專利名稱：：通過蛋白水解測定蛋白質構象的方法
技術領域：
：本發明涉及一種新方法，用于測定編碼蛋白質的核酸分子多態性或突變的作用。自1980年后期基因測序技術出現和1990年人類基因組計劃設立以來，發現了大量與人類基因組每種基因序列或特性相關的信息。而且，人類基因組計劃發展出許多測定進化顯著基因序列的方法，并因此開拓出檢測基因內部變異的途徑。假定一個典型的基因長30000個堿基，平均每1100個堿基發生變異，可見需要極大的工作量來確定哪個變體具有醫療或科技作用。然而，如果想利用來自人類基因組計劃的資料，以期能夠了解例如人類健康狀況，特別是人類疾病，以及可能對其產生影響的因素，并由此創造新的治療方法，都必須經過這一步驟。一般地，已獲得正常或野生型基因序列的人類遺傳學研究人員，開始通過對來自被認為攜帶基因變體的個體的核酸分子的測序來尋找基因的顯著變化。這些個體顯示出某種特定疾病的癥狀，該疾病被認為與某種特定的基因的功能異常有關。一旦某種基因變體的序列得以測定并與野生型基因相比較，隨后將采取進一步研究，檢測該變異基因所編碼的蛋白質的細胞生物學。然后根據身體癥狀對這些研究結果進行檢驗，以便進行相關性推導。由此斷定，闡明基因變體的本質并使之與功能和臨床癥狀聯系起來，是一個長期而緩慢的過程，特別是認為給定基因可能有3.6％的多態性時。因此，顯然要簡單確定進一步研究哪種變體本身成為困難的一步。這個問題不僅存在于人類遺傳學領域，也存在于其它動物和植物物種研究中。出于這一目的，我們開發出一種新的測定方法，用于迅速而有效地測定基因變體的可能作用。我們的新方法基于蛋白質的基本結構。蛋白質的基本結構單位是氨基酸。氨基酸由一個氨基基團、一個羧基基團、一個氫原子和一個與碳原子結合、通常被稱為側鏈的特定R基團所組成。22種氨基酸及其任意數目和任意組合可通過肽鍵相連接，形成被稱為肽的氨基酸序列或氨基酸鏈。因此連接肽鏈長度的鍵的序列稱為骨架。另外，肽鏈內部和相互間也可連接，例如在前者實例中如賴氨酸氨基與谷氨酸γ羧基形成肽鍵；在后者實例中還可能由于形成二硫鍵導致在氨基酸側鏈之間形成連接鍵，從而產生單個肽鏈之間的交聯。由此鄰近的肽鏈可連接在一起形成二級結構，例如二聚體或三聚體等等。由于鄰近氨基酸相互作用的性質，二級結構可折疊形成三維的三級結構。這些三級結構代表蛋白質的活性形式，可能包括其它分子與之匹配的部位或口袋，以激活蛋白質或使蛋白質對其應答。食物消化過程中，無時無刻不發生可控方式的蛋白質消化或分解。這些功能由一類被稱為蛋白酶的酶完成。它們基本上攻擊特異的鍵，以便在這些鍵所處位點裂解蛋白質。由此可見，不同蛋白質由于它們的一級結構對各種酶具有不同的敏感度。雖然所有這些信息均為已知，以前卻沒有人考慮將其應用于遺傳學，特別是用于大量功能乃至臨床作用未知的遺傳變體的篩選。因此也沒有人考慮將該信息作為處理已有大量遺傳變體的基礎，以便確定哪種變體是臨床或科技重要的變體。但是我們運用這些信息開發出一種新的測定方法，如果需要，可同時篩選任意數量的變體，以便確定哪個變體需要進一步研究。我們的方法操作快速、有效而且廉價。發明描述根據本發明提供一種方法，用于確定核酸分子中給定核酸多態性或突變對于該核酸分子所編碼蛋白質的結構性質的作用，包括(a)使所述核酸分子編碼的蛋白質暴露于至少一種蛋白酶；和(b)確定是否發生蛋白水解裂解或蛋白水解裂解達到什么程度；以及選擇性地(c)將這些蛋白水解裂解與暴露于同樣蛋白酶的野生型蛋白質相比較。根據本發明另一方面提供一種篩選方法，用于確定至少一種基因的多種變體的作用，包括(a)獲得每種所述變體所編碼的蛋白質樣品；(b)使每種蛋白質暴露于至少一種蛋白酶中；(c)確定是否發生蛋白水解裂解或蛋白水解裂解達到什么程度；以及(d)將所述蛋白水解裂解與暴露于同樣蛋白酶的野生型蛋白質相比較。在本發明一個優選實施方案中，使用上述篩選方法時，使多種蛋白質變體暴露于多種蛋白酶中，確定相應的蛋白水解裂解。最理想地，本篩選方法包括檢測與不同基因有關的多種變體。從而，在單獨一個批次內，相應于多個基因的多種變體通過至少一種蛋白酶，理想地多種蛋白酶檢測，確定每種變體由每種蛋白酶消化產生的蛋白水解裂解。對本領域技術人員顯而易見的是，使用該方法，應用多種蛋白酶將提供對于每種變體的裂解或消化的模式(profile)，這些參數理論上可與野生型蛋白質的消化模式相比較，從而用于確定任何一種或多種所述基因的變體的功能作用。在本發明一個優選的實施方案中，所述核酸分子或基因變體編碼的所述蛋白質，暴露于多種蛋白酶中，理想地攻擊不同的連接鍵的不同的蛋白酶。適合本發明方法使用的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K、氨肽酶、羧肽酶、膠原酶、彈性蛋白酶、激肽釋放酶、金屬內切蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及甚至任何其它已知的蛋白酶。