專利名稱：生產γ-谷氨酰半胱氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種產γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、培養該酵母菌株的方法以及利用該酵母菌株細胞制備的食品。一種含有γ-谷氨酰半胱氨酸的材料和一種由γ-谷氨酰半胱氨酸制備得到的含半胱氨酸的材料可應用于食品領域。
背景技術：
半胱氨酸可用于增強食品的風味等等。已知的半胱氨酸生產方法包括，例如，蛋白水解法和半合成法，這些方法目前基本上還在使用。盡管含有半胱氨酸含量的天然食物材料已經被要求用來增加食品的風味，但是已知的這種天然材料非常少。另一方面，有報道稱對含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物進行熱處理或酶處理可以產生具有高半胱氨酸含量的食物材料(WO 00/30474)。
γ-谷氨酰半胱氨酸是以半胱氨酸和谷氨酸為底物由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶作用合成的。另一方面，谷胱甘肽是以γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸為底物由谷胱甘肽合成酶作用合成的。已經報道一種谷胱甘肽合成酶基因被破壞的酵母能夠累積γ-谷氨酰半胱氨酸(Otake et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。
具有高含量γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母已經在WO 00/30474，Otake et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990，Chris et al.，Molecular Biology ofthe Cell.，8，1699-1707，1997，Inoue et al.，Biochimca et Biophysica Acta，1395，315-320，1998等文獻中報道。然而，這些文獻沒有公開這些谷胱甘肽合成酶基因被破壞或衰減(weakened)以累積大量γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的培養條件。
培養酵母以在其細胞中累積大量谷胱甘肽——γ-谷氨酰半胱氨酸的一種代謝產物——的方法已經被公開(JP 48-92579A等)。該文獻描述了當在培養酵母過程中添加半胱氨酸(谷胱甘肽的一種組成氨基酸)時，谷胱甘肽的累積量得到提高。因此，認為在培養谷胱甘肽合成酶基因被破壞或衰減的酵母過程中，添加半胱氨酸可以累積大量的γ-谷氨酰半胱氨酸。然而，由于含有γ-谷氨酰半胱氨酸的物質可用于制備含有半胱氨酸的物質，因此，從經濟角度考慮，為獲得含有半胱氨酸的物質而在培養含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母時添加半胱氨酸并不切實可行。
另外，Otake等還報道了在培養一種谷胱甘肽合成酶基因已被破壞的酵母——YL1菌株過程中，添加3mM半胱氨酸時，酵母細胞中的γ-谷氨酰半胱氨酸含量(Otake et al.，Agric.Biol.Chem.，54(12)，3145-3150，1990)。該文獻表明在半胱氨酸存在下培養γL1菌株時，累積的γ-谷氨酰半胱氨酸量是0.533％，而在不存在半胱氨酸時培養該菌株，γ-谷氨酰半胱氨酸的量是0.518％。這一結果暗示，在培養谷胱甘肽合成酶基因被破壞或衰減的酵母過程中添加半胱氨酸并不實用。
還有報道表明，當MET25基因的表達被增強時，酵母細胞中的谷胱甘肽含量有所提高。進一步地，作為提高MET25基因表達的方法，已經報道了一種利用MET4突變基因的方法(Omura et al.，FEBS Letters 387(1996)179-183和JP10-33161A)和一種利用MET30突變基因的方法(DOMINIQUE ET et al.，MOLECULAR AND CELLUAR BIOLOGY，Dec 1995，第6526-6534頁)。
