母載體和/或抗原的吞噬作用。
本發明一個實施例中，疫苗組合物還可包括生物反應修飾化合物，或產生這種修飾物的能力(即，通過用編碼這種修飾物的核酸分子轉染)，雖然這種修飾物對獲得本發明的強免疫反應不是必需的。例如，可用至少一種抗原和至少一個生物反應修飾物轉染或裝載入酵母載體。生物反應修飾物是能調節免疫反應的化合物。一些生物反應修飾物能刺激保護性免疫反應，而另一些能抑制有害免疫反應。一些生物反應修飾物優先增強細胞介導的免疫反應，而另一些優先增強體液免疫反應(即能刺激免疫反應，其中與體液免疫反應比較，細胞免疫水平提高，或反之亦然)。本領域技術人員已知許多技術來測量免疫反應的刺激或抑制，以及從體液免疫反應中區分細胞免疫反應。
適合的生物反應修飾物包括細胞因子，激素，脂質衍生物，小分子藥物和其它生長調節劑，例如但不限于，白介素2(IL-2)，白介素4(IL-4)，白介素10(IL-10)，白介素12(IL-12)，γ干擾素(IFN-γ)，胰島素樣生長因子I(IGF-1)，轉化生長因子β(TGF-β)，類固醇，前列腺素和白三烯。酵母載體表達(即產生)，并可能是分泌IL-2，IL-12和/或IFN-γ的能力優先增強細胞介導的免疫，而酵母載體表達，并可能是分泌IL-4，IL-5和/或IL-10的能力優先增強體液免疫。
本發明的酵母載體可與廣泛多種的能保護動物對抗疾病的抗原結合，并且將酵母載體和抗原裝入樹突細胞或巨噬細胞以形成本發明的疫苗能進一步增強這種能力。相應的，使用本發明的治療性組合物或疫苗的方法優先誘發動物的免疫反應，因此保護動物對抗適用于誘發免疫反應的疾病，包括癌癥或傳染性疾病。本文所用的術語“保護對抗疾病”指減輕疾病癥狀；減少疾病發生，和/或降低疾病嚴重性。保護動物可指當給予動物時，本發明治療性組合物預防疾病從發生到和/或治愈或緩解疾病癥狀，體征或起因的能力。因此，保護動物對抗疾病包括預防疾病發生(預防性治療或預防性疫苗)和治療患病的或正經歷疾病初期癥狀的動物(治療性治療或治療性疫苗)。具體的，通過誘導有益的或保護性免疫反應，在某種情況中，可能需要另外抑制(例如，減少，抑制或阻斷)過度活躍的或有害的免疫反應，從而誘發動物的免疫反應來實現保護動物對抗疾病。術語“疾病”指任何偏離動物正常健康狀況的情況，包括出現了疾病癥狀的狀態，以及已發生了偏離(例如，感染，基因突變，遺傳缺陷等)但癥狀尚未顯現的情況。
更具體的，當通過本發明的方法給予動物時，本文所述的疫苗優選產生以下結果，包括緩解疾病(例如，減少至少一種疾病癥狀或臨床表現)，消除疾病，減少伴隨疾病的腫瘤或損害，消除伴隨疾病的腫瘤或損害，預防或緩解由原發性疾病出現導致的繼發性疾病(例如，原發癌導致的轉移癌)，預防疾病，和刺激對抗疾病的效應細胞免疫。
可用本發明的方法和組合物治療或預防的癌癥包括，但不限于，黑色素瘤，鱗狀細胞癌，乳腺癌，頭頸癌，甲狀腺癌，軟組織肉瘤，骨肉瘤，睪丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮膚癌，腦癌，脈管肉瘤，血管肉瘤，肥大細胞癌，原發性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃腸癌，腎細胞癌，造血細胞瘤形成和轉移癌。用本發明的治療性組合物治療的癌癥特別優選包括原發性肺癌，肺轉移癌，原發性腦癌和轉移性腦癌。治療的腦癌優選包括，但不限于，多形性成膠質細胞瘤。治療的肺癌優選包括，但不限于，非小細胞癌，小細胞癌和腺癌。本發明的治療性組合物對于誘發動物的免疫反應以治療下述癌癥中形成的腫瘤，包括惡性的和良性的腫瘤是有用的。優選，腫瘤抗原在患癌癥的動物的組織中的表達產生下述結果緩解癌癥，減少伴隨癌癥的腫瘤，消除伴隨癌癥的腫瘤，預防轉移癌，預防癌癥，和刺激對抗癌癥的效應細胞免疫。
本發明的一個特別優點是無需將治療性組合物與免疫促進劑，如佐劑或載體一起給予，因為酵母疫苗和抗原的組合在缺少附加的佐劑時也能誘發有效的免疫反應，將這些成分裝入樹突細胞能再次增強免疫反應，正如系列申請US 09/991,363(出處同上)所描述的。然而這個特點并不排除在本發明組合物中使用免疫促進劑。因此，一個實施例中，本發明的組合物可包括一種或多種佐劑和/或載體。
通常，佐劑是通常增強動物對特定抗原的免疫反應的物質。適合的佐劑包括，但不限于，弗氏佐劑；其它細菌細胞壁成分；鋁基鹽；鈣基鹽；硅石；多核苷酸；類毒素；血清蛋白；病毒外殼蛋白(coat protein)；其它細菌衍生的制品；γ干擾素；嵌段共聚物佐劑，如Hunter′s Titermax佐劑(CytRxTM，Inc.Norcross，GA)；Ribi佐劑(從Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT獲得)；和皂苷及其衍生物，如Quil A(從Superfos Biosector A/S，Denmark獲得)。
通常，載體是增加治療性組合物在接受治療動物中的半衰期的化合物。適合的載體包括，但不限于多聚體可控釋放配制劑，生物可降解埋植劑，脂質體，油，酯和乙二醇。
本發明的治療性組合物還可包含一種或多種藥物可接受賦形劑。本文中，藥物可接受賦形劑指任何適于將用于本發明方法的治療性組合物傳遞到體內或活體外(ex vivo)的適宜位置的物質。優選藥物可接受賦形劑能使酵母載體(或含有酵母載體的樹突細胞)保持一種形式，使得直到酵母載體或細胞到達靶細胞，組織，或體內位置，酵母載體(與抗原結合)或樹突細胞(裝載了酵母載體和抗原)能在靶位置誘發免疫反應(注意靶位置可以是全身性的)。本發明適合的賦形劑包括能轉運，但不能特異性地將疫苗定向到位置(本文中也稱作非尋靶載體)的賦形劑或配方。藥物可接受賦形劑的例子包括，但不限于水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖生理鹽水，林格溶液，葡萄糖溶液，含血清溶液，Hank′s液，其它含水的生理平衡溶液，油，酯，和乙二醇。含水載體可包含通過，例如提高化學穩定性和等滲性從而接近受者生理條件所需的適宜的輔助物質。
適合的輔助物質包括，例如，乙酸鈉，氯化鈉，乳酸鈉，氯化鉀，氯化鈣和用于制備磷酸鹽緩沖液，Tris緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液的其它物質。輔助物質還可包括防腐劑，如硫柳汞，間甲苯酚或鄰甲苯酚，福爾馬林和苯甲醇。
本發明包括將本發明組合物或疫苗傳遞給動物。給予過程可在活體外或體內進行。活體外給予指在患者體外進行部分調節步驟，如將本發明組合物給予一群在將酵母載體和抗原裝入細胞的條件下，從患者收集的細胞(樹突細胞)，并將該細胞回輸給病人。可用任意合適的給予方式將本發明治療性組合物回輸給病人，或給予病人。
給予包括裝載了酵母載體和抗原的樹突細胞的疫苗或組合物可以是全身的，粘膜的和/或臨近靶位置的(例如，臨近腫瘤)。優選的給予途徑對本領域技術人員是顯而易見的，依賴于所預防的或治療的情況類型，所使用的抗原，和/或靶細胞群或組織。優選的給予方法包括，但不限于，靜脈內給予，腹膜內給予，肌內給予，結節內(intranodal)給予，冠狀動脈內給予，動脈內給予(例如，頸動脈內)，皮下給予，經皮傳遞，氣管內給予，皮下給予，關節內給予，心室內給予，吸入(例如氣溶膠)，顱內，脊柱內，眼內，耳內，鼻內，口腔，肺部給予，導管注入，和直接注射入組織。特別優選的給予途徑包括靜脈內，腹膜內，皮下，皮內(intradermal)，結節內，肌內，經皮，吸入，鼻內，口腔，眼內，關節內，顱內和脊柱內。非胃腸道傳遞可包括皮內，肌內，腹膜內，胸膜內，肺內，靜脈內，皮下，心房導管和靜脈導管途徑。耳部傳遞可包括滴耳劑，鼻內傳遞可包括滴鼻劑或鼻內注射，眼內傳遞可包括滴眼液。氣溶膠(吸入)傳遞也可用現有技術中的標準方法進行(參見，例如Sibling等，，Proc.Natl.Acad Sci.USA18911277-11281，1992，全部引入本文作為參考)。例如，一個實施例中，本發明的組合物或疫苗可被配制成適于用適合的吸入裝置或噴霧器噴霧傳遞的組合物。口腔傳遞可包括通過口腔攝取的固體和液體，對發展粘膜免疫是有益的，并且包含酵母載體的組合物可以很容易地制備成口服的，例如片劑或膠囊，以及配制到食品和飲料產品中。調節粘膜免疫的其它給予途徑對治療病毒感染，上皮癌，免疫抑制疾病和其它影響上皮區域的疾病是有益的。這種途徑包括支氣管，皮內，肌內，鼻內，其它吸入，直腸，皮下，局部，經皮，陰道和尿道途徑。