需要說明的是，如果裂解與野生型所呈現的不同，則可斷定該變體或乃至變體組合是有意義的。這是因為由于蛋白質三級或結構形式改變，變體要么使蛋白質變得更易消化，要么使蛋白質對消化具有抗性。在本發明另一個優選的實施方案中，對由多種遺傳變體編碼的多種蛋白質進行平行測試，因此可運用本發明方法作為篩選方法，其中在多個溫育容器充滿相應的待測試的多種蛋白質，然后所述蛋白質暴露于選定的一種或一組蛋白酶中，或反之，同時或依次暴露于蛋白酶中。更優選地，本發明方法包括在保證相關酶活性的條件下，將待測試蛋白質同所述蛋白酶一起溫育。例如，這可能包括在酶活性最適溫度條件例如37℃，將蛋白質暴露于酶中，并暴露足夠長的時間例如15分鐘-1.5小時，以便酶發揮其活性。更優選地，在適當時期后，例如通過向溫育容器內加入酶抑制劑來結束溫育。最后，使用任何傳統的蛋白質測定方法，例如SDS-PAGE分析，繼之以凝膠染色(考馬斯亮蘭或銀染色法)或western印跡，確定蛋白水解裂解。選擇地，也可采用其它研究確定蛋白質變體的功能性。在本發明另一個優選實施方案中，使用的確定蛋白水解裂解的程度的方法包括測定理想地已暴露于有關酶的每種待測蛋白質和野生型蛋白質，理想地還包括測定未暴露于有關酶的野生型和待測蛋白質樣品。這樣該測定方法包括了陽性對照和陰性對照，目的在于確定待測蛋白質所呈現的相對于野生型蛋白質的蛋白水解裂解量，以及在該測定條件下蛋白質裂解的本底水平。應當理解，本發明不限于被選擇用于分析蛋白水解裂解的特定測定方法，本發明更主要在于應用蛋白水解裂解方法測定遺傳變體可能的功能作用。從以上有關蛋白質三級結構的信息得出肽鏈中氨基酸的性質將決定蛋白質折疊從而決定對不同酶的敏感性。而肽鏈中的氨基酸的性質將由核酸編碼序列決定，因此該序列中的變異將導致氨基酸水平的變異，并因此導致蛋白質折疊差異，從而導致蛋白水解裂解敏感性的變化。由于該測定方法可快速有效地完成，分別由一個或一個以上給定基因的遺傳變體所編碼的一整套蛋白質，可同時被測定以確定哪種變體導致氨基酸三級結構變化，從而確定哪種變體最有可能影響蛋白質的功能。下面僅通過參照生長激素基因(GH1)的變體作為實例及后面的實施例描述本發明的實施方案。圖1顯示暴露于胰蛋白酶、糜蛋白酶或蛋白酶K的多個生長激素基因變體的消化模式。實驗對象鑒定了用于蛋白水解研究的突變的實驗對象描述于Millar等人的最初的HumanMutation論文中。研究了兩個不同的患者組。第一組包括41名無關白種人血統的身材矮小兒童(年齡1-15歲)，其符合下面列出的應用于Cardiff(″Cardiff標準″)的特定選擇標準。收集家族史、臨床和發育(auxological)變化，以及之前完成的實驗室研究的詳細資料(表1)。計算出生體重、生長激素處理前身高、生長激素處理前體重指數、生長激素分泌測試前長高速度、父親和母親的身高，以及通過雙親測定推導的目標成年身高的標準差分值(SDS)(表1)。還記錄了骨齡延遲程度以及生長激素分泌測試結果。DNA分析血樣取自指示病例(indexcase)以及適當的親屬。第二組包括11名無關的身材矮小，有自發性單一性生長素缺乏癥(IGHD)患者，其中已通過Southern印跡排除GH1基因缺失。這些個體中的8個來自有兩個或更多患IGHD(家族性IGHD)一級親屬的家庭，3個個體代表IGHD散在的病例。僅有一例家族性IGHD病例(第37家族)的身材矮小顯示分離的常染色體顯性性狀。從每個家族的現有親屬中采集血樣用于DNA分析。對照DNA樣品從取自154名白種人血統的英國軍隊男性新兵的淋巴細胞中獲得，這些新兵未經過身高選擇。這些個體中124人的高度數據可知(平均1.76±0.07m)，發現身高分布是正常的(Shapiro-Wilk統計量W＝0.984，p＝0.16)。這些研究得到了多區域道德委員會(MREC)的合乎道德的批準。患者選擇標準本研究包含的基本標準是，評價兒童的臨床醫師對兒童的生長特征應有充分的關注，以保證GH分泌測試。所選兒童顯示的臨床表型遵守以下標準，下文稱作″Cardiff標準″(a)充分的臨床關注以許可GH分泌測試，無論是測試種類、測試結果或乃至兒童是否參加了測試；(b)無可識別的可能導致觀察到的生長缺陷的病理學；(c)身材矮小定義為身高預測曲線低于由個體父母身高估計的個體目標成熟身高的下限(Tanner和Whitehouse1976)；(d)長高速度是或低于年齡(未經骨齡修正)的25％；和(e)與根據Tanner-Whitehouse標準(TW2方法；Tanner等人，1983)的年齡相比較，具有青春期前其骨齡延遲證據。