MET25基因的表達機制如下。即，MET4基因產物對MET25基因表達起正調控作用。通常，MET4基因產物與MET30基因產物以及其它幾種蛋白質形成了SCFMET30復合體，通過26S蛋白酶體蛋白水解系統，MET4基因產物與MET30基因產物一起被遍在蛋白化作用(ubiquitinated)并分解，因此，MET25基因的表達被抑制。另一方面，當SCFMET30復合體的功能被降低的時候，MET4基因產物和MET30基因產物不被分解，MET25基因得以表達(Patton et al，GenesDev.12692-705，1998 and Rouillon et al.，EMBO Journal 19282-294，2000)。
這些報道表明γ-谷氨酰半胱氨酸的含量也可以在那些通過增強MET25基因的表達而具有高γ-谷氨酰半胱氨酸含量的酵母中得到提高。
另外，有報道表明，當“日本米酒(sake)”酵母在缺乏泛酸鈣(calciumpanthotenate)條件下培養時，酵母在其對數生長期累積硫化氫。該報道焦點集中在從半胱氨酸到硫化氫的形成，它還描述了這一現象在缺乏泛酸條件下得到進一步促進。
發明內容
基于以上提到的技術背景，本發明的一個目的是提供一種適于生產γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母菌株、一種利用這樣的酵母菌株生產γ-谷氨酰半胱氨酸的方法以及使用這樣的酵母菌株獲得的含有γ-谷氨酰半胱氨酸的食品或飲料。
本發明的發明人已經考慮到在培養酵母過程中酵母細胞中累積的γ-谷氨酰半胱氨酸的量并不需要保持不變，而可以在即將收獲酵母細胞之前累積到所需量的γ-谷氨酰半胱氨酸。基于這一考慮，本發明發明人進行了廣泛的研究，結果發現，通過在酵母所需最小量的泛酸存在下培養增殖酵母后，在泛酸限制條件下培養酵母，累積的γ-谷氨酰半胱氨酸的量即得到提高，其中所述酵母能夠生產γ-谷氨酰半胱氨酸，并且為泛酸缺陷型。因此，發明人完成了本發明。
即，本發明如下(1)一種具有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力的泛酸缺陷型酵母，其中當酵母被培養于含有有限量泛酸的培養基中時，單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量隨時間而增加。
(2)根據(1)中的酵母，該酵母經過修飾使得細胞內谷胱甘肽合成酶活性降低或消除。
(3)根據(1)或(2)的酵母，該酵母經過修飾使得MET25基因的表達被去抑制(derepressed)。
(4)根據(3)的酵母，其中MET25基因表達通過錨定(harboring)突變MET30基因而去抑制，所述突變基因具有的一個突變導致由絲氨酸之外的氨基酸取代了MET30基因編碼蛋白質第569位的絲氨酸。
(5)根據(4)的酵母，其中絲氨酸之外的氨基酸是苯丙氨酸。
(6)根據(1)至(5)的酵母，其為釀酒酵母屬(Saccharomyces)。
(7)一種制備可在體內累積γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的方法，包括在含有足量泛酸的培養基中培養(1)至(6)中任一酵母以使其增殖的步驟，以及在含有有限量泛酸的培養基中培養酵母細胞，以提高酵母細胞中的γ-谷氨酰半胱氨酸含量的步驟。
(8)一種食品或飲料，其含有通過在合適條件下培養(1)至(6)中任一酵母所獲得的培養物，含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養物的分級產物，或者是通過熱處理產生了半胱氨酸的培養物或分級產物。
(9)根據(8)的食品或飲料，其選自酒精飲料、面包食品或發酵的食品調味物質。
(10)一種酵母抽提物，由合適條件下培養(1)至(6)中任一酵母所獲得的培養物制備。
(11)一種制備含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品或飲料的方法，包括在合適條件下培養(1)至(6)中任一酵母，將獲得的培養物或其分級產物、或者熱處理后的培養物或分級產物與食品或飲料原材料混合，并將混合物加工成食品或飲料。
(12)一種酵母，其中MET25基因的表達被去抑制，去抑制的原因是酵母中錨定突變的MET30基因，該突變基因帶有的一個突變導致苯丙氨酸取代了MET30基因編碼蛋白質第569位的絲氨酸。
圖1是顯示在含有或不含泛酸鈣的培養基中培養酵母GMP菌株，細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量的時間過程圖。
