高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法以及試劑的制作方法

專利名稱：高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法以及試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及試樣中的高密度脂蛋白(以下簡稱HDL)中的膽固醇的測定方法、測定用試劑以及測定用試劑盒。
背景技術：
生物中的脂蛋白按照其比重，可以分為高密度脂蛋白、低密度脂蛋白(以下，簡稱為LDL)、極低密度脂蛋白(以下，簡稱為VLDL)、乳糜微粒(CM)，主要由于脫輔基蛋白的種類不同，因此，各自在生物體中的作用有很大差別，脂質組成也是各種各樣的。其中，已知知道HDL與為了從包括動脈管壁的各組織接受膽固醇而除去蓄積在細胞內的膽固醇的作用有關，并且是以冠狀動脈硬化癥為代表的各種動脈硬化癥的危險預防要素，其在血液中的水平是預知動脈硬化性疾病病發的有效指示。
以前的HDL中的膽固醇(以下，簡稱HDL膽固醇)的測定方法是由利用超離心方法、免疫化學的方法、電泳法、沉淀法等級分操作和膽固醇定量操作2步驟組成。然而，級分操作的操作復雜，且需要很長時間，而且還存在安全性的問題。因此，帶有這些級分操作的測定方法的效率非常差，是不適于實用化的方法。
近年來，為了解決上述問題，報道了各種測定方法。例如，已經知道了下列方法在含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶以及膽汁酸鹽、膽汁酸衍生物或者琥珀酸二辛酯磺酸鹽的緩沖液中，使血清或者血漿與該酶反應，在使VLDL以及LDL中的膽固醇率先反應成HDL膽固醇，測定生成的過氧化氫后，向反應液添加非離子類的含有聚環氧乙烷氧化物基團的表面活性劑，使HDL膽固醇和該酶反應，特異性地對HDL膽固醇進行鑒別定量的方法(特開昭62-69999號公報)；通過在特定的pH以及特定的溫度下，在含有來自胰臟的膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸組的表面活性劑以及非離子類表面活性劑的緩沖液中，使血清與該酶反應而測定HDL膽固醇的方法(特開昭63-126498號公報)。在專利文獻2中記載的測定方法中，首先，LDL膽固醇和該酶進行反應，接著，HDL膽固醇和該酶進行反應，可以測定HDL膽固醇。然而，這些測定方法需要長時間進行測定，而且，對于HDL膽固醇未必是特異性地測定方法。
作為使HDL以外的脂蛋白凝聚而測定HDL膽固醇的方法，已經公知了下列方法，例如，使用硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑、2價的金屬鹽以及經過化學修飾的酶的測定方法(特開平8-131197號公報)、使用聚陰離子等與HDL以外的脂蛋白形成復合體的試劑和聚環氧乙烷-聚環氧丙烷縮合物等不溶解脂蛋白的表面活性劑的測定方法(特開平8-201393號公報)、使用硫酸葡聚糖等聚陰離子、2價的金屬鹽、特定的非離子表面活性劑以及與來自試樣的白蛋白不同的白蛋白的測定方法(特開平9-285298號公報)、對血清或者血漿中的HDL膽固醇進行測定的方法，其特征在于利用含有脂蛋白分離劑(硫酸葡聚糖等聚陰離子和鎂離子等2價陽離子的組合)處理血清或者血漿，并且不對所得混合液進行固體以及液體的分離處理，并在陰離子表面活性劑(烷基磺酸或者膽汁酸或其衍生物)的存在下，使所得混合液與膽固醇酯酶以及膽固醇氧化酶反應，并對生成的過氧化氫進行測定(特開平8-116996號公報)、向生物試樣中添加聚陽離子等與HDL以外的脂蛋白質形成復合體的物質和不溶解脂蛋白的特定的表面活性劑后，以酶進行測定HDL膽固醇的方法(特開平8-201393號公報)等。
然而，這些使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL膽固醇的測定方法雖然與現有的標準方法具有良好的關聯性，但是，存在下列問題由反應產生的凝聚物引起的濁度而導致的不精密度、在對反應室進行堿洗滌的時候，與反應液中的金屬鹽的反應生成的金屬氫氧化物的沉淀而引起對自動分析裝置的過度載荷等。
作為不使HDL以外的脂蛋白凝聚而測定HDL膽固醇的方法，例如，已經公知了下列方法在膽汁酸或其鹽以及白蛋白存在下，使生物試樣和來自胰臟的膽固醇酯酶以及膽固醇氧化酶反應，并通過測定由該酶反應消耗或者產生的化合物而測定生物試樣中的HDL膽固醇的方法(國際公開第97/40376號小冊子)、在對HDL級分具有選擇性的HLB值為16以上的非離子性表面活性劑的存在下，使優先作用于HDL級分的脂蛋白脂酶和/或膽固醇酯酶以及膽固醇氧化酶反應，測定試樣中的HDL膽固醇的方法(國際公開第00/52480號小冊子)等。另外，還公知了如下方法利用酰基聚環氧乙烷脫水山梨糖醇酯優先地把HDL以外的脂蛋白中的膽固醇轉化成過氧化氫，除去產生的過氧化氫后，通過添加聚環氧乙烷烷基醚，以酶進行測定HDL膽固醇的方法(特開平9-299號公報)。
然而，在這些不使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL膽固醇的測定方法中，有時存在下列問題HDL以外的脂蛋白中膽固醇的不完全除去或者由對于HDL以外的脂蛋白中的膽固醇的非特異反應而引起的測定值的不準確性。
另外，當利用光學方法測定試樣中的特定物質時，在來自M蛋白血癥或者骨髓瘤等患者的試樣中，由不溶性蛋白引起的混濁帶來光學影響，這一點成為很大的問題。為了避免這種光學上的影響，一般公知如下方法使反應液中的鹽類成為高濃度，使由不溶性蛋白引起的濁度消除。然而，在HDL膽固醇的測定中，由于存在高濃度的鹽類，有時對HDL膽固醇特異性會下降或者進一步引起所含酶的失活，因此，在高濃度鹽類的存在下測定HDL膽固醇大多情況會非常困難。
發明的公開本發明的目的是提供能夠簡便、且正確測定的HDL膽固醇的測定方法、測定用試劑以及測定用試劑盒。
本發明涉及下述[1]～[37]。
試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于在含有非離子性表面活性劑、聚陰離子以及白蛋白的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶、或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
如[1]所述的測定方法，其中，水性介質進一步含有膽汁酸衍生物。
如[2]所述的測定方法，其中，膽汁酸衍生物為陰離子性膽汁酸衍生物。
如[1]～[3]任一項所述的測定方法，其中，非離子性表面活性劑為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺。
如[1]～[4]任一項所述的測定方法，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有非離子性表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有非離子性表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶。
如[7]所述的試劑，其中，進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
如[6]～[8]任一項所述的試劑，其中，進一步含有膽汁酸衍生物。
如[9]所述的試劑，其中，膽汁酸衍生物是陰離子性膽汁酸衍生物。
如[6]～[10]任一項所述的試劑，其中，非離子表面活性劑為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺。
如[6]～[11]任一項所述的試劑，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有聚陰離子、非離子性表面活性劑、白蛋白以及過氧化氫測定試劑，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于包括含有聚陰離子的第一試劑和含有膽固醇氧化酶的第二試劑，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、非離子性表面活性劑、白蛋白以及過氧化氫測定試劑。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、非離子性表面活性劑、白蛋白以及氧化型輔酶，第二試劑中含有膽固醇脫氫酶。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于包括含有聚陰離子的第一試劑和含有膽固醇脫氫酶的第二試劑，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、非離子性表面活性劑、白蛋白以及氧化型輔酶。
如[15]或者[16]所述的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
如[13]～[17]任一項所述的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都進一步含有膽汁酸衍生物。
如[18]所述的試劑盒，其中，膽汁酸衍生物為陰離子性膽汁酸衍生物。
如[13]～[19]任一項所述的試劑盒，其中，非離子性表面活性劑為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺。
如[13]～[20]任一項所述的試劑盒，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于在含有i)非離子性表面活性劑、聚陰離子以及白蛋白或者ii)聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于在含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
如[23]所述的方法，其中，進一步含有聚陰離子。
如[23]或者[24]所述的方法，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
如[23]～[25]任一項所述的方法，其中，進一步含有白蛋白。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶。