除≤5歲的兒童外，該延遲至少應為兩年。材料&方法聚合酶鏈反應(PCR)擴增GH1-特異片段用標準方法提取患者淋巴細胞的基因組DNA。按照(2)所描述進行3.2kbGH1-特異片段的PCR擴增。GH1基因-特異PCR片段的克隆和測序GH1基因-特異的(3.2kb)PCR片段用BigDyev3.0(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)進行直接測序，并如(2)所描述，在ABI3100DNA測序儀(AppliedBiosystems)上進行分析。用于測序的另外的反向引物為GHBFR(5′TGGGTGCCCTCTGGCC3′；-262至-278)，GHSEQ1R(5′AGATTGGCCAAATACTGG3′；+215至+198)，GHSEQ2R(5′GGAATAGACTCTGAGAAAC3′；+785至+767)，GHSEQ3R(5′TCCCTTTCTCATTCATTC3′；+1281至+1264)，GHSEQ4R(5′CCCGAATAGACCCCGC3′；+1745至+1730)[按翻譯起始位點為+1編號；GenBank登記號為J03071]。將含序列變體的樣品克隆入pGEM-T(Promega，MadisonWI)中，隨后每一個體最少測定4個克隆。GH變體的體外表達和生物學活性測定羧基末端引入His標簽的克隆野生型GH1cDNA，按照先前描述(3)的定點突變修飾，生成GH變體。該載體隨后轉染HighFive昆蟲細胞(Invitrogen)，如以前(3)所描述，并采用ELISA(DRGDiagnostics，Marburg，德國)對培養上清液中的人GH進行定量。通過稀釋分析，確認GH變體和昆蟲細胞表達的野生型GH的ELISA交叉反應性，與測定參考制劑相同(用MRC1stIRP80/505參考制劑校準)。GH變體的蛋白水解消化向從表達野生型GH或變體的昆蟲細胞收獲的100μl培養基內加入胰蛋白酶、糜蛋白酶或蛋白酶K(全部來自Sigma，Poole，英國)終濃度為0.1μg/ml(60nM)，然后于37℃溫育1小時。上述野生型GH的劑量-依賴性研究表明，0.1μg/ml是GH被全部三種酶可檢測裂解的最低濃度。經處理1hr后，加入10μl胰蛋白酶-糜蛋白酶抑制劑(500μg/ml)以終止胰蛋白酶和糜蛋白酶消化，加入1μlPMSF(0.1M)以終止蛋白酶K消化。然后每一反應再于37℃溫育15分鐘。樣品使用微凝膠裝置，在12％凝膠上進行SDS-PAGE分析(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)。經37℃溫育1小時的等量未消化野生型GH和變體同樣在凝膠上進行分析。凝膠電轉印到PVDF膜上，如以前所描述(6)，用1∶500稀釋的小鼠抗人GH單克隆抗體探測(LabVision，Fremont，CA)，使用抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶HRP(HRP)綴合物(1∶5000，AmershamBiosciences)檢測，并通過增強化學發光(ECLPlus，AmershamBiosciences)顯像。使用AlphaImager1200數字成像系統(AlphaInnotechCorp，SanLeandro，CA)分析膜，結果以酶解消化后GH殘留量占未消化GH數值的百分比表示。重復實驗3次并經雙尾(two-taaled)t檢驗統計學評價。分子建模通過對人GH的X射線晶體結構(PDB3HHR)[8]中適當的變異氨基酸殘基進行觀察，對變體進行結構分析。比較了野生型和突變GH結構的靜電作用、氫鍵、疏水作用和表面暴露。使用ICM分子建模軟件套(MolsoftLLC，SanDiego，CA)進行分子繪圖。結果蛋白水解研究圖1顯示對多種GH變體進行的酶分析結果，目的是確定這些變體中哪個(如果有)改變了蛋白質的結構性質，并因此可能影響其活性。檢測了12個變體，可見相對于圖左側的野生型(WT)而言，大多數變體對蛋白質的蛋白水解消化易感性產生影響。變體Thr27Ile和Gln91Leu尤其易受蛋白質水解，在每種情況下，使用糜蛋白酶進行蛋白水解最為有效。根據圖2可見，預測變體Thr27Ile會影響螺旋1和處于螺旋2和螺旋3之間的環的內部包裝。這顯然具有重要的結構意義，其反映于表1的數據中。同樣地，就Gln91Leu而言，替換增加了疏水性，可能影響可溶性和折疊。這關系到蛋白質結構，并因此影響其對蛋白水解的敏感性。相反，Arg16Cys和Lys41Arg，雖然顯示與野生型不同的蛋白水解模式，但與上述變異體相比影響較小。不過，對于Arg16Cys預測的結構變化關系到分子間橋接，而對蛋白質形狀未產生不利影響。