更優選的傳遞途徑是將組合物或疫苗傳遞到呼吸系統的任意途徑，包括但不限于，吸入，鼻內，氣管內，和類似途徑。如上文所討論的和實施例中所顯示的，本發明人已證明，至少與皮下傳遞相比，通過這種給予途徑給予本發明疫苗能產生增強的結果，并對治療腦癌和肺癌特別有效。
根據本發明，有效的給予方法(即，以有效的方式給予疫苗或治療性組合物)包括在患有疾病或狀態或可能感染疾病或狀態的動物中誘發免疫反應，優選保護動物對抗疾病的適合的劑量參數和給予方式。可用現有技術中的標準方法測定對特定疾病的有效劑量參數。這種方法包括，例如，測定存活率，副反應(即毒性)和疾病的進展或退化。具體的，當治療癌癥時，本發明治療性組合物劑量參數的有效性可通過評估應答率來測定。這種應答率指在一群病人中接受治療的病人有反應呈部分或完全緩解的百分數。可通過，例如測量腫瘤大小或顯微鏡檢查組織樣品中癌細胞的存在，測定所述緩解。
根據本發明，適合的單劑量是在一段適合的時間段內給予一次或多次時，能誘發動物的抗原特異性免疫反應的劑量。劑量可根據所治療的疾病或狀態而變化。例如治療癌癥時，適合的單劑量可根據所治療的癌癥是原發性腫瘤還是轉移性癌癥而變化。本領域技術人員根據動物的大小和給予途徑可以輕易地確定合適的給予單劑量。
本發明治療性組合物或疫苗的適合的單劑量是在一段適合的時間段內給予一次或多次時，以足以誘發抗原特異性免疫反應的量，將酵母載體和抗原有效的提供到指定的細胞類型，組織或病人體內的劑量。例如，一個實施例中，本發明酵母載體的單劑量是從約1×105至約5×107酵母細胞等價物/給予組合物的生物體的公斤體重。更優選，本發明酵母載體的單劑量是從約0.1Y.U.(1×106細胞)至約100Y.U.(1×109細胞)/劑(即每個生物體)，包括以0.1×106細胞為增量的任意中間劑量(即，1.1×106，1.2×106，1.3×106......)。這種劑量范圍可有效的用于任意大小的任意生物體，包括小鼠，猴，人等。當通過將酵母載體和抗原裝入樹突細胞來給予疫苗時，優選本發明疫苗的單劑量是從約0.5×106至約40×106樹突細胞/人/次。優選，單劑量從約1×106至約20×106樹突細胞/人，更優選從約1×106至約10×106樹突細胞/人。當針對抗原的免疫反應已經減弱或需要提供針對特定抗原或抗原群的免疫反應或需要誘導針對特定抗原或抗原群的記憶應答時，優選給予“加強劑量”的治療性組合物。可從初次給予之后的約2周至幾年給予加強劑量。一個實施例中，給予時間表是在約1至約6個月內，約1至約4次給予約1×105至約5×107酵母細胞等價物的組合物/生物體每公斤體重。
本領域技術人員知道給予動物的劑量數量依賴于疾病的程度和個體病人對治療的反應。例如，大腫瘤比小腫瘤需要更多劑量，慢性疾病比急性疾病需要更多劑量。然而一些情況中，如果長了大腫瘤的病人比長了小腫瘤的病人對治療性組合物的反應更好，那么長了大腫瘤的病人比長了小腫瘤的病人需要較少的劑量。因此，在本發明范圍內，適合的劑量數量包括治療指定疾病所需的任意數量。本發明的另一方面，治療疾病或情況，如癌癥的方法可與其它治療方法聯合以增強治療效果。例如，治療癌癥時，通過外科手術切除動物的腫瘤之后，再給予本發明的疫苗。另一方面，在通過外科手術切除動物的腫瘤，并且進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植之后，再給予疫苗(下文討論)。另一方面，在通過外科手術切除動物的腫瘤，進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植，以及輸注同種異體的供體淋巴細胞之后，再給予疫苗。
本發明另一個實施例涉及一種治療癌癥病人的方法，包括(a)用能有效建立穩定混合的骨髓嵌合狀態的不引起骨髓重度抑制的干細胞轉移來治療癌癥病人，其中干細胞由同種異體的供體提供；(b)將從同種異體的供體處獲得的淋巴細胞給予病人；和(c)在步驟(b)之后，將含有酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗給予病人。Luznik等，(Blood101(4)1645-1652，2003)和其它現有技術(例如Appelbaum等，2001，Hematology pp.62-86)已經詳細描述了通過不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植建立穩定的混合骨髓嵌合狀態的過程。簡單的說，用非致病的，不引起骨髓重度抑制的的全身輻射和免疫抑制治療病人(例如，結合輻射和化療)，并給予來自同種異體供體的含有干細胞(例如骨髓)的一群細胞。這種治療將在受者病人中建立穩定的混合骨髓嵌合狀態(即同時存在供體和宿主免疫細胞)。在Luznik等的方法中，隨后給受者輸注供體的淋巴細胞，然后是自體腫瘤細胞疫苗，GM-CSF來源和組織相容性抗原來源。這種治療導致有顯著數量的試驗動物以無腫瘤狀態長時間存活。
本發明通過結合不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植和本發明基于酵母的疫苗的策略，改進了不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植和腫瘤細胞免疫方法。如實施例5所示，本發明的方法在治療腫瘤方面與Luznik等的方法一樣有效，但不需要使用來自受者的自體腫瘤抗原，也不需要使用以前方法中所提供的生物反應修飾物或其它佐劑(例如，GM-CSF和組織相容性抗原來源)。本發明的改良方法提供了另外的優點，可在疫苗中使用廣泛多種的非常特異性抗原選擇和組合，能提供針對廣泛范圍癌癥患者的疫苗，而以前使用來自受者的自體腫瘤細胞的方法，對病人的效果有限。本發明還提供了用本發明基于酵母的疫苗免疫接種干細胞和淋巴細胞供體，所述疫苗與給予受者的疫苗一樣，表達相同的或稍微不同的抗原，并期望它能進一步增強疫苗的效力。
本發明這個實施例中，由同種異體的供體提供干細胞，通過不引起骨髓重度抑制的干細胞轉移有效建立穩定混合的骨髓嵌合狀態以治療癌癥病人的步驟，如現有技術中(例如Luznik等，出處同上；Appelbaum等，2001，Hematology pp.62-86)所詳細描述的那樣進行。步驟(b)的同種異體淋巴細胞輸注可用任意合適的方法，包括通過，如現有技術中已知的Ultrapheresis技術，從供體的外周血收集同種異體淋巴細胞并輸注給受者病人。最后，如前文所述，將本發明基于酵母的疫苗給予病人。這個實施例一方面，所述方法進一步包括在步驟(a)之前，給予供體含有酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗。另一方面，所述方法包括在進行步驟(a)之前，切除病人的腫瘤。
本發明的方法中，可將疫苗和治療性組合物給予脊椎動物綱的任何成員，哺乳動物，包括但不限于，靈長類，嚙齒類，家畜和家養寵物。家畜包括用來消費的或生產有用產品(例如，生產羊毛的綿羊)的哺乳動物。優選要保護的哺乳動物包括人，狗，貓，小鼠，大鼠，山羊，綿羊，牛，馬，和豬，特別優選人。根據本發明，術語“病人”可用來描述是接受本文所述的診斷，預防或治療處理的任意動物。
提供下述試驗結果用來說明而不是意圖限制本發明的范圍。
實施例實施例1下述實施例證明了給予含有癌抗原的基于酵母的疫苗來體內治療非小細胞肺癌(NSCLC)。