如[28]所述的試劑，其中，進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
如[27]～[29]任一項所述的試劑，其中，進一步含有聚陰離子。
如[30]所述的試劑，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
如[27]～[31]任一項所述的試劑，其中，進一步含有白蛋白。
高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于由第一試劑以及第二試劑組成，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者任意地含有膽固醇酯水解酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定試劑，在第二試劑含有膽固醇氧化酶。
高密度脂蛋白質中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于由第一試劑以及第二試劑組成，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者任意地含有膽固醇酯水解酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶，在第二試劑中含有膽固醇脫氫酶。
如[34]所述的試劑盒，其中，第一試劑和第二試劑的其中之一或者兩者進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
如[33]～[35]任一項所述的試劑盒，其中，第一試劑和第二試劑的其中之一或者兩者進一步含有聚陰離子。
如[33]～[37]任一項所述的試劑盒，其中，第一試劑和第二試劑的其中之一或者兩者進一步含有白蛋白。
本發明的HDL膽固醇的測定方法是不除去HDL以外的脂蛋白中的膽固醇而特異性地測定HDL膽固醇的方法。
作為本發明的測定方法中使用的試樣，可以列舉，例如，全血、血漿、血清、脊髓液、唾液、羊水、尿、汗、胰液等，優選血漿以及血清。
作為本發明中的膽固醇酯水解酶，只要對膽固醇酯具有水解能力的酶，就沒有特別的限制，例如，可以使用來自動物、植物或者微生物的膽固醇酯酶、脂蛋白脂酶，此外還可以使用利用基因工程的方法而制造的膽固醇酯酶、脂蛋白脂酶等。
作為膽固醇酯水解酶，可以使用無修飾的膽固醇酯水解酶，還可以使用經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。另外，作為膽固醇酯水解酶，還可以使用市售品。
作為市售的膽固醇酯水解酶，可以列舉，例如膽固醇酯酶“Amano”2(CHE2；天野酶公司制)、膽固醇酯酶“Amano”3(CHE3天野酶公司制)、脂蛋白脂酶(LPL311；東洋紡績公司制)、脂蛋白酯酶“Amano”6(LPL6；天野酶公司制)、膽固醇酯酶[COE313(經過化學修飾的膽固醇酯酶)；東洋紡績公司制]等。另外，在本發明中，也可以組合2種以上的膽固醇酯水解酶而使用。
作為在膽固醇酯水解酶的化學修飾中修飾該酶的基團(化學修飾基)，可以列舉，例如以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、具有聚丙二醇和聚乙二醇共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基、具有螯合作用的基團，優選以聚乙二醇為主要成分的基。作為水溶性多糖類，例如，可以列舉葡聚糖、支鏈淀粉、可溶性淀粉等。
作為對膽固醇酯水解酶進行化學修飾的試劑(化學修飾劑)，可以列舉同時具有上述化學修飾基和能與酶的氨基、羧基、巰基等反應的官能團或者結構的化合物等。作為能與酶中的氨基反應的官能團或者結構，可以列舉，例如羧基、活性酯基(N-羥基琥珀酰亞胺基等)、酸酐、酰基氯、醛、環氧基、1，3-丙磺酸內酯、1，4-丁磺酸內酯等。作為能與酶中的羧基反應的官能團或者結構，可以列舉，例如氨基等。作為與酶中的巰基具有反應性的基團或者結構，可以列舉，例如馬來酰亞胺基、二硫化物、α-鹵代酯(α-碘酯等)等。
還可以使用市售品作為化學修飾劑。作為市售的化學修飾劑，可以列舉具有以聚乙二醇為主要成分的基團和具有N-羥基琥珀酰亞胺基的サンブライトVFM-4101、サンブライトMEAC-50HS以及サンブライトMEC-50HS(都由日本油脂公司制造)、具有以聚亞烷基二醇為主要成分的基團和酸酐結構的サンブライトAKM系列(例如，サンブライトAKM-1510等)、サンブライトADM系列以及サンブライトACM系列(都由日本油脂公司制造)、具有以聚環氧乙烷為主要成分的基團和環氧基的EPOX-3400以及M-EPOX-5000(都由Sheawater Polymers公司制)、含有具有螯合作用的基團和酸酐結構的二乙三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸酐(DTPA酸酐；同仁化學公司制)等。
膽固醇酯水解酶的化學修飾方法沒有特別的限制，例如，可以進行如下操作把膽固醇酯水解酶溶解于pH8.0以上的緩沖液(例如HEPES緩沖液)，在0～55℃下，添加0.01～500倍摩爾量的化學修飾劑，攪拌5分鐘～5小時。作為本發明中使用的經過化學修飾的膽固醇酯水解酶，可以直接使用上述反應液，還可以使用根據需要利用超濾膜除去未反應的化學修飾劑等而得到的溶液。
作為本反應的方法中使用的膽固醇酯水解酶的濃度，只要是可以測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，在反應液中優選0.01～200U/mL的濃度，更優選0.02～100U/mL。
作為本發明中的膽固醇氧化酶，只要是具有氧化膽固醇而生成過氧化氫的能力的酶，就沒有特別的限制，例如，可以使用來自動物、植物或者微生物的膽固醇氧化酶，此外還可以使用通過基因工程上的方法而制造的膽固醇氧化酶等，還能夠使用膽固醇氧化酶“Amano”1(CHOD1；天野酶公司制)、膽固醇氧化酶(CO-PE；キツコ-マン公司制)、膽固醇氧化酶(COO321；東洋紡績公司制)等市售品。另外，在本發明中，也可以組合2種以上的膽固醇氧化酶而使用。
膽固醇氧化酶可以為無修飾的酶，也可以是經過化學修飾的酶。經過化學修飾的膽固醇氧化酶，例如，可以使用上述的化學修飾劑，并利用上述的化學修飾方法而制造。
作為在本反應的方法中使用的膽固醇氧化酶的濃度，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，在反應液中優選0.01～200U/mL的濃度，更優選0.02～100U/mL的濃度。
作為本發明中的膽固醇脫氫酶，只要是具有在氧化型輔酶的存在下氧化膽固醇而產生還原型輔酶的能力的酶，就沒有特別的限制，例如，可以使用來自動物、植物或者微生物的脫氫酶，此外還可以使用通過基因工程上的方法而制造的膽固醇脫氫酶等。還可以膽固醇脫氫酶“Amano”5(CHDH5；天野酶公司制)等市售品。另外，在本發明中，也可以組合2種以上的膽固醇脫氫酶而使用。膽固醇脫氫酶可以是無修飾的酶、也可以是經過化學修飾的酶。經過化學修飾的膽固醇脫氫酶，例如，可以使用上述化學修飾劑，并利用上述的化學修飾方法而制造。
作為本反應的方法中使用的膽固醇脫氫酶的濃度，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，在反應液中，優選為0.01～200U/mL的濃度，更優選0.02～100U/mL的濃度。
在使用膽固醇脫氫酶的測定方法中，使用氧化型輔酶。作為氧化型輔酶，例如，可以列舉NAD、NADP、硫代-NAD、硫代-NADP等。
作為在本發明中使用的白蛋白，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的白蛋白，就沒有特別的限制，例如，可以列舉來自牛、馬、羊、人的白蛋白等，優選牛血清白蛋白(BSA)。另外，還可以使用利用基因工程學上的方法而制造的白蛋白。在本發明中，也可以組合使用2種以上的白蛋白。作為本發明的HDL膽固醇的測定中的白蛋白的濃度，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，反應液中的濃度優選為0.001～10％，更優選為0.01-1％。
作為在本發明中使用的聚陰離子，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的聚陰離子，就沒有特別的限制，例如，可以列舉硫酸葡聚糖或其鹽、肝素或其鹽、磷鎢酸或其鹽、硫酸化環糊精或其鹽、硫酸化低聚糖或其鹽、角叉菜膠等，優選為硫酸葡聚糖或其鹽。作為硫酸葡聚糖，例如，可以列舉分子量為4萬、8萬、20萬、50萬、100萬、200萬等硫酸葡聚糖。作為硫酸化低聚糖，例如，可以列舉硫酸化瓊脂糖、硫酸化海藻糖、硫酸軟骨素等。作為鹽，例如，可以列舉鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鎂鹽等。另外，在本發明中，也可以使用2種以上的聚陰離子。
作為本發明的HDL膽固醇的測定中的聚陰離子的濃度，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，反應液中的濃度優選為0.001～10％，更優選為0.01～1％。
作為在本發明中使用的非離子性表面活性劑，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的非離子性表面活性劑，就沒有特別的限制，例如，可以列舉聚環氧乙烷烷基胺、聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷烷基醚、聚環氧乙烷烯基醚、聚環氧乙烷芳基醚衍生物、乙二胺四聚氧化亞烷基等。
作為非離子性表面活性劑，優選聚環氧乙烷烷基胺以及聚環氧乙烷烯基胺。
作為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺，例如，可以列舉由通式(I) [式中，R表示直鏈或者支鏈狀的烷基或者烯基，X表示氫原子或者(CH2CH2O)nH，m以及n相同或者不同，并表示1～100的整數，m+n為2～200的整數]表示的化合物[以下稱為化合物(I)]。
作為在聚環氧乙烷烷基胺、化合物(I)以及聚環氧乙烷烷基醚中的烷基，可以列舉直鏈或者支鏈狀的碳原子數6～30的例如己基、庚基、辛基、異辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基(月桂基)、十三烷基、十四烷基(肉豆蔻基)、十五烷基、十六烷基(鯨蠟基)、十七烷基、十八烷基(硬脂基)、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基(山萮烷基)等。