這可解釋為什么其對蛋白水解模式影響較小。就Lys41Arg而言，認為該變體保持了離子相互作用，但有可能導致空間位阻。這同樣意味著蛋白質的形狀可能得以保持。相反，其它變體僅顯示微小的蛋白水解敏感性，例如VAL110Ile和Thr175Ala，它們對酶糜蛋白酶的蛋白質水解均具有最強的抗性。本研究結果表明，GH變體可按照它們響應選定蛋白酶的蛋白質水解特征來描述，這些信息可作為選擇臨床和科技重要變體以進一步研究的首要步驟。表1符合特定(″Cardiff″)標準選擇的身材矮小兒童；臨床和發育變化以及實驗室研究。PSBWGHTHHABABMIHVMatPat10M-2.438.7E-1.88.97.0-1.4-0.90.9-2.612F-2.7XX-1.81.00.5-3.6-4.3-1.5-0.520M2.14.1I-3.47.35.31.0-1.8-1.80.133*M-0.4XX-2.16.53.9-0.7-1.5-1.0-0.253M-3.227.2C-3.813.511.5-4.9-1.3-2.8-1.557F-3.427.3R-2.82.71.5-1.7-1.70.30.762F-1.927.0G-4.44.63.50.6-0.7-1.5-1.963M-0.91.3G-4.58.26.2-0.2-4.40.6-1.166M-1.018.8I-2.98.16.1-0.3-1.2-3.9-1.671§F-2.94.0I-1.43.73.7-0.7-0.5-2.4-2.475F0.26.8C-6.214.113.54.2-3.5-0.60.376§F-1.818.3I-2.28.07.0-1.3-1.8-2.4-2.279M-3.628.8C-5.33.31.0-1.2-1.1-1.9-1.183M-2.8NR-3.52.01.0-1.3-2.12.10.71F1.448.6I-3.913.111.1-0.90.1-3.2-1.62F-1.420.2I-3.015.113.11.1-1.0-0.1-1.73F-1.23.7C-3.92.81.02.3-2.2-0.8-1.14M0.326.7I-3.47.54.71.4-2.2-1.7-1.25M-1.77.7I-3.09.06.01.1-0.8-1.5-0.26M-3.128.4C-4.25.83.0-0.9-1.5-1.9-3.77F-2.7111.3C-3.05.62.5-2.80.40.8-1.29F0.69.8I-2.013.311.32.61.6-0.8-1.011M0.30C-4.85.83.4-0.1-1.7-4.1-1.413F-3.116.0C-4.74.32.5-1.4-4.00.2-1.314M-0.513.2C-1.912.88.8-1.2-0.7-0.2-1.015F-0.90C-5.05.02.00.8-5.0-0.2-0.816M-0.54.6I-3.16.84.8-1.0-2.1-0.3-0.618M-3.818.0I-4.98.84.8-1.2-2.3-1.1-0.819F-0.52.1I-2.24.32.0-0.1-3.0-0.50.226M-0.238.6C-2.812.09.0-2.1-0.1-0.2-1.027F-1.45.6I-3.913.410.50.20.2-2.1-1.834F-5.410.0R-3.81.41.0-2.6-0.8-0.1-0.040M-1.4XX-1.412.810.2-0.4-1.21.0-0.858M-3.8＜1I-4.58.86.8-2.4-6.6-3.8-1.659F-0.1＜1I-3.68.05.7-2.6-0.9-1.5-0.868M-0.9XX-3.18.05.0-0.1-1.2-1.1-1.277M-0.648.0C-3.95.72.8-0.8-1.6-0.3-1.380M-3.633.9C-4.23.51.3-3.0-0.8-0.6-0.581M-1.8NR-3.45.02.3-3.1-2.3-0.1-0.582F-1.924.2C-6.82.01.00.3-2.6-0.30.484F-0.345.0C-4.05.83.5-0.1-3.2-1.50.8圖解.P患者編號；S性別；BW出生體重標準差分值(SDS)；GHGH分泌測試結果(mIU/L)；N″正常的″，TGH分泌測試類型I胰島素耐量試驗，C氯壓定(clonidine)，G胰高血糖素，E鍛煉，R隨機，X拒絕測試，H身高SDS；HA身高SDS和骨齡評定的年齡；BA骨齡年數；BMI體重指數SDS；HV身高增長速度SDS；Mat母親的身高SDS；Pat父親的身高SDS。具有GH1基因病變患者的數據以黑體字顯示。*具有相似表型的同胞之一。§GHD家族史。