圖2是顯示在GM株和GMP株之間γ-谷氨酰半胱氨酸含量的比較圖。
圖3是顯示在含有或不含泛酸鈣的培養基中培養酵母AJ14861菌株，細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量的時間過程圖。
發明詳述下文中將對本發明進行詳細描述。
<1>本發明的酵母本發明的酵母具有γ-谷氫酰半胱氨酸生產能力并且是泛酸缺陷型。此外，本發明的酵母當被培養于含有有限量泛酸的培養基中時，單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量隨時間而增加。
本發明中，“一種γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力”的意思是“一種比野生型菌株在細胞中累積更大量γ-谷氨酰半胱氨酸的能力”。優選地，其意味著在含有足量泛酸的培養基上培養酵母之后，在含有有限量泛酸的培養基中培養時，單位干酵母細胞內能夠累積1％或更多的γ-谷氨酰半胱氨酸。更優選地，其意味著除以上所述累積的γ-谷氨酰半胱氨酸的量之外，單位干酵母細胞中累積的谷胱甘肽的量是0.1％或更少。
單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的累積量為例如，105℃熱處理4小時后，酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸或谷胱甘肽的含量(重量％)。
具有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力的酵母的例子包括細胞內谷胱甘肽合成酶活性被減少或去除的，被修飾而使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增強的酵母，或者細胞內谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的并且被修飾而使得γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性增強的酵母。
細胞內谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的酵母可以使用DNA通過基因取代方法而獲得，所述DNA含有一個通過去除部分基因序列而被修飾從而不產生具有正常功能酶的谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)，或者一個帶有能夠降低酶活性的突變的谷胱甘肽合成酶基因(下文中簡稱為“突變GSH2基因”)。此外，細胞內谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的酵母可以通過對野生型酵母菌株進行一般的突變處理——例如紫外線照射或誘變劑——而獲得，所述誘變劑例如N-甲基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝酸或吖啶。可以通過PCR等方法來證實獲得的突變體確實含有目的突變。
降低谷胱甘肽合成酶活性的突變可以是，例如，用終止密碼子取代SEQ IDNO2所示氨基酸序列第370位的精氨酸。
其它降低谷胱甘肽合成酶活性的突變的例子包括如下(WO 03/046155)(1)用異亮氨酸取代SEQ ID2所示氨基酸序列第47位的蘇氨酸。
(2)用天冬氨酸取代SEQ ID2所示氨基酸序列第387位的甘氨酸。
(3)用亮氨酸取代SEQ ID2所示氨基酸序列第54位的脯氨酸。
上述(1)或(2)的突變可以單獨或者組合使用，但是(1)和(3)突變組合以及(2)和(3)突變組合是優選的。
上述對谷胱甘肽合成酶基因突變的介紹可以通過合成的寡核苷酸進行定點突變來完成。
上面提到的基因取代可以按照如下實施。即，用含有突變GSH2基因的重組DNA轉化酵母，以使得突變GSH2基因與染色體GSH2基因之間進行重組。此時，重組DNA中插入的標記基因使操作變得簡單易行，該標記依賴于諸如宿主的營養缺陷型等特定性狀。此外，例如通過限制性內切酶酶切使上述重組DNA線性化，以及從重組DNA上去除在酵母中起作用的復制調控序列都可以有效地制備出重組DNA整合到染色體上的菌株。