作為在聚環氧乙烷烯基胺、化合物(I)以及聚環氧乙烷烯基醚中的烯基，可以列舉直鏈或者支鏈上的碳原子數6～30的例如己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、香茅烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、油烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、二十三碳烯基、二十四碳烯基、二十五碳烯基、二十六碳烯基、二十七碳烯基、二十八碳烯基、二十九碳烯基、三十碳烯基等。
作為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺的具體例子(產品)，例如，可以列舉ナイミ-ンL201(氧乙烯基十二烷基胺；日本油脂公司制造)、ナイミ-ンL207(聚環氧乙烷十二烷基胺；日本油酯公司制造)、ナイミ-ンS204、ナイミ-ンS210(聚環氧乙烷十八烷基胺；日本油脂公司制)、ニユ-コ-ルOD420(聚環氧乙烷十八烷基胺；日本乳化劑公司制)、パイォニンD3104(聚環氧乙烷月桂基胺；竹本油脂公司制)、パイォニンD3110(聚環氧乙烷月桂基胺；竹本油脂公司制)、パイォニンD3605[聚環氧乙烷烷基(大豆)胺；竹本油脂公司制]、パイォニンD3615T[聚環氧乙烷烷基(牛脂)胺；竹本油脂公司制]、BLAUNONO209(聚環氧乙烷油基氨基醚；青木油脂公司制)等。
作為聚環氧乙烷烷基醚或者聚環氧乙烷烯基醚的具體例子(產品)，例如，可以列舉エマルミンL90S(聚環氧乙烷月桂基醚；三洋化成公司制)、ニユ-コ-ル1310(聚環氧乙烷十三烷基醚日本乳化劑公司制)、BLAUNON-EN1520(聚環氧乙烷油基醚；青木油脂公司制)等。
作為聚環氧乙烷芳基醚衍生物，例如，可以列舉聚環氧乙烷苯乙烯化苯基醚、聚氧化亞烷基苯乙烯化苯基醚、聚環氧乙烷苯乙烯化甲基苯基醚、聚環氧乙烷苯乙烯基苯基醚縮合物、聚環氧乙烷烷基苯基醚、聚環氧乙烷烷基苯基醚甲醛縮合物等。
作為聚環氧乙烷芳基醚衍生物的具體例子(產品)，例如，可以列舉ニユ-コ-ル2604、ニユ-コ-ル710(都是環氧乙烷多環苯基醚；日本乳化劑公司制)、ニユ-コ-ル2608F(聚氧化亞烷基多環苯基醚；日本乳化劑公司制)、パイォニンD6310、パイォニンD6320(都是聚環氧乙烷苯乙烯苯基醚縮合物；竹本油脂公司生產)、ニツコ-ルR1020(聚環氧乙烷壬基苯基醚甲醛縮合物；日光化學品公司生產)等。
作為乙二胺四聚氧化亞烷基，例如，可以列舉乙二胺聚環氧乙烷-聚環氧丙烷縮合物、乙二胺四聚環氧乙烷、乙二胺四聚環氧丙烷等。
作為乙二胺四聚氧化亞烷基的具體例(產品)，可以列舉例如アデカプルロニツクTR704、アデカプルロニツクTR701、アデカプルロニツクTR913R(都是乙二胺聚環氧乙烷-聚環氧丙烷縮合物；旭電化公司制)、ユニル-ブ32TY-65BI(乙二胺四聚氧化亞烷基；日本油脂公司制)等。
聚環氧乙烷烷基胺、聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷烷基醚、聚環氧乙烷烯基醚、聚環氧乙烷芳基醚衍生物以及乙二胺四聚氧化亞烷基中的氧化亞烷鏈(氧乙烯鏈或者氧丙烯鏈)的聚合度優選為1～100，更優選為1～60。
作為聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯，可以列舉例如聚環氧乙烷苯乙烯化苯基醚硫酸酯、聚環氧乙烷芐基苯基醚硫酸酯等。
作為聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯的具體例(產品)，可以列舉，例如ニユ-コ-ル707SF、707SN、714SF、723SF、740SF(都由日本乳化劑公司生產)等。聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯中的氧乙烯鏈的聚合度優選為1～100，更優選為5～40。
在本發明中，也可以使用2種以上的非離子表面活性劑。作為本發明HDL膽固醇的測定方法中的非離子表面活性劑的濃度，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，但是在反應液中的濃度優選為0.0001～10％，更優選為0.001～1％。
作為本發明中的膽汁酸衍生物，可以列舉例如陰離子性膽汁酸衍生物、兩性膽汁酸衍生物、非離子膽汁酸衍生物等，優選為陰離子性膽汁酸衍生物。
作為陰離子膽汁酸衍生物，可以列舉例如膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝去氧膽酸或其鹽、熊去氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝去氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽、脫氫膽酸或其鹽等。作為鹽，可以列舉例如銨鹽、鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等。
作為兩性膽汁酸衍生物，可以列舉例如由通式(II)R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(II)[式中，R1為3-(3-膽酰胺丙基)二甲基銨基，R2為氫或羥基]表示的化合物[以下稱為化合物(II)]等。以下，把R2是氫的化合物(II)稱為CHAPS，把R2是羥基的化合物(I)稱為CHAPSO。
作為非離子膽汁酸衍生物，可以列舉例如通式(III) (X表示氫原子或者羥基，R3以及R4相同或不同，表示取代或非取代的烷基、或者取代或非取代的鏈烷酰基)表示的化合物[以下稱為化合物(III)]等。作為烷基、鏈烷酰基中的烷基，可以列舉直鏈或者分鏈的碳原子數1-10的例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。作為取代烷基以及取代鏈烷酰基中的取代基，可以列舉例如羥基、鹵原子等。鹵原子是指氟、氯、溴、碘各種原子。在化合物(III)中，優選R3以及R4都是COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH(以下稱為取代基A)的化合物。以下，把X、R3以及R4分別為氫原子、取代基A以及取代基A的化合物稱為deoxy-BIGCHAP，把分別為羥基、取代基A以及取代基A的化合物稱為BIGCHAP。
作為膽汁酸衍生物的濃度，只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度，就沒有特別的限制，優選在反應液中的濃度為0.001～10％，更優選為0.01～1％。
作為在本發明的HDL膽固醇測定方法中使用的水性介質，可以列舉例如去離子水、蒸餾水、緩沖液等，優選使用緩沖液。
作為在緩沖液中使用的緩沖劑，可以列舉例如三(羥基甲基)氨基甲烷緩沖劑、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、Good緩沖劑等。
作為Good緩沖劑，可以列舉例如2-嗎啉代乙烷磺酸(MES)、雙(2-羥基乙基)亞氨基三(羥基甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’-雙(2-乙烷磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、3-嗎啉代-2-羥基丙烷磺酸(MOPSO)、N，N-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)、N-[三(羥基甲基)甲基]-2-氨基乙烷磺酸(TES)、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸(HEPES)、3-[N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]-2-羥基丙烷磺酸(DIPSO)、N-[三(羥基甲基)甲基]-2-羥基-3-氨基丙烷磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-雙(2-羥基丙烷磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]-2-羥基丙烷磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]丙烷磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羥基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥基甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、N-環己基-2-氨基乙烷磺酸(CHES)、N-環己基-3-氨基-2-羥基丙烷磺酸(CAPSO)、N-環己基-3-氨基丙烷磺酸(CAPS)等。
緩沖液的濃度只要是適于測量的濃度，就沒有特別的限制，優選為0.001-2.0mol/L、更優選為0.005-1.0mol/L。
下面，對本發明的HDL膽固醇的測定方法、測定用試劑以及測定用試劑盒進行具體描述。
(HDL膽固醇的測定方法)作為本發明的HDL膽固醇的測定方法，例如，可以列舉以下方式的方法。
測定方法1(1)在含有非離子表面活性劑、聚陰離子以及白蛋白，根據需要還含有穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑、反應促進劑等的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，(2)根據需要，在過氧化氫測定用試劑或者還原型輔酶測定試劑的存在下，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶，(3)通過由(2)測定的值和預先制作的校正曲線算出試樣中的HDL膽固醇濃度，從而能夠測定試樣中的HDL膽固醇。