Ras突變在人，小鼠，大鼠和倉鼠的肺部腺癌中是常見的。事實上，ras原癌基因家族的突變是人類癌癥和試驗動物腫瘤中最常見的癌基因相關突變。本發明人檢驗了現在被設計成直接針對突變蛋白特異性ras突變的基于酵母的疫苗，能否誘導導致小鼠肺部腺癌模型的腫瘤破壞的有效(productive)免疫反應。試驗的總體目標是構建能用于對抗人類肺癌的疫苗。
本文所述的用于試驗的模型是小鼠模型，其中用烏拉坦(氨基甲酸乙酯，它代謝成公知致癌代謝產物——氨基甲酸乙酯(vinyl carbamate))注射A/J小鼠。在約6周內可看到超常增生，8-10周時出現良性腫瘤，8個月后出現惡性腫瘤的首個信號。10個月時，腫瘤占據整個肺葉，12個月時小鼠因呼吸性窘迫而死亡。這個試驗中，腫瘤細胞中表達K-ras單突變，該突變位于編碼第61位氨基酸殘基的密碼子中(也稱作密碼子61)。
本發明人制備了Ras61-VAX(GlobeImmune)，它是經改造表達具有密碼子61(對應于SEQ ID NO5的K-ras序列)突變的小鼠K-ras蛋白的酵母菌株，所述蛋白是在自發誘導的小鼠肺部腫瘤和小鼠肺部腫瘤細胞系表達的突變K-ras蛋白。對用直接針對密碼子61突變的Ras61-VAX免疫的動物，檢測它們在用烏拉坦誘導模式誘導后，防止腫瘤發展或減小腫瘤大小的能力。
結果證明用Ras61-VAX免疫的動物顯示出明顯的對抗通過將小鼠暴露于烏拉坦而自發誘導的原始(pre-existing)肺腫瘤的保護作用。與對照動物比較，免疫動物的腫瘤數量和腫瘤大小都顯著減小(圖1)。這些結果證明了用本發明人的表達突變K-ras蛋白的基于酵母的疫苗治療和/或預防癌癥引起的疾病來進行治療性介入的可行性和實用性。
另外，圖2顯示了一個試驗結果，其中在1，8，22和36天，通過皮下給予Ras61-VAX(只有Q61R)或通過鼻內比較皮下給予表達具有兩個突變(RasV-VAX；G12V+Q61R)的突變Ras的酵母疫苗來免疫C57BL/6小鼠。在第29天，皮下給予10,000 CMT64細胞攻擊小鼠，其中CMT64細胞內源性表達12位氨基酸由甘氨酸變為纈氨酸(G12V)的突變K-ras蛋白。圖2顯示了第59天時(攻擊30天后)腫瘤的大小和帶有腫瘤的動物數/動物總數的比值(柱形上面)。如圖2所示，給予Ras61-VAX再次提供了對肺腫瘤生長的最低保護(7只動物中有2只是無腫瘤的)，給予RasV-Vax通過顯著減小腫瘤體積和數量(皮下接種的8只動物中有4只是無腫瘤的，鼻內接種的8只動物中有7只是無腫瘤的)從而提供了特異性免疫治療性保護作用。令人吃驚的是，與皮下給予相同疫苗比較，鼻內給予疫苗的效果更好。這些結果強調了用基于酵母的疫苗產品進行分子免疫治療的特異性。這些研究揭示了如下需求對腫瘤生長的免疫介導抵制作用依賴于給予含有帶有相應突變氨基酸的腫瘤抗原的基于酵母的疫苗。
實施例2下述實施例證明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在體內治療腦瘤的用途。
在下述試驗中，用Gag蛋白表達疫苗(GI-VAX)或PBS(模擬注射)通過皮下注射或鼻內給予，免疫每組的5只小鼠兩次(第0天和第7天)，隨后在第14天用表達Gag蛋白的腫瘤攻擊。兩次獨立研究的結果顯示，與模擬注射小鼠比較，并且驚人的是，與通過皮下途徑接受疫苗的動物比較，通過鼻內給予接受疫苗的小鼠對抗顱內腫瘤攻擊的存活延長(圖3)。皮下免疫確實能保護動物對抗皮下腫瘤攻擊(數據未顯示)。這些結果顯示當鼻內給予時，本發明的方法可有效使用，并且給予到呼吸道對顱內腫瘤有效，而其它給予途徑無效。
實施例3下述實施例證明含有人類癌抗原(表皮生長因子受體；EGFR)的基于酵母的疫苗在體內治療黑色素瘤和腦瘤的用途。
免疫治療策略誘發保護性免疫反應的能力依賴于多種重要變量。首先，疫苗必須能夠激活免疫系統識別靶抗原，即提供“佐劑”活性。對于基于酵母的疫苗的情況，發明人先前已證明樹突細胞對酵母的吸收上調了MHC I類和II類蛋白的表達，并引發細胞因子產生，這是佐劑活性的標志(Stubbs等Nature Med(2001)7，625-629)。酵母激活“先天的”免疫系統的程度與使用來自細菌細胞壁的脂多糖(LPS)所觀察到的程度相當。第二，疫苗必須促進靶抗原的免疫顯性表位到免疫系統的表面遞呈。發明人先前已證明基于酵母的載體能非常有效的傳遞抗原表位以刺激免疫系統細胞介導(CTL)的反應和體液(抗體)反應(Stubbs等，Nature Medicine(2001)7，625-629)。第三，也是最重要的，刺激免疫系統必須引發在體內需要處的免疫反應。如下所示，令人吃驚的是，疫苗的給予途徑能影響對抗在體內不同位置發展的腫瘤的免疫反應的效力。
為了檢驗EGFR-tm VAX(表達以EGFR作為癌抗原的本發明的酵母疫苗)的免疫原性，必需修飾攻擊試驗所用的神經膠質瘤細胞。轉染B16小鼠黑色素瘤細胞和9L大鼠神經膠質瘤細胞以表達人EGFR(分別是B16-E細胞和9L-E細胞)。隨后將克隆的9L-E細胞系分成高水平，中間水平或低水平表達hEGFR的細胞。因此，B16-E細胞和9L-E細胞擁有包括在酵母疫苗中的抗原(即人EGFR)，并提供了一個惡性細胞中EGFR表達改變的適宜的人神經膠質瘤替代模型。研究目標是要證明，基于酵母的傳遞載體引發保護性免疫反應，對抗大鼠顱內植入的致死劑量的9L-E神經膠質瘤細胞的攻擊。
B16-E細胞和9L-E細胞克隆成同質的，并且用流式細胞術測量顯示表達人EGFR。為確保人EGFR蛋白的異源表達在不給予疫苗時不會導致腫瘤的免疫排斥，首先確定轉染的B16-E能夠在小鼠中形成皮下腫瘤(數據未顯示)。轉染的9L-E細胞在大鼠皮下和顱內形成腫瘤(數據未顯示)。現在建立這個狀態以檢驗EGFR-tm VAX酵母疫苗保護動物對抗B16-E腫瘤(小鼠)及9L-E腫瘤(大鼠)攻擊的效力。
初步的疫苗攻擊研究是設計用來確定皮下接種EGFR-tm VAX對保護動物對抗皮下植入的致死劑量的B16-E黑色素瘤細胞攻擊是否有效。這個方法代表了發明人檢測有效誘發腫瘤細胞殺滅的新的靶腫瘤抗原的實用性的標準測量方法之一。這個研究證明與模擬免疫動物比較(1/6的動物是無腫瘤的)(數據未顯示)，用EGFR-tm VAX接種能保護動物對抗B16-E腫瘤的攻擊(4/6的動物是無腫瘤的)。這些結果證明EGFR可作為適合的誘發細胞介導的免疫反應的抗原，并且EGFR-tm疫苗引發抗腫瘤攻擊的保護性免疫反應。因此，下一步是檢驗EGFR-tm VAX抗大鼠顱內9L-E神經膠質瘤攻擊的效力。
發明人在上述試驗中還證實，當鼻內給予(i.n.)基于酵母的疫苗時，能提供與皮下免疫接種抗皮下黑色素瘤攻擊的疫苗相等的保護作用(數據未顯示)。因此，接下來的試驗檢驗了，已證明能誘發抗皮下B16黑色素瘤腫瘤攻擊的保護性免疫反應的基于酵母的免疫治療性EGFR-VAX產物，能否提供抗顱內腫瘤攻擊的免疫治療性保護作用。
通過大鼠模型中用神經膠質瘤細胞顱內攻擊進一步驗證了EGFR-tmVAX的效力以及給予途徑的影響。在0，7，21天，通過鼻內(i.n.)或皮下(s.c.)途徑，用表達hEGFR的約20,000,000酵母細胞(EGFR-vax)或酵母(只有載體)免疫動物(每組8只動物)。通過顱內給予1,250個未轉染的大鼠9L神經膠質瘤(只有9L)或表達hEGFR的9L來攻擊免疫動物。每天監測大鼠的體重，體重減輕預示動物即將死亡。
結果(圖4)證明，對于表達腫瘤抗原的大鼠9L神經膠質瘤的致死性顱內腫瘤攻擊，50％用EGFR-VAX酵母免疫的動物被完全保護，但沒有動物抵抗缺乏腫瘤抗原的腫瘤生長(即疫苗誘導了抗原特異性免疫)。另外，死于致死性攻擊的剩余EGFR-VAX免疫動物還證明，與對照動物比較，存活時間延長。
此外，與皮下免疫比較，鼻內免疫動物的存活率的統計學上顯著改善是吸引人和驚人的，并且再現了上述(見實施例2)關于對抗小鼠顱內(黑色素瘤)腫瘤攻擊的保護作用的數據。