為進行酵母轉化，那些傳統使用的酵母轉化方法，例如原生質體法、KU法、KUR法、電擊轉化法或類似方法可以被應用。用上述方法已經將重組DNA整合進入染色體的菌株經歷了突變GSH2基因和本身存在于染色體上的GSH2基因之間的重組，因此這兩個融合基因，即野生型的GSH2基因和突變GSH2基因，被插入染色體使得重組DNA的其余部分(載體部分和標記基因)存在于兩個融合基因之間。
接下來，為使得只有突變GSH2基因留在基因組DNA上，GSH2基因的一個拷貝和載體部分(也包括標記基因)通過兩個GSH2基因間的重組從染色體DNA上被去除。此時，有兩種情況。一種情況是，野生型GSH2基因被留在染色體DNA 上而突變GSH2基因被切除。相反另一種情況是，突變GSH2基因被留在染色體DNA上而野生型GSH2基因被切除。這兩種情況中標記基因都被去除了，因此第二次重組的發生可以通過與標記基因相應的表型來證實。目標基因取代菌株可以通過用PCR方法擴增GSH2基因和檢查其結構進行選擇。
在基因取代中使用的突變GSH2基因可以編碼全長谷胱甘肽合成酶，但也可以是編碼部分酶的基因片段，只要這部分酶含有突變位點。
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)谷胱甘肽合成酶基因(GSH2)的核酸序列已經被報道(Inoue et al.，Biochim.Biophys.Acta，1395(1998)，315-320，GenBank Accession NO.Y13804，SEQ ID NO1)，而且該基因可以用PCR法，根據核苷酸序列制備的寡核苷酸為引物，從釀酒酵母染色體DNA獲得。基因取代中使用的基因也可以來自一個不屬于釀酒酵母屬的微生物。
本發明所用的突變GSH2基因可以是一個編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的谷胱甘肽合成酶基因，它在上述第47、387和54位點之外的一個或幾個位點具有一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入或增加。盡管數字“幾個”可以根據蛋白質的三維結構和氨基酸類型的不同而變化，但它通常是指2至10個，優選為2至6個，更優選為2至3個。或者，突變GSH2基因可以是編碼與SEQ IDNO2所示整個氨基酸序列具有至少30～40％，優選不少于55～65％同源性的蛋白質的DNA。
導致谷胱甘肽合成酶基因中取代、缺失、插入、增加、倒位的突變也包括基于帶有谷胱甘肽合成酶基因的細菌個體差異或種間、屬間差異而自然發生的突變或變化。
在破壞酵母菌株谷胱甘肽合成酶基因時，不僅可以使用全長谷胱甘肽合成酶基因，而且還可以使用具有足夠長的可以導致基因破壞的基因片段。基因破壞中使用的谷胱甘肽合成酶基因并沒有特別的限定，只要它具有足夠的同源性可以與酵母菌株染色體谷胱甘肽合成酶基因發生同源重組。基因可以從待用酵母菌之外的微生物制備獲得。
能夠與釀酒酵母GSH2基因發生同源重組的DNA的例子包括，與具有SEQID NO1所示核苷酸序列的DNA具有70％或更高，優選為80％或更高，更優選為90％或更高的同源性的DNA。這樣的DNA包括在嚴謹條件下可以與具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA雜交的DNA。舉例說明嚴謹條件，可以是50℃下鹽濃度為1×SSC和0.1％SDS，優選0.1×SSC和0.1％SDS的洗滌條件。
谷胱甘肽合成酶活性被降低或去除的酵母可以通過對野生型酵母進行一般的突變處理而獲得，例如紫外線照射或誘變劑，如N-甲基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝酸或吖啶。
舉例說明提高酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的方法，可以是利用帶有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的質粒轉化酵母來增加酵母細胞中該基因拷貝數量的方法，或者用強啟動子取代其天然啟動子來增強染色體γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的轉錄的方法(Yasuyuki Otake et al.，Bioscience andIndustry，第50卷，第10期，第989～994頁，1992年)。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的示范性例子為來自釀酒酵母(GenBank Accession NO.D90220)的基因。