測定方法2(1)在含有非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白以及膽汁酸衍生物，根據需要還含有穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑、反應促進劑等的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，(2)根據需要，在過氧化氫測定用試劑或者還原型輔酶測定試劑的存在下，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶，(3)通過由(2)測定的值和預先制作的校正曲線算出試樣中的HDL膽固醇濃度，從而能夠測定試樣中的HDL膽固醇。
測定方法3(1)在含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物，根據需要還含有聚陰離子、白蛋白、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑、反應促進劑等水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，(2)根據需要，在過氧化氫測定用試劑或者還原型輔酶測定試劑的存在下，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶，(3)通過由(2)測定的值和預先制作的校正曲線算出試樣中的HDL膽固醇濃度，從而能夠測定試樣中的HDL膽固醇。
測定方法4(1)在含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯和陰離子性膽汁酸衍生物，根據需要還含有聚陰離子、白蛋白、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑、反應促進劑等水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，(2)根據需要，在過氧化氫測定用試劑或者還原型輔酶測定試劑的存在下，測定生成的過氧化氫或還原型輔酶，(3)通過由(2)測定的值和預先制作的校正曲線算出試樣中的HDL膽固醇濃度，從而能夠測定試樣中的HDL膽固醇。
作為水性介質，例如，可以列舉上述的水性介質等。作為穩定化劑，例如，可以列舉乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化鈣等。作為防腐劑，例如，可以列舉疊氮化鈉、抗生素等。作為影響物質消除劑，例如，可以列舉用于消除抗壞血酸影響的抗壞血酸氧化酶等。作為反應促進劑，例如，可以列舉輔脂肪酶、磷脂酶等酶、硫酸鈉、氯化鈉等鹽類等。
在本測定方法中，(1)以及的(2)反應在相同或不同的條件下，同時或者依次分別在例如10～50℃，優選為20～40℃下，進行1～60分鐘，優選2～30分鐘。
生成的過氧化氫的量，例如可以利用過氧化氫測定用試劑進行測定。過氧化氫測定用試劑是用于將生成的過氧化氫轉變成能夠檢測的物質的試劑。作為能夠檢測的物質，例如，可以列舉色素、光發射等，優選色素。當能夠檢測的物質是色素時，過氧化氫測定用試劑含有氧化顯色型發色體以及過氧化物酶等過氧化活性物質。作為氧化顯色型發色體，例如，可以列舉所述的氧化顯色型發色體。當能夠檢測的物質是光發射時，過氧化氫測定用試劑含有化學發光物質。作為化學發光物質，例如，可以列舉魯米諾、異魯米諾、光澤精、吖啶酯等。
當使用含有氧化顯色型發色體以及過氧化物酶等過氧化活性物質的試劑作為過氧化氫測定用試劑時，在過氧化活性物質的存在下，過氧化氫與氧化顯色型發色體反應而生成色素，通過對生成的色素定量，就能夠定量過氧化氫。另外，當使用含有化學發光物質的過氧化氫測定用試劑時，過氧化氫與化學發光物質反應而生成光子，通過對生成的光子定量，就能夠定量過氧化氫。
作為氧化顯色型發色體，例如可以列舉隱色體型發色體、氧化偶聯顯色型發色體等。隱色體型發色體是在過氧化氫以及過氧化物酶等過氧化活性物質的促在下單獨能夠轉化成色素的物質。
作為隱色體型發色體，例如可以列舉10-N-羧基甲基氨基甲酰基-3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧基甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)二苯基胺鈉鹽(DA-64)、4，4’-雙(二甲基氨基)二苯基胺、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶聯顯色型發色體是在過氧化氫以及過氧化物酶等過氧化活性物質的存在下，2個化合物發生氧化偶合而生成色素的物質。作為2個化合物的組合，可以列舉偶合劑和苯胺類的組合、偶合劑和苯酚類的組合等。
作為偶合劑，例如，可以列舉4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑啉酮肼等。作為苯胺類，可以列舉N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺基丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。
作為苯酚類，可以列舉苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
在過氧化氫的測定中，過氧化活性物質的濃度只要是適于測定的濃度，就沒有特別的限制，當使用過氧化物酶作為過氧化活性物質時，濃度優選為1～100kU/L。另外，氧化顯色型發色體的濃度只要是適于測定的濃度，就沒有特別的限制，優選為0.01～10g/L。
作為還原型輔酶的測定方法，例如可以列舉測定生成的還原型輔酶的吸光度的方法、使用還原型輔酶測定用試劑的方法等。在測定還原型輔酶吸光度的方法中的吸光度優選為300～500nm，更優選為330～400nm，特別優選為340nm附近。還原型輔酶測定用試劑是用于將生成的還原型輔酶轉化成能夠檢測的物質的試劑。作為能夠檢測的物質，例如可以列舉色素。當能夠檢測的物質是色素時，作為還原型輔酶測定用試劑，例如可以列舉含有黃遞酶、電子載體以及還原顯色型發色體的試劑。作為電子載體，例如可以列舉1-甲氧基-5-甲基吩嗪二甲硫醚等。當使用含有黃遞酶、電子載體以及還原顯色型發色體的試劑作為還原型輔酶測定用試劑的情況下，還原顯色型發色體被轉化而生成色素，通過定量所得色素，就能夠定量還原型輔酶。
作為還原顯色型發色體，可以列舉例如3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑鎓(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓一鈉鹽(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓一鈉鹽(WST-3)等。
(HDL膽固醇測定用試劑)
作為本發明的HDL膽固醇測定用試劑，例如，列舉以下式樣的試劑。
試劑1含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑2含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑。
試劑3含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白以及氧化型輔酶的試劑。
試劑4含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶的試劑。
試劑5含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑試劑6含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽汁酸衍生物、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑7含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑8含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、陰離子性膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑9
含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯、陰離子性膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑試劑10含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯以及氧化型輔酶的試劑。
試劑11含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、陰離子性膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶的試劑。
試劑12含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯、陰離子性膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶的試劑。
試劑13含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑14含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、陰離子性膽汁衍生物、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑15含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、聚環氧乙烷烷基胺或聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯、陰離子性膽汁酸衍生物、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
在本發明的HDL膽固醇測定用試劑中，可以使用上述本發明的HDL膽固醇測定方法中列舉的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽汁酸衍生物、過氧化氫測定用試劑、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑。