因為認為這個大鼠顱內腫瘤攻擊模型能最接近地反映人神經膠質瘤，這些研究的積極數據對進入臨床試驗提供了極好的臨床前數據。另外的研究可包括劑量改變，時間表，外科切除研究，以及用9L腫瘤再次攻擊9L-E存活者以檢驗免疫系統現在是否“認知”9L神經膠質瘤中的另外(未知)腫瘤抗原，以及檢驗表達EGFR-vIII突變蛋白的酵母載體，并將建立開始制造臨床級別的疫苗產品的基礎。
上述數據指出，雖然多種免疫途徑可能對破壞外周腫瘤是有效的，本發明基于酵母的疫苗對啟動肺部獨有的效應細胞特別有效。因為基于酵母的疫苗能啟動獨有的效應細胞前體，所以通過鼻內免疫激活的免疫細胞對穿過血腦屏障影響顱內腫瘤生長進程特別有效。因此，在設計針對腦腫瘤的有效的基于酵母的疫苗時，免疫途徑是一個重要的和先前未認識到的成分。因為基于酵母的疫苗能非常容易的用于多種免疫途徑，該疫苗必將以迄今未被認識到的治療某些癌癥的潛力，唯一地激發高度特異性的免疫反應。
實施例4下述實施例證明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在體內治療腎癌的用途。
2001年，美國將診斷出約31,800例腎細胞癌(RCC)個體，11,600人死亡；代表了全部癌癥的2-3％，以及所有死于腫瘤的2％。雖然病人通常表現出血尿三聯癥，腹部痞氣，疼痛和體重減輕，但只有較少數目前診斷出的病人具有這些癥狀，因為偶然診斷的頻率提高了。很多診斷出患有疾病的病人，雖然通過外科手術有可能治愈，但將會復發，因為細胞已經到達血管系統。此外，轉移性RCC的治療方法非常有限。激素療法和化療方法產生＜10％的反應率，并且存活沒有顯著改變。然而人們仍長期關注免疫學治療對疾病的應用。除了自發性消退這種罕見情況，α干擾素和白介素-2都已顯示出“顯著”活性，明顯的少數病人對治療有反應，一些病人完全緩解。雖然存在少量預期隨機試驗，細胞因子工作組(Cytokine Working Group)最近的摘要證明，與門診病人皮下給予IL-2/干擾素產生的約50％的反應率相比，高劑量IL-2產生8％完全反應率和25％全部反應率。總之，雖然清楚的顯示出對RCC的活性，迄今所使用的方法缺乏對疾病的特異性和效力。
超過60％的RCCs帶有VHL失活突變，VHL作為RCC“看門”基因，類似于結腸癌中APC功能。VHL編碼的蛋白是E3泛肽-連接(SCF)復合物的基本成分，叫做VHL/elonginCB/Cul-2(VCB)，靶向特定蛋白以通過26S蛋白酶體進行破壞。因為很多VHL突變導致錯義或移框蛋白，所以將產生新的、被鑒定為腫瘤特異性抗原的抗原表位。下述試驗驗證了如下假設引入本發明新的、基于酵母的疫苗后，RCCs的突變VHL蛋白能定向免疫反應。
小鼠中沒有可比較的突變VHL介導的腫瘤。因此，本發明人使用已知的人VHL序列(SEQID NO16)和克隆的小鼠VHL(SEQ ID NO17)來制備編碼野生型或帶有影響Y98或R167(對應于鼠序列SEQ ID NO17)的兩個特定突變的鼠VHL序列的表達構建體。這兩個位置的突變與人腫瘤中頻繁發現的熱點相對應。位置98的酪氨酸形成針對VHL靶，如HIP1α的表面暴露的結合位點，而位置167的精氨酸對穩定α螺旋H1很重要。這些殘基非常易于溶解并且易于被免疫系統識別。如下述BLAST對比所顯示的，人和鼠VHL氨基酸序列在位置58至190，包括兩個熱點，幾乎是同一的。
58 酪氨酸98 117hVHLRPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPVWLNFDGEPQPYPTLPPGTGRRIHSYRGHLWmVHLRPRPVLRSVNSREPSQVIFCNRSPRVVLPLWLNFDGEPQPYPILPPGTGRRIHSYRGHLW24 83
118 精氨酸167177hVHLLFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPI FANITLPVYTLKERCLQVVRSLVKPENYRRmVHLLFRDAGTHDGLLVNQTELFVPSLNVDGQPI FANITLPVYTLKERCLQVVRSLVKPENYRR84 143178 211hVHLLDIVRSLYEDLEDHPNVQKDLERLTQERIAHQRMSEQ ID NO16mVHLLDIVRSLYEDLEDYPSVRKDIQRLSQEHLESQHLSEQ ID NO17144 177因此，由這些鼠構建體獲得的結果可以合理準確地估計在人RCC中的效力。Y98很頻繁地突變成組氨酸，而R167典型地突變成谷氨酰胺或色氨酸。R167還受移框突變的影響；R167密碼子中插入單個G殘基將產生一個新的移框蛋白(REPSQA)，后面是終止密碼子(TGA)。本發明人構建了Y98位組氨酸錯義突變(Y98H)和R167位移框突變(R167fr)以產生概括了已知VHL突變特征的潛在的免疫原性突變VHL蛋白。移框VHL蛋白將表達一個更長的新表位，并可能因此更具免疫原性。單個錯義Y98H突變是對這種方法更嚴格的試驗，因為必需使單個氨基酸改變。用定點突變方法和PCR將這些突變引入全長VHL序列。簡單的說，用特異性PCR引物引入突變和早熟終止子產生R133突變。將這個突變體和野生型(WT)VHL克隆到用于在酵母中表達的酵母表達載體pYEX-BX，并克隆到用于在黑色素細胞中轉染和表達的哺乳動物表達載體pUP。用已證明是成功的Clontech的定點誘變方法產生Y64點突變。
插入物克隆到酵母表達載體YEX-BX和哺乳動物表達載體pUP以便在黑色素瘤細胞中轉染和表達。為達到這個目的，發明人改造了酵母以表達VHL蛋白并驗證了各種疫苗制劑在小鼠中的效力。pYEX-BX質粒包含一個在轉化釀酒酵母之后，可控誘導鼠VHL蛋白的銅誘導性啟動子。
帶有受組成型CMV早期啟動子控制的VHL基因的表達載體轉染到B16黑色素瘤細胞中。細胞系在體外生長并且當注射到小鼠中時長成腫瘤，這證明了突變VHL構建體自身對所轉染的細胞不是免疫原性的或致死性的。首次接種/腫瘤攻擊試驗由下述組成在0天和第7天，通過皮下注射20×106表達R133截短突變體(VHLtrunc)的酵母來免疫18只6周齡的C57B6小鼠。第14天，通過如下所述的皮下注射來腫瘤攻擊小鼠6只小鼠接受2.5×104未轉化的B16；6只小鼠接受2.5×104表達VHLwt的B16；6只小鼠接受2.5×104表達VHLtrunc的B16。攻擊后21天，評價小鼠腫瘤生長。試驗結果在下表1中概括。
表1

這些結果顯示，雖然VHLtrunc疫苗(靶向截斷前的9個獨特的氨基酸)提供對抗B16 VHL tMut腫瘤攻擊的保護作用，但疫苗不能保護小鼠對抗未轉染的B16或B16 VHLwt的攻擊。因此，接種方法誘導強免疫反應，但這種反應可能僅局限于針對動物已經接種過的抗原。然而，因為此截短變體產生不同于野生型VHL的長序列，所以有可能更加微細的突變(即，只有一個殘基)可產生對突變體和野生型的免疫反應。
第2次免疫/攻擊試驗中(表2)，用野生型VHL疫苗(mVHLwtVAX)或上述截短突變的VHL疫苗(mVHLtrunc VAX)免疫小鼠。將小鼠分組，如上述首次試驗所述，用未轉染的B16，表達野生型VHL的B16或表達突變VHL的B16攻擊。結果再次顯示，用截短VHL疫苗免疫導致對腫瘤攻擊的保護作用，并再次證實不能保護這些小鼠對抗野生型腫瘤的攻擊。用野生型腫瘤免疫的小鼠不能保護其對抗野生型腫瘤的攻擊，這表示疫苗不能破壞對野生型蛋白的耐受。然而，當用表達突變VHL的腫瘤攻擊時，50％經野生型蛋白免疫的小鼠被保護，預示突變VHL在某種程度上被鼠免疫系統識別。考慮到基于酵母的疫苗在這些試驗中的特異性和功效，生產靶向人類中最常見突變的酵母將是一個相對簡單的任務，為將其作為人類治療性疫苗的潛在免疫方法鋪平了道路。
表2