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶的細胞內活性可以用Jackson的方法(Jackson，R.C.，Biochem.J.，111，309(1969))和Gushima等的方法(Gsushima，Tet al.，J.Appl.Biochem，5，210(1983))進行檢測。
本發明的酵母具有γ-谷氨酰半胱氨酸的生產能力并且為泛酸缺陷型。本發明中，“泛酸缺陷型”是指酵母生長所需的泛酸濃度高于未經修飾的酵母菌株例如野生型菌株生長所需的泛酸濃度。
泛酸缺陷型突變體可以按下述獲得將酵母進行突變處理，在含有泛酸的培養基和不含泛酸的培養基上復制處理過的酵母，選擇出在不含泛酸的培養基中不能形成菌落而在含泛酸的培養基中能夠形成菌落的菌株。該菌株即為泛酸缺陷型，可以在不含泛酸但含抗生素(例如特別影響細胞增殖的制霉菌素)的培養基中培養經過突變處理的酵母，以此來濃縮該菌株。不含泛酸的培養基示范性例子為具有下述成分的培養基。
表1成分 濃度葡萄糖3g/dlKH2PO40.15g/dlMgSO4·7H2O0.17g/dlCaCl2·2H2O0.03g/dl尿素 0.4g/dl生物素1.5ppm肌醇 100ppmV.B6 0.05ppmZn離子0.3ppmFe離子0.3ppmCu離子0.05ppm含有泛酸的培養基可以通過例如向上述培養基中添加0.1至10mg/L，優選0.4mg/L泛酸鹽而制得。添加的泛酸鹽可以是泛酸鈣。如果是固體培養基，培養基中可以含有適量的瓊脂。
具有上述特征的本發明酵母可以在含有足量泛酸的培養基中增殖，然后，在含有有限量泛酸的培養基中培養酵母，這樣，單位干細胞中的γ-谷氨酰半胱氨酸的含量會隨時程而增加。“足量的泛酸”是指在該量下，對數生長期的酵母可以增殖。該量一般是0.1mg/L或更高，優選為0.4mg/L或更高。雖然該量的上限沒有特殊限定，但是一般來說10mg/L或更多的量是過量的。因此，泛酸的量一般為0.1到10mg/L。
“有限量的泛酸”是指這樣的量在該量下，在含有足量泛酸的培養基中培養過的處于對數生長期的酵母不能生長或以降低的速率生長。有限量一般是0.1mg/L或更少，優選0.01mg/L或更少。有限量的泛酸可以是0mg/L。
“單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量隨時程增加”是指，當本發明的酵母在含有足量泛酸的培養基中培養后再轉入含有有限量泛酸的培養基中培養時，γ-谷氨酰半胱氨酸的最高含量比在培養基改變后單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量，優選至少增加1.5倍，更優選至少增加1.8倍，特別優選增加至少2倍。
本發明的酵母可被修飾以使得MET25基因的表達被去抑制。“MET25基因的表達被去抑制”是指，MET25基因的表達沒有在DOMINIQUE等的報告中所述的條件下被甲硫氨酸抑制(MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，Dec，1995，p6526-6534)。
舉例說明去抑制MET25基因表達的方法，可以是這樣的方法用編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白的突變MET30基因來轉化酵母，所述氨基酸序列第569位的絲氨酸被除絲氨酸以外的氨基酸取代。“除絲氨酸以外的氨基酸”可以是苯丙氨酸。具有上述特性的酵母可以按下文實施例所述的酵母突變處理來獲得。由于目的突變已經在上面詳細說明，因此，具有這種突變的酵母可以通過基因工程技術很容易地獲得。例如，MET25基因表達被去抑制的酵母，可以用上述的突變MET30基因通過基因置換來獲得。基因置換可以通過與上述GSH2基因同樣的方式完成。錨定突變MET30基因的酵母還可以通過用包含突變MET30基因的質粒轉化酵母以增加突變基因的拷貝數而獲得。此外，含有突變MET30基因的酵母還可以通過對野生型酵母進行如實施例所述的常規突變處理而獲得，如UV照射或誘變劑，如N-甲基-N-亞硝基胍(NTG)，甲基磺酸乙酯(EMS)，亞硝酸，或吖啶。可以通過PCR證實，所獲得的突變株含有目的突變。可以利用含有編碼具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列蛋白的突變MET30基因的菌株，來生產谷胱甘肽，所述氨基酸序列中第569位絲氨酸被苯丙氨酸取代。