參考文獻1RankeMB1996Towardsaconsensusonthedefinitionofidiopathicshortstature.HormRes45Suppl.264-662HoranM，MillarDS，HedderichJ，LewisG，NewswayV，MoN，FryklundL，ProcterAM，KrawczakM，CooperDN2003Humangrowthhormone1(GH1)geneexpressioncomplexhaplotype-dependentinfluenceofpolymorphicvariationintheproximalpromoterandlocuscontrolregion.HumMutat21408-4233MillarDS，LewisMD，HoranM，NewswayV，EasterTE，GregoryJW，FryklundL，NorinM，CrowneEC，DaviesS，EdwardsP，KirkJ，WaldranK，SmithPJ，PhillipsIIIJA，ScanlonMF，KrawczakM，CooperDN，ProcterAM2003Novelmutationsofthegrowthhormone1(GH1)genedisclosedbymodulationoftheclinicalselectioncriteriaforindividualswithshortstature.HumMutat21424-4404RossRJ，EspositoN，ShenXY，vonLaueS，ChewSL，DobsonPR，Postel-VinayMC，FinidoriJ1997Ashortisoformofthehumangrowthhormonereceptorfunctionsasadominantnegativeinhibitorofthefull-lengthreceptorandgenerateslargeamountsofbindingprotein.MolEndocrinol11265-2735vonLaueS，FinidoriJ，MaamraM，ShenX-Y，JusticeS，DobsonPRM，RossRJM2000StimulationofendogenousGHandinterleukin-6receptorsselectivelyactivatesdifferentJaksandStats，withaStat5-specificsynergisticeffectofdexamethasone.JEndocrinol165301-3116LewisMD，HamJ，ReesDA，LewisBMScanlonMF2002Mitogen-activatedproteinkinasemediatesepidermalgrowthfactor-inducedmorphogenesisinpituitaryGH3cells.JNeuroendocrinol14361-3677GreenH，KehindeO1976Spontaneousheritablechangesleadingtoincreasedadiposeconversionin3T3cells.Cell7105-1138deVosAM，UltschM，KossiakoffAA1992Humangrowthhormoneandextracellulardomainofitsreceptorcrystalstructureofthecomplex.Science255306-3129KrawczakM，ChuzhanovaNA，CooperDN1999Evolutionoftheproximalpromoterregionofthemammaliangrowthhormonegene.Gene237143-15110ClacksonT，WellsJA1995Ahotspotofbindingenergyinthehormone-receptorinterface.Science267383-38611ClacksonT，UltschMH，WellsJA，deVosAM1998Structuralandfunctionalanalysisofthe1∶1growthhormonereceptorcomplexrevealsthemolecularbasisforreceptoraffinity.JMolBiol2771111-112812CunninghamBC，WellsJA1989High-resolutionepitopemappingofhGH-receptorinteractionsbyalanine