實施例5下述實施例證明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在體內治療乳腺癌的用途。
處于實體器官，包括肺，乳房和結腸的癌癥早期階段的多數病人，可通過外科手術切除原發性腫瘤而治愈。不幸的是，很多病人出現了或復發了造血性轉移，除了極少數例外，這種造血性轉移不能通過現有方式，包括外科手術，放射療法，化療，或同種異體干細胞移植(alloSCT)而治愈。同樣，雖然新近改造的癌癥疫苗對最近建立疾病的動物模型顯示出顯著的效力，但一旦腫瘤建立超過5天或已出現了轉移，疫苗作為單一試劑通常是無效的(Borello等，2000，Blood 953011-3019)。部分原因是腫瘤的建立典型地伴隨著對腫瘤抗原耐受的誘導，必需打破這種耐受才能實現成功的治療(Ye等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91391 6-3920；Staveley-O′Carroll等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 951178-1183)。在不引起骨髓重度抑制的alloSCT之后的免疫接種產生增加的改進，但仍不能影響建立超過3天的腫瘤(Anderson等，2000，Blood 952426-2433)。Luznik等(出處同上，全部引入本文作為參考)最近報道了在小鼠乳腺癌模型中，在達到穩定混合骨髓嵌合狀態的不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植(NST)之后的免疫接種，產生能消除原發性腫瘤建立2周后的轉移，并且不誘發移植物抗宿主疾病(GVHD)的顯著增強的腫瘤特異性免疫反應。這個只涉及免疫接種或涉及自體SCT或完全alloSC之后免疫接種的策略，其顯著增強的功效依賴于建立混合嵌合狀態時相互作用的宿主和供者免疫系統的作用。
Luznik等的試驗中，給予的疫苗由受輻射的自身腫瘤細胞混合粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)組成。在下面的實驗中，本發明人指出基于酵母的疫苗可取代使用受輻射的自身腫瘤細胞混合產生GM-CSF的細胞，在相同的動物模型中產生等效結果。簡單的說，本發明人制備了基于酵母的疫苗，含有用在CUP1啟動子控制下編碼小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)的gp70蛋白的酵母表達載體轉導的釀酒酵母(Yeastgp70-IT)。MMTV感染Balb/c小鼠引發的自發性乳腺癌中表達了gp70蛋白。根據Luznik等的試驗步驟，在第0天，Balb/c小鼠皮下注射10,000個4T1腫瘤細胞(表達MMTVgp70的Balb/c衍生的自發性乳腺癌細胞)。以MHC相容性B10.D2為供體進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植(NST)之前，第13天切除皮下腫瘤。NST如下組成第13天200cGyTBI，第14天靜脈給予10,000,000個供體骨髓細胞，第17天腹膜內給予200mg/kg環磷酰胺。接受了B10.D2骨髓的小鼠隨后(a)在第28天接受20,000,000個B10D.2脾細胞，不再進一步治療(沒有疫苗)；或(b)在第28天接受20,000,000個B10D.2脾細胞，在第31天接受自體腫瘤疫苗(106個受輻射的4T1腫瘤細胞混合5×105個分泌GM-CSF、MHC陰性的旁觀(bystander)細胞系B78H1/GM-CSF)，或(c)在第28天接受20,000,000個B10D.2脾細胞，第31天接受本發明的基于酵母的gp70-IT疫苗。正如圖5中所清楚顯示的，本發明基于酵母的疫苗誘導對抗致死性腫瘤復發的保護作用，與產生GM-CSF的自身腫瘤細胞誘導的保護作用沒有區別。與使用病人自體腫瘤細胞混合產生GM-CSF的旁觀細胞系相比，本發明基于酵母的疫苗方法在臨床上的有用性很容易評價，并且包括但不限于如下優點，更廣泛的病人適用范圍，結果差異性降低，設計接種抗原的能力增加，安全性增加，疫苗中不必包括生物學修飾物如GM-CSF，等等。
實施例6下述實施例證明含有癌抗原的基于酵母的疫苗在體內治療黑色素瘤的用途。
這個實驗中，參照表3，使用5組小鼠，每組5只。組A中，在腫瘤攻擊前4周和2周小鼠接受PBS注射。在腫瘤攻擊后10天和17天小鼠接受50×106基于酵母的hMART-1疫苗(表達人MART-1的酵母載體)。組B中，在腫瘤攻擊前4周和2周以及腫瘤攻擊后10天和17天，小鼠接受50×106基于酵母的hMART-1疫苗注射。組C中，在腫瘤攻擊前4周和2周小鼠接受PBS，并且腫瘤攻擊后不再給予。組D中，在腫瘤攻擊前4周和2周小鼠接受50×106基于酵母的hMART-1疫苗注射，并且腫瘤攻擊后不再給予。組E中，在腫瘤攻擊前4周和2周小鼠接受50×106基于酵母的EGFR疫苗(表達EGFR的酵母載體)，并且腫瘤攻擊后不再給予。第0天，所有小鼠接受皮下給予D16黑色素瘤細胞的腫瘤攻擊。A-D組小鼠接受50,000個表達內源性小鼠MART-1的D16黑色素瘤細胞(沒有用人MART-1轉染的細胞)，E組小鼠接受50,000用EGFR轉染的D16黑色素瘤細胞。
表3

結果如圖6所示。組B(腫瘤攻擊之前和之后都接受了免疫)和組D(腫瘤攻擊之前接受了免疫)的小鼠，腫瘤負荷顯著減小，證明表達黑色素瘤抗原的酵母疫苗對黑色素瘤腫瘤有效，甚至跨越物種。
實施例7下述實施例證明本發明酵母載體中表達的融合蛋白的構建，其中融合蛋白包含多個免疫原性功能域和相同抗原的多個突變。
多種Ras家族成員的核苷酸序列和氨基酸序列是現有技術中已知的。SEQ ID NO2是編碼人K-ras(已知GenBank登錄號為NM_033360)的核酸序列。SEQ ID NO2編碼本文中SEQ ID NO3代表的人K-ras。SEQ IDNO4是編碼鼠K-ras(已知GenBank登錄號為NM_021284)的核酸序列。SEQ ID NO4編碼本文中SEQ ID NO5代表的鼠K-ras。SEQ ID NO6是編碼人H-ras(已知GenBank登錄號為NM_005343)的核酸序列。SEQ ID NO6編碼本文中SEQ ID NO7代表的人H-ras。SEQ ID NO8是編碼鼠H-ras(已知GenBank登錄號為NM_008284)的核酸序列。SEQ ID NO8編碼本文中SEQ ID NO9代表的鼠H-ras。SEQ ID NO10是編碼人N-ras(已知GenBank登錄號為NM_002524)的核酸序列。SEQ ID NO10編碼本文中SEQ ID NO11代表的人N-ras。SEQ ID NO12是編碼鼠N-ras(已知GenBank登錄號為NM_010937)的核酸序列。SEQ ID NO12編碼本文中SEQ ID NO13代表的鼠N-ras。
圖7是示意圖，說明了含有多個抗原性/免疫原性功能域用于本發明基于酵母的疫苗的融合蛋白的實例。在這些示例性融合構建體中，使用了K-Ras蛋白的3-165位氨基酸(SEQ ID NO3的3-165位)，所述氨基酸在N-Ras和H-Ras中是相同的(即，可使用N-Ras和H-Ras的3-165位，并可獲得相同的結果)。隨后，該序列在位置12突變，以纈氨酸，半胱氨酸或天門冬氨酸殘基取代這個位置正常存在的甘氨酸(分別參見GI-1014，GI-4015和GI-4016)，在位置61用精氨酸取代這個位置正常存在的谷氨酸。第二個序列與這個序列融合(附加)。第二個序列是SEQ ID NO3的跨越K-ras的56-69位氨基酸的功能域，包括在位置61以亮氨酸取代這個位置正常存在的谷氨酸的突變。雖然這最初的三個序列中Q61L功能域與更長序列的N末端融合，也可制備其中功能域順序顛倒的其它構建體。編碼GI-1014的構建體的核苷酸序列和翻譯的氨基酸序列分別如SEQ ID Nos14和15所示。