MET30基因是一種能與MET4基因產物和其它幾種蛋白形成SCFMET30復合體的基因，并且其編碼的蛋白質涉及MET25基因表達的調控。示范性地例舉MET30基因，可以是來自啤酒酵母的、具有SEQ ID NO3核苷酸序列的MET30基因，或其同源物。同源物可以是在嚴格條件下能與具有SEQ ID NO3核苷酸序列的DNA雜交的DNA。這里所用的“嚴格條件”是指，在該條件下，能夠發生所謂的特異性雜交，而不發生非特異性雜交。但很難根據數字定義該條件，該條件的一個例子是這樣的條件允許有較高同源性的DNA雜交，例如，有50％或更高的同源性，但不允許同源性低于50％的DNA雜交，或這樣的條件在該條件下，以及在與Southern雜交的一般洗脫條件相應的鹽濃度下(即60℃，1×SSC，和0.1％SDS，優選0.1×SSC和0.1％SDS)，DNA能彼此雜交。
“第569位的絲氨酸”是指，在SEQ ID NO4的氨基酸序列中位于第569位的絲氨酸殘基。一個氨基酸殘基在氨基酸序列中的位置，可以通過在該殘基的上游區域進行插入，缺失，或類似的方法而被改變。如果是處于上述的氨基酸序列絕對位置被改變的情況下，本發明中的“第569位的絲氨酸”可以是一個與SEQ ID NO4氨基酸序列中位于第569位的絲氨酸殘基相應的氨基酸殘基。
本發明中所用的突變MET30基因可以是一種保守變異體，其編碼的蛋白質與具有SEQ ID NO4氨基酸序列的蛋白功能相同，也就是說，突變的MET30編碼一種具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的蛋白，該蛋白在除第569位之外的一個或幾個位點具有一個或幾個氨基酸的取代，缺失，插入，或增加。雖然“幾個”氨基酸的數目可以根據其在蛋白質的三維結構中的位置或氨基酸的類型而有所不同，但一般是2到10個，優選2到6個，更優選2到3個。或者，突變的MET25基因可以是一種DNA，其編碼與SEQ ID NO4的整個氨基酸序列具有不少于30％到40％同源性，優選不少于55％到65％的同源性的蛋白。
導致MET30蛋白質的氨基酸序列中取代、缺失、插入、增加、倒位的突變也包括基于含有MET30基因的細菌的個體差異或種間、屬間差異而自然發生的突變或變化。
本發明的酵母沒有特殊的限定，只要其能夠生產γ-谷氨酰半胱氨酸，可包括例如釀酒酵母屬(Saccharomyces)的酵母如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，假絲酵母屬(Candida)的酵母如產朊假絲酵母(Candida utilis)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)的酵母如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。本發明的酵母株可以是單倍體，但由于多倍體菌株的生長更強，因此優選二倍體或更多倍的多倍體。
具有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力的菌株可以通過對多倍體菌株進行突變處理并篩選出具有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力的菌株來獲得，也可以這樣獲得將用于培養產γ-谷氨酰半胱氨酸單倍體菌株的單倍體菌株，與野生型單倍體菌株交配，使獲得的單倍體菌株產生孢子，篩選顯示出降低的谷胱甘肽合成酶活性以及具有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力的菌株，并使得到的不同交配型的產γ-谷氨酰半胱氨酸的兩個單倍體菌株交配。用類似的方法，也可以獲得三倍體或更多倍的有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力的菌株。