(HDL膽固醇測定用試劑盒)本發明的HDL膽固醇測定用試劑也可以以試劑盒的形式保存、流通以及使用。作為試劑盒的形式，沒有特別的限制，可以任意為2試劑體系、3試劑體系等，但是，優選為2試劑體系。
在由第一試劑和第二試劑組成的2試劑體系的HDL膽固醇測定用試劑盒中，可以在第一試劑和第二試劑中分別含有膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶，也可以在第二試劑中同時含有膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶，當在第一試劑和第二試劑中分別含有的情況下，優選在第一試劑中含有膽固醇酯水解酶，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶的方式。還可以在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有聚陰離子，優選在第一試劑中含有。還可以在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有非離子表面活性劑和白蛋白。還可以在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有采用膽固醇脫氫酶的測定方法中使用的氧化型輔酶。
可以在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有過氧化氫測定用試劑，當該試劑含有氧化偶聯型發色體的情況下，優選在分別的試劑中含有氧化偶聯型發色體的各自化合物的方式。還可以在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有還原型輔酶測定用試劑。另外，還可以在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有膽汁酸衍生物。
對于本發明的試劑盒，例如，列舉如下的方式。
高密度脂白蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于任意地在第一試劑、第二試劑或者兩者中含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、非離子表面活性劑、白蛋白以及過氧化氫測定試劑，根據需要還含有膽汁酸衍生物、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶。
高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，其特征在于包括含有聚陰離子的第一試劑和含有膽固醇氧化酶的第二試劑，在第一試劑、第二試劑或者兩者中任意地含有膽固醇酯水解酶、非離子表面活性劑、白蛋白以及過氧化氫測定試劑，根據需要還含有膽汁酸衍生物、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑。
高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于在第一試劑、第二試劑或者兩者中任意地含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、非離子表面活性劑、白蛋白以及氧化型輔酶，根據需要還含有還原型輔酶測定用試劑、膽汁酸衍生物、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑，在第二試劑中含有膽固醇脫氫酶。
高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，其特征在于包括含有聚陰離子的第一試劑和含有膽固醇脫氫酶的第二試劑，在第一試劑、第二試劑或者兩者中任意地含有膽固醇酯水解酶、非離子表面活性劑、白蛋白以及氧化型輔酶，根據需要還含有還原型輔酶測定用試劑、膽汁酸衍生物、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑。
高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于在第一試劑、第二試劑或者兩者中任意地含有膽固醇酯水解酶、聚環氧乙烷烷基胺或聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定試劑，根據需要還含有聚陰離子、白蛋白、穩定劑、防腐劑以及影響物質消除劑，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶。
高密度脂蛋白中的膽固醇測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于在第一試劑、第二試劑或者兩者中任意地含有膽固醇酯水解酶、聚環氧乙烷烷基胺或聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶，根據需要還含有還原型輔酶測定試劑、聚陰離子、白蛋白、穩定劑、防腐劑以及影響物質消除劑，在第二試劑中含有膽固醇脫氫酶。
為了更詳細地說明本發明，例如，列舉如下方式的試劑盒，這些實施方式并不對本發明的范圍構成任何限制。
試劑盒1第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒2第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒3第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒4第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒5第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒6第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒7第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白以及非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒8第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒9第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白以及非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒10第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白以及非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑盒11第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑盒12第一試劑含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、白蛋白以及非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶、膽汁酸衍生物以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑盒13第一試劑含有聚陰離子、白蛋白以及非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑試劑盒14第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶以及膽汁酸衍生物的試劑。
試劑盒15
第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒16第一試劑含有聚陰離子、白蛋白以及非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑盒17第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑以及膽汁酸衍生物的試劑。
試劑盒18第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、非離子表面活性劑以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶測定用試劑的試劑。
試劑盒19第一試劑含有聚陰離子、白蛋白以及過氧化氫測定用試劑的試劑第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒20第一試劑含有聚陰離子、白蛋白、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒21第一試劑含有聚陰離子、白蛋白以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、非離子表面活性劑、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒22第一試劑含有聚陰離子以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、白蛋白、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒23第一試劑含有聚陰離子、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、白蛋白、非離子表面活性劑以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒24第一試劑含有聚陰離子以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、白蛋白、非離子表面活性劑、膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒25第一試劑含有陰離子性膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒26第一試劑含有過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、陰離子性膽汁酸衍生物、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒27第一試劑含有聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及過氧化氫測定用試劑的試劑。