圖7還顯示了多-抗原Ras融合疫苗(GI-4018)，包含上述在位置12的所有三個突變和上述在位置61的兩個突變。融合蛋白如下構建。含有SEQ IDNO1的合成序列后接著包括各種Ras突變的4個多肽。圖7所示的4個多肽的第一個包括K-Ras的N末端(SEQ ID NO3)的3-30位殘基，其中對應于SEQ ID NO3位置12的氨基酸殘基已經突變，以纈氨酸取代這個位置正常存在的甘氨酸。4個功能域的第二個包括SEQ ID NO3位置3-39的氨基酸殘基，其中對應于SEQ ID NO3位置12的氨基酸殘基已經突變，以半胱氨酸取代這個位置正常存在的甘氨酸。4個功能域的第三個由SEQ IDNO3位置3-165的氨基酸殘基組成，其中包含在位置12用天門冬氨酸取代這個位置正常存在的甘氨酸，和在位置61用精氨酸取代這個位置正常存在的谷氨酸。4個功能域的第四個是SEQ ID NO3的跨越K-ras的56-69位氨基酸的功能域，包括在位置61的突變，以亮氨酸取代這個位置正常存在的谷氨酸殘基。再次，雖然功能域以這種順序描繪在圖7中，應該了解功能域的順序可根據需要重新組織。
這個實例只是想說明如何構建在本發明中有用的抗原構建體。使用來自不同抗原的功能域，來自相同抗原的多個功能域，或帶有不同突變的重復功能域的相似策略，可用于其它抗原。當單個疫苗構建體中需要包含在抗原的單一位置天然發生的幾個不同突變和/或突變組合時，這種類型的構建體特別有用。
本文中引用的所有參考文獻全部引入本文作為參考。
雖然詳細描述了本發明的各種實施例，顯然本領域技術人員會對這些實施例進行修飾和改進。然而，應該清楚的知道，這種修飾和改進在本發明的范圍內，如同下述權利要求所要求保護的。
序列表<110>亞歷克斯.弗蘭朱索夫(Franzusoff，Alex)唐納德.貝爾格勞(Bellgrau，Donald)<120>用于免疫治療的基于酵母的疫苗<130>3923-6-PCT<150>60/434，163<151>2002-12-16<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽<400>1Met Ala Asp Glu Ala Pro1 5<210>2<211>570<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(570)<223>
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權利要求
1.一種保護動物對抗癌癥的方法，包括對已患有癌癥或可能發展為癌癥的動物給予疫苗，以減少或預防動物癌癥的至少一種癥狀，其中所述疫苗包含(a)酵母載體；和(b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含i)至少一種癌抗原；和ii)與癌抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工；其中，融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。
2.權利要求1的方法，其中所述肽由至少2-6個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成。
3.權利要求1的方法，其中所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列；其中X2是除甘氨酸，脯氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X3是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X4是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X5是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；和X6是除甲硫氨酸之外的任意一種氨基酸。
4.權利要求3的方法，其中X6是脯氨酸。
5.權利要求1的方法，其中所述肽包含M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。
6.一種保護動物對抗癌癥的方法，包括對已患有癌癥或可能發展為癌癥的動物給予疫苗，以減少或預防動物癌癥的至少一種癥狀，其中所述疫苗包含a)酵母載體；和b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含i)至少一種癌抗原；和ii)與該癌抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。
7.權利要求6的方法，其中酵母蛋白包含用于鑒定和純化融合蛋白的抗體表位。
8.權利要求1或6的方法，其中融合蛋白包含至少兩種或多種癌抗原。
9.權利要求1或6的方法，其中融合蛋白包含一種或多種癌抗原的至少一個或多個免疫原性功能域。
10.權利要求1或6的方法，其中癌抗原是與選自以下組癌癥相關的抗原黑色素瘤，鱗狀細胞癌，乳腺癌，頭頸癌，甲狀腺癌，軟組織肉瘤，骨肉瘤，睪丸癌，前列腺癌，卵巢癌，膀胱癌，皮膚癌，腦癌，脈管肉瘤，血管肉瘤，肥大細胞腫瘤，原發性肝癌，肺癌，胰腺癌，胃腸癌，腎細胞癌，造血細胞瘤形成及它們的轉移性癌癥。
11.權利要求1或6的方法，其中癌抗原是ras基因編碼的野生型或突變型蛋白。
12.權利要求11的方法，其中癌抗原是由選自K-ras，N-ras或H-ras基因的ras基因編碼的野生型或突變型蛋白。
13.權利要求11的方法，其中ras基因編碼帶有單突變或多突變的Ras蛋白。
14.權利要求1或6的方法，其中癌抗原包含片段，所述片段含有對應于野生型Ras蛋白第12，13，59或61位的氨基酸的野生型Ras蛋白至少5-9個連續氨基酸殘基，其中第12，13，59，或61位的氨基酸殘基相對于野生型Ras蛋白發生了突變。
15.權利要求1或6的方法，其中癌抗原由含有多個功能域的融合蛋白構建體組成，其中每個功能域由來自癌蛋白的肽組成，所述肽由所述蛋白中所發現的突變氨基酸及其任意一側的至少4個氨基酸殘基組成，所述突變與致腫瘤性相關。
16.權利要求15的方法，其中融合蛋白構建體由至少一種肽組成，其中所述肽與另一突變腫瘤抗原在閱讀框內融合，該肽選自以下組a)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3的位置8-16，其中SEQ ID NO3的位置12的氨基酸殘基發生了突變；b)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3的位置9-17，其中SEQ ID NO3的位置13的氨基酸殘基發生了突變；c)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3的位置55-63，其中SEQ ID NO3的位置59的氨基酸殘基發生了突變；和d)一種肽，其至少含有SEQ ID NO3的位置57-65，其中SEQ ID NO3的位置61的氨基酸殘基發生了突變。
17.權利要求16的方法，其中突變的腫瘤抗原是相對于野生型Ras蛋白序列包含至少一個突變的Ras蛋白。
18.權利要求1或6的方法，其中酵母載體選自以下組完整酵母，酵母原生質球，酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分。
19.權利要求1或6的方法，其中用編碼所述癌抗原的重組核酸分子轉化用于制備酵母載體的酵母細胞或酵母原生質球，使酵母細胞或酵母原生質球重組表達該癌抗原。