上述的培養和修飾酵母的方法，描述于Hirokawa Shoten出版的“Chemistryand Life，Experimental Line 31，Yeast Experimental Technology”第一版，Yohdosha出版的“Bio Manual Series 10，Gene Experimental Method using Yeast”第一版，Cold Spring Harbor Laboratory Press出版的“Methods in Yeast Genetics 2000版”等文獻。
<2>本發明酵母的應用可以通過在含有足量泛酸的培養基中培養本發明的酵母使其增殖，然后通過在含有有限量泛酸的培養基中培養，使細胞內的γ-谷氨酰半胱氨酸含量增加，從而獲得細胞內積累了γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母。
優選地，可以通過試驗預先測定要獲得指定量的酵母細胞所需要的泛酸的量，然后計算要獲得目標量的酵母細胞所需要的泛酸的量，來決定泛酸的“足夠量”。
在培養酵母使其增殖的步驟中，可以在培養開始前加入全部量的泛酸，或分成幾部分在培養的過程中分批加入。培養基和培養條件沒有特別的限制，只要它們能控制泛酸的量即可，一般用于生產酵母提取物等的培養基和培養條件都可采用。
在本發明的一個優選具體實施方式
中，可以采用工業使用的常規培養基，因為谷胱甘肽合成酶活性降低的酵母能在不含谷胱甘肽的培養基中較好地生長。可以根據待用酵母的特性任選地加入必要的營養物質。
在增殖酵母獲得足夠量的酵母細胞后，將酵母細胞培養在含有有限量泛酸的培養基中。例如，將酵母培養在含有足量泛酸的培養基中，然后，將獲得的培養物或酵母細胞轉到含有有限量泛酸或不含泛酸的培養基中培養。或者也可以不改變培養基，而是通過停止加入另一部分的泛酸來限制泛酸的量。優選當酵母處于對數生長期時限制泛酸的量。在使用面包酵母時，例如將培養對數生長期或穩定期的酵母所獲得的培養物接種到濃度為2％的營養培養基中，在30℃振蕩培養8到16小時，就可以獲得對數生長期的酵母細胞。
在含有有限量泛酸的培養基中培養酵母的步驟中，酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的積累量隨時間而增加。優選地，當γ-谷氨酰半胱氨酸的累積量達到目標量時，停止培養。一般來說，在優選條件下，培養時間是10到30小時，優選15到27小時。
獲得的培養物或其分級產物中含有γ-谷氨酰半胱氨酸。培養物可以是含有酵母細胞的培養基，或從培養基中收集的酵母細胞，細胞勻漿，或細胞提取物(酵母提取物)。含有γ-谷氨酰半胱氨酸的分級產物也可以從細胞勻漿或酵母提取物中獲得。
可以通過加熱上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養物或其分級產物的方式，使半胱氨酸從γ-谷氨酰半胱氨酸上離解下來。
可以用制備酵母提取物的常規方法，制備酵母提取物等。可以通過用熱水提取處理酵母細胞，或消化來處理酵母細胞，從而獲得酵母提取物。
上述含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的培養物或其分級產物，可用于生產食品和飲料。食品和飲料包括酒精飲料，面包食品，和發酵的食用調味物質。通過加熱處理γ-谷氨酰半胱氨酸來生產半胱氨酸，可以在生產食品和飲料的過程中或之后進行該生產。
上述的食品和飲料，是通過將所述的培養物或其分級產物與食品和飲料的原材料混合，并把得到的混合物加工為食品和飲料而得到的。本發明的食品和飲料可以通過與一般食品和飲料相同的原材料生產得到，只是本發明還使用了上述的培養物或其分級產物。這些原材料包括，例如，大米，大麥，玉米淀粉等，用于生產酒精飲料；小麥粉，糖，精制食鹽，黃油，發酵酵母等，用于生產面包食品；大豆，小麥等，用于生產發酵的食用調味物質。
實施例在下文中，將通過實施例對本發明進行詳細的描述。
實施例1<1>培養谷胱甘肽合成酶的活性被降低的酵母根據常規方法，使食品工業所用的市售單倍體啤酒酵母產生孢子。使用隨機孢子方法，從孢子中獲得一個單倍體酵母，YN0001菌株(MATα)。用EMS對YN0001菌株進行突變處理，從突變體中篩選得到突變的YN0002菌株(MATα)，該菌株具有降低的谷胱甘肽含量。四分孢子分析證實YN0002菌株的GSH2基因發生了突變。具體而言，GSH2基因編碼蛋白質的第387位甘氨酸被天冬氨酸取代。另外，還獲得了谷胱甘肽含量有所降低的突變YN0003菌株。