-scanningmutagenesis.Science2441081-108413HansenJH，WangX，KopchickJJ，BoucheloucheP，NeilsonJH，GalsgaardED，BillestrupN1996IdentificationoftyrosineresiduesintheintracellulardomainofthegrowthhormonereceptorrequiredfortranscriptionalsignallingandSTAT5activation.JBiolChem27112669-1267314SotiropoulosA，Perrot-ApplanatM，DinersteinH，PallierA，Postel-VinayM-C，FinidoriJ，KellyPA1994DistinctcytoplasmicregionsofthegrowthhormonereceptorarerequiredforactivationofJAK2，mitogen-activatedproteinkinase，andtranscription.Endocrinology1351292-129815VanderKuurJ，AllevatoG，BillestrupN，NorstedtG，Carter-SuC1995Growthhormonr-promotedtyrosylphosphorylationofSHCproteinsandSHCassociationwithGrb2.JBiolChem2707587-759316VanderKuurJA，ButchER，WatersSB，PessinJE，GuanKL，Carter-Su1997Signallingmoleculesinvolvedincouplinggrowthhormonereceptortomitogen-activatedproteinkinaseactivation.Endocrinology1384301-430717LiangL，JiangJ，FrankSJ2000Insulinreceptorsubstrate-1enhancementofgrowthhormonr-inducedMAPkinaseactivation.Endocrinology1413328-333618KimS-O，LoeschK，WangX，JiangJ，MeiL，CunnickJM，WuJ，FrankSJ2002AroleforGrb2-associatedbinder-1ingrowthhormonesignalling.Endocrinology1434856-486719YamauchiT，UekiK，TobeK，TamemotoH，SekineN，WadaM，HonjoM，TakahashiM，TakahashiT，HiraiH，TushimaT，AkanumaY，FujitaT，Komurol，YazakiY，KadowakiT1997TyrosinephosphorylationoftheEGFreceptorbythekinaseJak2isinducedbygrowthhormone.Nature39091-9620ZhuT，LingL，LobiePE2002IdentificationofaJAK2-independentpathwayregulatinggrowthhormone(GH)-stimulatedp44/42mitogen-activatedprotejnkinaseactivity.JBiolChem27746692-4560321ShobaLNN，NewmanM，LiuW，LoweWL2001LY294002，aninhibitorofphosphatidylinositil3-kinase，inhibitsGH-mediatedexpressionoftheIGF-1geneinrathepatocytes.Endocrinology1423980-398622FragoLM，PaedaC，DicksonSL，HewsonAK，ArgenteJ，ChowenJA2002Growthhormone(GH)andGH-releasingpeptide-6increaseinsulin-likegrowthfactor-lexpressionandactivateintracellularsignallingpathwaysinvolvedinneuroprotection.Endocrinology1434113-412223MetherellLA，，AkkerSA，MunroePB，RoseSJ，CaulfieldM，SavageMO，ChewSL，ClarkAJL2001Pseudoexonactivationasanovelmechanismfordiseaseresultinginatypicalgrowth-hormoneinsensitivity.AmJHumGenet69641-64624MilwardAD，MaamraM，WilkinsonIR，MetherellLA，SavageMO，ClarkAJL，RossRJM2003Amutatedgrowthhormonereceptor(GHR1-656)withanextracellulardomaininsertionactivatesSTAT5butnotMAPkinase.Programofthe85thAnnualMeetingofTheEndocrineSociety，Philadelphia，PA，2003，p62(Abstract)權利要求1.一種用于確定核酸分子中給定核酸多態性或突變對于該核酸分子編碼的蛋白質的結構性質的作用的方法，包括(a)使所述核酸分子編碼的蛋白質暴露于至少一種蛋白酶中；和(b)確定是否發生蛋白水解裂解或蛋白水解裂解達到什么程度；和任選地(c)將該蛋白水解裂解與暴露于同樣蛋白酶中的野生型蛋白質相比較。2.一種用于確定至少一種基因的多種變體的作用的篩選方法，包括(a)獲得每種所述變體所編碼的蛋白質的樣品；(b)使每種蛋白質暴露于至少一種蛋白酶中；(c)確定是否發生蛋白水解裂解或蛋白水解裂解達到什么程度；以及(d)將該蛋白水解裂解與暴露于同樣蛋白酶中的野生型蛋白質相比較。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白質暴露于多種蛋白酶中。4.根據權利要求3所述的方法，其中至少某些所述蛋白酶攻擊蛋白質內不同的位點。5.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中所述蛋白酶包括下列蛋白酶中的任何一種或多種胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K、氨肽酶、羧肽酶、膠原酶、彈性蛋白酶、激肽釋放酶、金屬內切蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。6.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中多種蛋白質暴露于所述蛋白酶中。7.根據權利要求3-6所述的方法，其中所述蛋白質同時暴露于所述蛋白酶中，或反之。8.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中所述蛋白質同時或者依次暴露于所述不同的蛋白酶中。9.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中在支持所述蛋白酶活性的條件下將所述蛋白質暴露于所述蛋白酶中。10.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中通過向反應中加入至少一種蛋白酶抑制劑終止所述蛋白質的消化。11.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中使用常規的蛋白質測定方法確定蛋白水解裂解。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述測定方法包括SDS-PAGE分析。13.根據權利要求12所述的方法，其中所述分析繼之以染色或印跡。14.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中采取另外的研究確定蛋白質變體的功能性。15.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中部分(a)包括進一步將野生型蛋白質暴露于所述至少一種蛋白酶中，和部分(b)包括確定所述野生型蛋白質是否發生蛋白水解裂解以及蛋白水解裂解達到什么程度。16.根據前述任何一項權利要求所述的方法，其中野生型蛋白質，以及可選的變體蛋白質，經受沒有所述蛋白酶存在的蛋白水解反應條件，確定蛋白水解裂解的程度。全文摘要本發明涉及一種方法，用于測定多態性或突變對蛋白質結構性質的影響，其中所述方法依賴于蛋白質的結構性質以及其在蛋白水解過程中的裂解。文檔編號C12Q1/00GK1711356SQ200380103104公開日2005年12月21日申請日期2003年11月4日優先權日2002年11月12日發明者L·弗里克隆,M·劉易斯,D·庫珀申請人:加的夫大學學院咨詢有限公司