試劑盒28第一試劑含有過氧化氫測定用試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及過氧化氫測定試劑的試劑。
在本發明的HDL膽固醇測定用試劑盒中，可以使用在上述本發明的HDL膽固醇的測定方法中列舉的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、非離子表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽汁酸衍生物、過氧化氫測定用試劑、氧化型輔酶、還原型輔酶測定用試劑。
在本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒中，根據需要還可以含有上述的水性介質、穩定劑、防腐劑、影響物質消除劑、反應促進劑等。
本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒可以是冷凍干燥的狀態，也可以是溶解在水性介質中的狀態。當使用冷凍干燥狀態的試劑測定試樣中的HDL膽固醇時，將該試劑溶解在水性介質中而使用。
本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒中的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶的含量優選在溶解于水性介質的狀態下的濃度為0.01～800U/mL的含量，更優選為0.02～400U/mL的含量。本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒中的非離子表面活性劑的含量優選在溶解于水性介質的狀態下的濃度為0.0001～10％的含量，更優選為0.001～5％的含量。本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒中的聚陰離子的含量優選在溶解于水性介質的狀態下的濃度為0.001～10％的含量，更優選為0.01～5％的含量。
本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒中的白蛋白含量優選在溶解于水性介質的狀態下的濃度為0.001～10％的含量，更優選為0.01～5％的含量。本發明的HDL膽固醇測定用試劑以及測定用試劑盒中的膽汁酸衍生物的含量優選在溶解于水性介質的狀態下的濃度為0.001～10％的含量，更優選為0.01～5％的含量。
以下，通過實施例對本發明進行更詳細地說明，但是，這些實施例并不對本發明的范圍構成任何限制。而且，在本實施例中，使用下面的生產商的試劑以及酶。
HEPES(BDH Laboratory公司生產)、EMSE(ダイト-化學公司制)、硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬)(Pharmacia公司制)、硫酶葡聚糖鈉(分子量8萬)(ICN公司制)、ι-卡拉膠(純正化學公司制)、肝素鋰(和光純藥公司制)、磷鎢酸鈉(關東化學公司制)、牛血清白蛋白(BSA；Oriental制)、4-氨基安替比林(琦京化成公司制)、過氧化物酶(東洋紡績公司制)、LPL311(膽固醇酯水解酶；東洋紡績公司制)、COO321(膽固醇氧化酶；東洋紡績公司制)、LPL6(膽固醇酯水解酶；天野酶公司制)、ナイミ-ン L207(聚環氧乙烷十二烷基胺；日本油脂公司制)、ナイミ-ン S204(聚環氧乙烷十八烷基胺；日本油脂公司制)、ナイミ-ンS210(聚環氧乙烷十八烷基胺；日本油脂公司制)、ニユ-コ-ルOD420(聚環氧乙烷十八烷基胺；日本乳化劑公司制)、パイォニンD3104(聚環氧乙烷月桂基胺；竹本油脂公司制)、パイォニンD3110(聚環氧乙烷月桂基胺；竹本油脂公司制)、パイォニンD3605[聚環氧乙烷烷基(大豆)胺；竹本油脂公司制]、ニユ-コ-ル2608F(聚氧化亞烷基多環苯基醚；日本乳化劑公司制)、ニユ-コ-ルR1020(聚環氧乙烷壬基苯基醚甲醛縮合物；日光化學品公司公司制)、アデカプルロニツクTR704(乙二胺聚環氧乙烷-聚環氧丙烷縮合物；旭電化公司制)、エマルミンL90S(聚環氧乙烷月桂基醚；三洋化成公司制)、膽酸鈉(ACROS公司制)、牛磺膽酸鈉(東京化成公司制)、ニユ-コ-ル740-SF、ニユ-コ-ル707-SF(都是聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯鹽；日本乳化劑公司制)。
實施發明的最佳方式參考例1化學修飾LP311(經過化學修飾的LPL311)的調制向HEPES緩沖液(pH8.5，0.15mol/L)中添加LPL311，并使其濃度為33g/L，冷卻至5℃后，添加サンブライトVFM-4101(日本油脂公司制)，并使其濃度為330g/L，進一步反應3小時。不對所得修飾酶溶液進行精制分離，并直接用作為化學修飾LPL311。
實施例1 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑A)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬)1.0g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例2 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑A)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬)1.0g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例3 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑c)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L膽酸鈉6.0g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/L實施例4 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑A)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑d)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L膽酸鈉6.0g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL3110.2kU/L
COO321 3.0kU/L比較例1 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒第一試劑(試劑B)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/LBSA 2.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10mmol/L4氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L比較例2 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑C)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬)1.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L比較例3 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑D)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/Lナイミ-ンL2070.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L比較例4 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑E)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA 2.0g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L比較例5 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑F)HEPES(pH7.5) 10mmol/F
EMSE 0.3g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL2070.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L比較例6 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑G)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/Lナイミ-ンL2070.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例5 HDL膽固醇的測定使用實施例1的試劑盒，并利用日立7170型自動分析裝置而測定血清40個試樣中的HDL膽固醇。
(1)校正曲線的制作使用生理鹽水(HDL膽固醇濃度0.0mg/dL)以及血清(HDL膽固醇濃度60.0mg/dL)作為標準溶液，使用實施例1的試劑盒作為試劑盒，并利用日立7170型自動分析裝置制作表示HDL膽固醇濃度和“吸光度”之間的關系的校正曲線。
這里所謂“吸光度”，表示在以下反應測定的2個吸光度(E1以及E2)的基礎上，從E2減去E1而得到的值。
向反應池添加標準溶液(3μL)和第一試劑(0.24mL)，在37℃下加熱5分鐘，利用主波長600nm、副波長700nm測定反應液的吸光度(E1)，接著，向該反應液添加第二試劑(0.08mL)，進一步在37℃下加熱5分鐘，利用主波長600nm、副波長700nm測定反應液的吸光度(E2).
(2)通過人類血清試樣和實施例1的試劑盒的反應而計算該試樣的“吸光度”除了使用人類血清試樣而替代在制作(1)的校正曲線中使用的標準溶液以外，利用與計算(1)的“吸光度”的方法相同的方法，計算該試樣的“吸光度”。
(3)人類血清試樣中的HDL膽固醇濃度的測定通過(2)計算的“吸光度”和(1)制作的校正曲線，測定各試樣中的HDL膽固醇濃度。
實施例6 HDL膽固醇的測定除了使用實施例2的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例7 HDL膽固醇的測定除了使用實施例3的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例8 HDL膽固醇的測定除了使用實施例4的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例7 HDL膽固醇的測定除了使用比較例1的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例8 HDL膽固醇的測定除了使用比較例2的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例9 HDL膽固醇的測定除了使用比較例3的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例10 HDL膽固醇的測定除了使用比較例4的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例11 HDL膽固醇的測定除了使用比較例5的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例12 HDL膽固醇的測定除了使用比較例6的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5相同的測定方法，并利用日立7170自動分析裝置而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
接著，利用實施例5～8以及比較例7～12的測定中使用的人類血清40個試樣，并通過《臨床化學》Clinical Chemistry-第45卷，10號(1999年)記載的DCM法(Designated Comparison Method)測定該試樣中的HDL膽固醇，并與各實施例以及比較例的值進行比較。
在表1中表示實施例5～8以及比較例7～12各自的測定法與利用DCM法的測定法之間的相關系數。
表1

通過比較實施例5和比較例7～12，可以知道只有在使用除了膽固醇測定用酶以外而含有BSA、硫酶葡聚糖鈉以及聚環氧乙烷烷基胺全部的試劑盒的測定中，才能夠得到與通過DCM法的測定良好的相關系數。通過比較實施例5和實施例6，可以判斷即使在使用經過化學修飾的膽固醇酯水解酶的測定中，也能夠獲得與通過DCM法的測定良好的相關系數。通過比較實施例5和實施例7，以及比較實施例6和實施例8，可以認識到在使用除了膽固醇測定用酶、BSA、硫酶葡聚糖鈉、聚環氧乙烷烷基胺以外而添加作為膽汁酸衍生物之一的膽酸鈉的試劑盒的測定中，也能獲得與通過DCM法的測定良好的相關性。
實施例9 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑H)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量8萬)0.5g/LBSA2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L
第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例10 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑I)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/Lι-卡拉膠 0.5g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例11 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑J)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L肝素鋰 0.5g/LBSA 2.0g/L
ナイミ-ンL2070.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例12 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑K)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L磷鎢酸鈉 0.5g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL2070.07g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例13 HDL膽固醇的測定除了使用實施例9的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例14 HDL膽固醇的測定除了使用實施例10的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例15 HDL膽固醇的測定除了使用實施例11的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例16 HDL膽固醇的測定除了使用實施例12的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
在表2中表示實施例13～16各自的測定法與利用DCM法的測定法之間的相關系數。
表2

通過比較實施例5和實施例13～16，可以知道即使在使用除硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬)以外的聚陰離子的情況下，也能夠獲得與通過DCM法的測定良好的相關系數。
實施例17 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑L)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L
硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA2.0g/Lニユ-コ-ルOD4200.05g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例18 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑M)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA2.0g/LパイォニンD36050.01g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例19 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑N)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA 2.0g/LエマルミンL90S 0.05g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例20 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑O)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA 2.0g/Lニツコ-ル2608F 0.2g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例21 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑P)
HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA2.0g/Lニツコ-ルR1020 0.2g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例22 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑Q)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA2.0g/LアデカプルロニツクTR7041.5g/L第二試劑(試劑a)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例23 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑Q)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA2.0g/LアデカプルロニツクTR7041.5g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例24 HDL膽固醇的測定除了使用實施例17的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例25 HDL膽固醇的測定除了使用實施例18的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例26 HDL膽固醇的測定除了使用實施例19的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例27 HDL膽固醇的測定除了使用實施例20的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例28 HDL膽固醇的測定除了使用實施例21的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例29 HDL膽固醇的測定除了使用實施例22的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例30 HDL膽固醇的測定除了使用實施例23的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。在表3中表示實施例24～30各自的測定法與通過DCM的測定法之間的相關系數。
表3

可以知道與實施例5相同，即使在使用ナイミ-ンL207(聚環氧乙烷十二烷基胺)以外的非離子表面活性劑的情況下，也能夠獲得與DCM法的測定良好的相關系數。另外，通過比較實施例29和實施例30，可以知道即使在使用經過化學修飾的膽固醇酯水解酶的測定中，也能夠獲得與通過DCM法的測定良好的相關系數。
實施例31 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑R)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L牛磺膽酸鈉 2.7g/L第二試劑(試劑e)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/LパイオニンD3104 0.05g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例32 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑R)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L牛磺膽酸鈉 2.7g/L第二試劑(試劑f)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/Lナイミ-ン S204 0.05g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例33 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑R)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L牛磺膽酸鈉2.7g/L第二試劑(試劑g)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/Lナイミ-ン S2100.05g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL3110.2kU/LCOO3213.0kU/L實施例34 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑S)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L膽酸鈉2.0g/L第二試劑(試劑g)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/Lナイミ-ン S2100.05g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL3110.2kU/LCOO3213.0kU/L實施例35 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑T)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L甘氨膽酸鈉 2.4g/L第二試劑(試劑g)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/Lナイミ-ン S210 0.05g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例36 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑D)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑d)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L膽酸鈉 6.0g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例37 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑F)
HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑d)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L膽酸鈉6.0g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL3110.2kU/LCOO3213.0kU/L實施例38 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑G)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/Lナイミ-ンL207 0.07g/L第二試劑(試劑d)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L膽酸鈉6.0g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL3110.2kU/LCOO3213.0kU/L比較例13 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑R)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L牛磺膽酸鈉 2.7g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例14 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑S)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L膽酸鈉 2.0g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例15 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑T)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L
甘氨膽酸鈉 2.4g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例16 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑U)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二試劑(試劑e)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例17 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑U)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二試劑(試劑f)HEPES(pH 7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/Lナイミ-ンS204 0.05g/L
過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL3110.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例18 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用的試劑盒。
第一試劑(試劑U)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L第二試劑(試劑g)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/Lナイミ-ンS210 0.05g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例39 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例40 HDL膽固醇的測定除了使用實施例32的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例41 HDL膽固醇的測定除了使用實施例33的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例42 HDL膽固醇的測定除了使用實施例34的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例43 HDL膽固醇的測定除了使用實施例35的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例44 HDL膽固醇的測定除了使用實施例36的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例45 HDL膽固醇的測定除了使用實施例37的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例46 HDL膽固醇的測定除了使用實施例38的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例19 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代比較例13的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例20 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代比較例14的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例21 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代比較例15的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例22 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代比較例16的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例23 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代比較例17的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例24 HDL膽固醇的測定除了使用實施例31的試劑盒而替代比較例18的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