20.權利要求19的方法，其中重組表達所述癌抗原的酵母細胞或酵母原生質球用于制備包含酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分的酵母載體。
21.權利要求1或6的方法，其中酵母載體來自非致病性酵母。
22.權利要求1或6的方法，其中酵母載體來自選自以下組的酵母糖酵母(Saccharomyces)，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)，克魯維酵母(Kluveromyces)，漢遜酵母(Hansenula)，假絲酵母(Candida)或畢赤酵母(Pichia)。
23.權利要求1或6的方法，其中糖酵母是釀酒酵母(S.Cerevisiae)。
24.權利要求1或6的方法，其中將疫苗施用到呼吸道。
25.權利要求1或6的方法，其中以胃腸道外給予方式給予疫苗。
26.權利要求1或6的方法，其中疫苗進一步包含樹突細胞或巨噬細胞，其中將表達融合蛋白的酵母載體傳遞到來自體內的樹突細胞或巨噬細胞，并且將包含表達癌抗原的酵母載體的樹突細胞或巨噬細胞給予動物。
27.權利要求26的方法，其中樹突細胞或酵母載體額外裝載了游離抗原。
28.權利要求1或6的方法，其中疫苗作為治療性疫苗給予。
29.權利要求1或6的方法，其中疫苗作為預防性疫苗給予。
30.權利要求1或6的方法，其中動物已經患有或者可能發展為選自以下組的癌癥腦癌，肺癌，乳腺癌，黑色素瘤或腎癌。
31.權利要求1或6的方法，其中動物患有癌癥，并且在通過外科手術切除動物的腫瘤之后再給予疫苗。
32.權利要求1或6的方法，其中動物患有癌癥，在通過外科手術切除動物的腫瘤，并且進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植之后再給予疫苗。
33.權利要求1或6的方法，其中動物患有癌癥，在通過外科手術切除動物的腫瘤，進行不引起骨髓重度抑制的同種異體干細胞移植，以及輸注同種異體的供體淋巴細胞之后再給予疫苗。
34.一種保護動物對抗腦癌或肺癌的方法，包括將包含酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗施用到已患有或可能發展為腦癌或肺癌的動物的呼吸道，以減少或預防動物腦癌或肺癌的至少一種癥狀。
35.權利要求34的方法，其中疫苗包含至少兩種或多種癌抗原。
36.權利要求34的方法，其中癌抗原是含有至少一種或多種癌抗原的融合蛋白。
37.權利要求34的方法，其中癌抗原是含有一種或多種癌抗原的至少一個或多個免疫原性功能域的融合蛋白。
38.權利要求34的方法，其中癌抗原由含有多個功能域的融合蛋白構建體組成，每個功能域由來自癌蛋白的肽組成，所述肽由所述蛋白中所發現的突變氨基酸及其任意一側的至少4個氨基酸殘基組成，所述突變與致腫瘤性相關。
39.權利要求34的方法，其中酵母載體表達癌抗原，所述癌抗原是包含下述物質的融合蛋白a)至少一種癌抗原；和b)與癌抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與癌抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工；其中，融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。
40.權利要求34的方法，其中酵母載體表達癌抗原，所述癌抗原是包含下述物質的融合蛋白a)至少一種癌抗原；和b)與癌抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中所述酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。
41.權利要求34的方法，其中酵母載體選自以下組完整酵母，酵母原生質球，酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分。
42.權利要求34的方法，其中用編碼所述癌抗原的重組核酸分子轉化用于制備酵母載體的酵母細胞或酵母原生質球，使酵母細胞或酵母原生質球重組表達所述癌抗原。
43.權利要求42的方法，其中重組表達癌抗原的酵母細胞或酵母原生質球用于制備包含酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分的酵母載體。
44.權利要求34的方法，其中酵母載體在細胞內裝載癌抗原。
45.權利要求34的方法，其中癌抗原與酵母載體共價或非共價結合。
46.權利要求34的方法，其中通過混合使酵母載體與癌抗原結合。
47.權利要求34的方法，其中以鼻內給予方式給予疫苗。
48.權利要求34的方法，其中以氣管內給予方式給予疫苗。
49.權利要求34的方法，其中將酵母載體和癌抗原傳遞到來自體內的樹突細胞或巨噬細胞，并且將包含酵母載體和癌抗原的樹突細胞或巨噬細胞施用到動物呼吸道。
50.權利要求34的方法，其中所述方法保護動物對抗腦癌。
51.權利要求50的方法，其中腦癌是原發性腦癌。
52.權利要求50的方法，其中腦癌是多形性成膠質細胞瘤。
53.權利要求50的方法，其中腦癌是來自另一器官的轉移癌。
54.權利要求34的方法，其中所述方法保護動物對抗肺癌。
55.權利要求54的方法，其中肺癌是原發性肺癌。
56.權利要求54的方法，其中肺癌選自非小細胞癌，小細胞癌和腺癌。
57.權利要求54的方法，其中肺癌是來自另一器官的轉移癌。
58.權利要求34的方法，其中疫苗作為治療性疫苗給予。
59.權利要求34的方法，其中疫苗作為預防性疫苗給予。
60.權利要求34的方法，其中酵母載體來自非致病性酵母。
61.權利要求34的方法，其中酵母載體來自選自以下組的酵母糖酵母，裂殖酵母，克魯維酵母，漢遜酵母，假絲酵母或畢赤酵母。
62.權利要求34的方法，其中糖酵母是釀酒酵母。
63.一種誘發動物的抗原特異性體液免疫反應和抗原特異性細胞介導的免疫反應的方法，所述方法包括給予動物包含下述物質的治療性組合物a)酵母載體；和b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含i)至少一種抗原；和ii)與該抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與該抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工；其中融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。
64.權利要求63的方法，其中所述肽由至少6個與所述抗原異源的氨基酸殘基組成。
65.權利要求63的方法，其中所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列；其中X2是除甘氨酸，脯氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X3是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X4是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X5是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；和X6是除甲硫氨酸之外的任意一種氨基酸。
66.權利要求65的方法，其中X6是脯氨酸。
67.權利要求63的方法，其中所述肽包含M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。