在表4中表示實施例39～46以及比較例19～21各自的測定法與通過DCM的測定法之間的相關系數。
表4

通過比較實施例39～43和比較例19～24，可以知道含有陰離子性膽汁酸衍生物和聚環氧乙烷烷基胺的試劑盒的測定與通過DCM法的測定的相關系數優于只含有陰離子性膽汁酸衍生物或聚環氧乙烷烷基胺的試劑盒的測定。另外，通過比較實施例44和實施例45～46，可以認為在使用除了膽固醇測定用酶、陰離子性膽汁酸衍生物、聚環氧乙烷烷基胺外，還添加了葡聚糖硫酸或者白蛋白的試劑盒的測定中，也能夠獲得與通過DCM法的測定的良好的關聯性。
實施例47 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑V)HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE 0.3g/Lニユ-コ-ル740SF 0.5g/L第二試劑(試劑h)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/LパイオニンD3110 0.05g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例48 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑W)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/Lニユ-コ-ル707SF 0.5g/L第二試劑(試劑i)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/Lナイミ-ン L207 0.1g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例49 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑W)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L
ニユ-コ-ル707SF 0.5g/L第二試劑(試劑h)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/LパイォニンD3110 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例50 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑X)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬)1.0g/Lニユ-コ-ル707SF 0.5g/L第二試劑(試劑h)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/LパイォニンD3110 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例51 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑Y)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L
BSA2.0g/Lニユ-コ-ル707SF0.5g/L第二試劑(試劑h)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/Lパイォニン D3110 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例52 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑Z)HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酶葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/LBSA2.0g/Lニユ-コ-ル707SF0.5g/L第二試劑(試劑h)HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/LパイォニンD31100.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例25 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑V)
HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/Lニユ-コ-ル740SF 0.5g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例26 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑W)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/Lニユ-コ-ル707SF 0.5g/L第二試劑(試劑b)HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例27 HDL膽固醇測定用試劑盒調制由以下的第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇測定用試劑盒。
第一試劑(試劑U)HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L第二試劑(試劑h)
HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/LパイォニンD3110 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311 0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例53 HDL膽固醇的測定除了使用實施例47的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例54 HDL膽固醇的測定除了使用實施例48的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例55 HDL膽固醇的測定除了使用實施例49的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例56 HDL膽固醇的測定除了使用實施例50的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例57 HDL膽固醇的測定除了使用實施例51的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
實施例58 HDL膽固醇的測定除了使用實施例52的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例28 HDL膽固醇的測定除了使用比較例25的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例29 HDL膽固醇的測定除了使用比較例26的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
比較例30 HDL膽固醇的測定除了使用比較例27的試劑盒而替代實施例1的試劑盒以外，通過與實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析試劑盒而測定人類血清40個試樣中的HDL膽固醇。
在表5中表示實施例53～58以及比較例28～30各自的測定法與通過DCM的測定法之間的相關系數。
表5

通過比較實施例53～55和比較例28～30，可以知道含有聚環氧乙烷多環苯基硫酸酯和聚環氧乙烷烷基胺的試劑盒的測定與通過DCM法的測定的相關系數優于只含有聚環氧乙烷多環苯基硫酸酯或聚環氧乙烷烷基胺的試劑盒的測定。另外，通過比較實施例55和實施例56～58，可以認為在使用除了膽固醇測定用酶、聚環氧乙烷多環苯基硫酸酯、聚環氧乙烷烷基胺之外，還添加了硫酸葡聚糖和/或白蛋白的試劑盒的測定中，也能夠獲得與通過DCM法的測定的良好的關聯性。
實施例59 M蛋白血癥患者的血清中的HDL膽固醇的測定使用取自M蛋白血癥患者的血清作為試樣，使用實施例1的試劑盒作為測定用試劑盒，并通過實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析裝置而測定HDL膽固醇。向試樣中添加第一試劑，反應5分鐘，在表6中表示所得的吸光度，即添加第二試劑前的反應液的吸光度(E1)的值，在表7中表示HDL膽固醇的測定值。另外，作為比較值，在表7中還表示通過DCM法測定該取自M蛋白血癥患者的血清時的測定值。
比較例31 M蛋白血癥患者的血清中的HDL膽固醇的測定使用取自M蛋白血癥患者的血清作為試樣，使用比較例5的試劑盒作為測定用試劑盒，并通過實施例5的測定法，并利用日立7170自動分析裝置而測定HDL膽固醇。向試樣中添加第一試劑，反應5分鐘，在表6中表示所得的吸光度，即添加第二試劑前的反應液的吸光度(E1)的值，在表7中表示HDL膽固醇的測定值。
表6

如表6所示，可以知道當使用比較例5的測定試劑盒時，即使在添加第二試劑前，由不溶于水的蛋白引起的混濁也不會消失，當使用含有硫酶葡聚糖鈉的實施例1的測定試劑盒的情況下，在添加第二試劑前，由不溶于水的蛋白引起的混濁消失。
表7

如表7所示，使用實施例1的試劑盒的測定(實施例59)值與通過DCM法的測定值大致相同，使用比較例5的試劑盒的測定(比較例31)值與利用實施例59的方法或DCM法的測定值相差很大，并沒有反映出正確的測定。如上所述，可以明白通過使用本發明的試劑盒，能夠正確地測定M蛋白血癥患者試樣中的HDL膽固醇。
工業實用性本發明提供能夠簡便、且正確地測定的HDL膽固醇的測定方法、測定用試劑以及測定用試劑盒。
權利要求
1.試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于在含有非離子性表面活性劑、聚陰離子以及白蛋白的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶、或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
2.如權利要求1所述的測定方法，其中，水性介質含有膽汁酸衍生物。
3.如權利要求2所述的測定方法，其中，膽汁酸衍生物為陰離子性膽汁酸衍生物。
4.如權利要求1～3任一項所述的測定方法，其中，非離子性表面活性劑為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺。
5.如權利要求1～4任一項所述的測定方法，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
6.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有非離子性表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑。
7.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有非離子性表面活性劑、聚陰離子、白蛋白、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶。
8.如權利要求7所述的試劑，其中，進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
9.如權利要求6～8任一項所述的試劑，其中，進一步含有膽汁酸衍生物。
10.如權利要求9所述的試劑，其中，膽汁酸衍生物是陰離子性膽汁酸衍生物。
11.如權利要求6～10任一項所述的試劑，其中，非離子表面活性劑為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺。
12.如權利要求6～11任一項所述的試劑，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
13.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，由第一試劑以及第二試劑組成，其特征在于第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、非離子性表面活性劑、白蛋白以及過氧化氫測定試劑，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶。
14.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于包括含有聚陰離子的第一試劑和含有膽固醇氧化酶的第二試劑，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、非離子性表面活性劑、白蛋白以及過氧化氫測定試劑。
15.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于第二試劑中含有膽固醇脫氫酶，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、聚陰離子、非離子性表面活性劑、白蛋白以及氧化型輔酶。
16.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于包括含有聚陰離子的第一試劑和含有膽固醇脫氫酶的第二試劑，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都含有膽固醇酯水解酶、非離子性表面活性劑、白蛋白以及氧化型輔酶。
17.如權利要求15或者16所述的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
18.如權利要求13～17任一項所述的試劑盒，其中，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者都進一步含有膽汁酸衍生物。
19.如權利要求18所述的試劑盒，其中，膽汁酸衍生物為陰離子性膽汁酸衍生物。
20.如權利要求13～19任一項所述的試劑盒，其中，非離子性表面活性劑為聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺。
21.如權利要求13～20任一項所述的試劑盒，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
22.試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于在含有i)非離子性表面活性劑、聚陰離子以及白蛋白或者ii)聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
23.試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法，其特征在于在含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
24.如權利要求23所述的方法，其中，進一步含有聚陰離子。
25.如權利要求23或者24所述的方法，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
26.如權利要求23～25任一項所述的方法，其中，進一步含有白蛋白。
27.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及過氧化氫測定用試劑。
28.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑，其特征在于含有聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶。
29.如權利要求28所述的試劑，其中，進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
30.如權利要求27～29任一項所述的試劑，其中，進一步含有聚陰離子。
31.如權利要求30所述的試劑，其中，聚陰離子為硫酸葡聚糖或其鹽。
32.如權利要求27～31任一項所述的試劑，其中，進一步含有白蛋白。
33.高密度脂蛋白中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于由第一試劑以及第二試劑組成，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者任意地含有膽固醇酯水解酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物以及過氧化氫測定試劑，在第二試劑含有膽固醇氧化酶。
34.高密度脂蛋白質中膽固醇的測定用試劑盒，其特征在于由第一試劑以及第二試劑組成，第一試劑、第二試劑的其中之一或者兩者任意地含有膽固醇酯水解酶、聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺、聚環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或者陰離子性膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶，在第二試劑中含有膽固醇脫氫酶。
35.如權利要求34所述的試劑盒，其中，進一步含有還原型輔酶測定用試劑。
36.如權利要求33～35任一項所述的試劑盒，其中，進一步含有聚陰離子。
37.如權利要求33～36任一項所述的試劑盒，其中，進一步含有白蛋白。
全文摘要
試樣中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法以及試劑，其特征在于在含有i)非離子性表面活性劑、聚陰離子以及白蛋白或者ii)聚環氧乙烷烷基胺或者聚環氧乙烷烯基胺以及環氧乙烷多環苯基醚硫酸酯或陰離子膽汁酸衍生物的水性介質中，使試樣和i)膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶、或者ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶反應，測定生成的過氧化氫或者還原型輔酶。
文檔編號C12Q1/60GK1694965SQ200380100779
公開日2005年11月9日 申請日期2003年10月16日 優先權日2002年10月16日
發明者片山有基, 藤中真由美 申請人:協和梅迪克斯株式會社