68.權利要求63的方法，其中抗原選自以下組病毒抗原，過表達的哺乳動物細胞表面分子，細菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原，蠕蟲抗原，外寄生蟲抗原，癌抗原，帶有一個或多個突變氨基酸的哺乳動物細胞分子，出生前或剛出生時哺乳動物細胞正常表達的蛋白，通過插入流行病學因子(如病毒)而被誘導表達的蛋白，通過基因易位而被誘導表達的蛋白，以及通過調節序列的突變而被誘導表達的蛋白。
69.一種誘發動物的抗原特異性體液免疫反應和抗原特異性細胞介導的免疫反應的方法，所述方法包括給予動物包含下述物質的治療性組合物a)酵母載體；和b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含i)至少一種抗原；和ii)與該抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中所述酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2-約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。
70.權利要求69的方法，其中酵母蛋白包含用于鑒定和純化融合蛋白的抗體表位。
71.一種疫苗，含有a)酵母載體；和b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含i)至少一種抗原；和ii)與該抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與該抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工；其中，融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。
72.權利要求71的疫苗，其中所述肽由至少6個與該抗原異源的氨基酸殘基組成。
73.權利要求71的疫苗，其中所述肽包含M-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列；其中X2是除甘氨酸，脯氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X3是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X4是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；X5是除甲硫氨酸，賴氨酸和精氨酸之外的任意一種氨基酸；和X6是除甲硫氨酸之外的任意一種氨基酸。
74.權利要求73的疫苗，其中X6是脯氨酸。
75.權利要求73的疫苗，其中所述肽包含M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO1)的氨基酸序列。
76.權利要求73的疫苗，其中抗原選自以下組病毒抗原，哺乳動物細胞表面分子，細菌抗原，真菌抗原，原生動物抗原，蠕蟲抗原，外寄生蟲抗原，癌抗原，帶有一個或多個突變氨基酸的哺乳動物細胞分子，出生前或剛出生時哺乳動物細胞正常表達的蛋白，通過插入流行病學因子(如病毒)而被誘導表達的蛋白，通過基因易位而被誘導表達的蛋白，以及通過調節序列的突變而被誘導表達的蛋白。
77.權利要求73的疫苗，其中抗原是癌抗原。
78.一種疫苗，包含a)酵母載體；和b)酵母載體表達的融合蛋白，所述融合蛋白包含i)至少一種抗原；和ii)與該抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中所述酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。
79.權利要求78的疫苗，其中酵母蛋白包含用于鑒定和純化融合蛋白的抗體表位。
80.一種治療癌癥病人的方法，包括a)用能有效建立穩定混合的骨髓嵌合狀態且不引起骨髓重度抑制的干細胞轉移來治療癌癥病人，其中干細胞由同種異體的供體提供；b)將從同種異體的供體獲得的淋巴細胞給予病人；和c)在步驟(b)之后，將含有酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗給予病人。
81.權利要求80的方法，進一步包括在步驟(a)之前，將含有酵母載體和至少一種癌抗原的疫苗給予同種異體的供體。
82.權利要求80的方法，進一步包括在步驟(a)之前，切除病人的腫瘤。
83.權利要求80的方法，其中疫苗包含至少兩種或多種癌抗原。
84.權利要求80的方法，其中癌抗原是包含一種或多種癌抗原的融合蛋白。
85.權利要求80的方法，其中癌抗原是含有一種或多種癌抗原的一個或多個免疫原性功能域的融合蛋白。
86.權利要求80的方法，其中癌抗原由含有多個功能域的融合蛋白構建體組成，每個功能域由來自癌蛋白的肽組成，所述肽由所述蛋白中所發現的突變氨基酸及其任意一側的至少4個氨基酸殘基組成，所述突變與致腫瘤性相關。
87.權利要求80的方法，其中酵母載體表達癌抗原，所述癌抗原是包含下述物質的融合蛋白a)至少一種癌抗原；和b)與該癌抗原N-末端連接的肽，所述肽由至少兩個與該癌抗原異源的氨基酸殘基組成，且所述肽能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工；其中，融合蛋白位置1的氨基酸殘基是甲硫氨酸；融合蛋白位置2的氨基酸殘基不是甘氨酸或脯氨酸；融合蛋白位置2-6的氨基酸殘基都不是甲硫氨酸；和融合蛋白位置2-5的氨基酸殘基都不是賴氨酸或精氨酸。
88.權利要求80的方法，其中酵母載體表達癌抗原，所述癌抗原是包含下述物質的融合蛋白a)至少一種癌抗原；和b)與該癌抗原N-末端連接的酵母蛋白，其中所述酵母蛋白由內源酵母蛋白的約2個至約200個氨基酸組成，且所述酵母蛋白能穩定酵母載體中融合蛋白的表達或防止所表達的融合蛋白的翻譯后加工。
89.權利要求80的方法，其中酵母載體選自以下組完整酵母，酵母原生質球，酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分。
90.權利要求80的方法，其中用編碼所述癌抗原的重組核酸分子轉化用于制備酵母載體的酵母細胞或酵母原生質球，使酵母細胞或酵母原生質球重組表達所述癌抗原。
91.權利要求90的方法，其中重組表達癌抗原的酵母細胞或酵母原生質球用于制備包含酵母胞質體，酵母空胞，或亞細胞性酵母膜提取物或其級分的酵母載體。
92.權利要求80的方法，其中酵母載體在細胞內裝載癌抗原。
93.權利要求80的方法，其中癌抗原與酵母載體共價或非共價結合。
94.權利要求80的方法，其中通過混合使酵母載體與癌抗原結合。
95.權利要求80的方法，其中以鼻內給予方式給予疫苗。
96.權利要求80的方法，其中以胃腸道外給予方式給予疫苗。
97.權利要求80的方法，其中將酵母載體和癌抗原傳遞到來自體內的樹突細胞或巨噬細胞，并且將包含酵母載體和癌抗原的樹突細胞或巨噬細胞施用到動物呼吸道。
98.權利要求80的方法，其中酵母載體來自非致病性酵母。
99.權利要求80的方法，其中酵母載體來自選自以下組的酵母糖酵母，裂殖酵母，克魯維酵母，漢遜酵母，假絲酵母或畢赤酵母。
100.權利要求80的方法，其中糖酵母是釀酒酵母。
全文摘要
描述了一種治療和/或預防多種適用于免疫療法的疾病和狀態的組合物和方法，在一個具體實施例中，描述了治療和/或預防動物癌癥的組合物和方法。揭示了涉及如以下內容的具體改進含有酵母載體和選擇用來誘發動物的抗原特異性細胞免疫反應和體液免疫反應的抗原的基于酵母的疫苗，在用于預防性和/或治療性免疫接種以及預防和/或治療多種疾病和狀態中的用途。
文檔編號C12N15/62GK1938044SQ200380109787
公開日2007年3月28日 申請日期2003年12月16日 優先權日2002年12月16日
發明者亞歷克斯·弗蘭朱索夫, 唐納德·貝爾格勞 申請人:全球免疫股份有限公司