突變處理在死亡率為90％的條件下進行。將YN0001菌株在50ml YPD培養基中于30℃振蕩培養1天。收集酵母細胞，并用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)清洗3次。將酵母細胞懸浮于含有9.2ml 0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，0.5ml 40％D-葡萄糖，和0.3ml EMS的溶液中(Nacalai Tesque，Inc.，Code 155-19)，并于30℃振蕩培養90min。向懸浮物中加入10ml 10％硫代硫酸鈉(已過濾滅菌)，并于室溫放置10min以中和誘變劑。收集酵母細胞并用0.2M磷酸鈉緩沖液(pH7.5)清洗。
將YN0001菌株和YN0002菌株分別接種到YPD培養基中，30℃振蕩培養。獲得的培養物以2％的濃度接種到SD培養基中，30℃振蕩培養。測定處于對數生長期的酵母細胞中谷胱甘肽的含量。結果表明，YN0001菌株中谷胱甘肽的含量是0.52％，而YN0002菌株中谷胱甘肽的含量是0.006％或更少。
<2>培養MET30基因突變的突變菌株通過與上述同樣的方法，用EMS對前述的單倍體YN0001菌株(MATα)進行突變處理，從突變體中獲得突變的AJ14819菌株(MATα)，該菌株中MET25基因的表達沒有被甲硫氨酸抑制。該菌株被命名為AJ14819，并于2002年9月11日保藏在國家高級工業科學和技術研究中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，國際專利微生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)(Central-6，1-1，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，保藏號為FERM P-19007。然后，于2003年10月1日在布達佩斯條約的規定下轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-08502。
可以通過檢測菌株在含有硒的培養基中的生長能力來測定MET25基因的表達是否被甲硫氨酸抑制，(DOMINIQUE et al.，MOLECULAR ANDCELLUAR BIOLOGY，Dec.1995，p.6526-6534)。具體地，可以用下述方法來篩選突變體。也就是，把已經進行過突變處理的酵母涂布在YPD瓊脂培養基上，涂布的濃度為在瓊脂培養基上能夠得到大約100個酵母細胞。通過復制法，將YPD培養基上出現的酵母菌株接種到含硒和不含硒的培養基中(前面提及的如DOMINIQUE等所述的瓊脂培養基)。篩選出不能在含硒的培養基中生長，但是能在不含硒的培養基中生長的酵母菌株。
可以用下面的方法來檢測篩選到的菌株中MET25基因的表達是否增加。將篩選到的酵母菌株和YN0001菌株分別培養在SD培養基中，并收集對數生長期的酵母細胞。然后，分離細胞中的RNA，并使用ACT1基因作為內部標準，測定分離RNA中MET25基因的轉錄產物的量。使用定量PCR儀(PCR5700，Applied Biosystem)和TaqMan One-Step RT-PCR試劑盒(AppliedBiosystem)進行定量檢測。ACT1-986T(SEQ ID NO5)和MET25-1077T(SEQ IDNO6)用作TaqMan探針(Applied Biosystem)。引物ACT1-963F(SEQ ID NO7)和引物ACT1-1039R(SEQ ID NO8)用來擴增ACT1基因，引物MET251056F(SEQ ID NO9)和引物MET25-1134R(SEQ ID NO10)用來擴增MET25基因(Applied Biosystem)。結果表明，與YN0001菌株相比，獲得的酵母AJ14819菌株中MET25基因的表達增加了兩倍或更多。
用四分孢子分析詳細說明獲得的AJ14819菌株中突變的基因，并測定該基因的序列。結果發現，MET30基因編碼的蛋白中第569位的絲氨酸被苯丙氨酸取代。根據上述方法，獲得了MET25基因的表達不被甲硫氨酸抑制的酵母AJ14819菌株。
<3>培養泛酸鈣缺陷型酵母通過與上述同樣的方法用EMS對前述的單倍體酵母YN0001菌株(MATα)進行突變處理。為了從突變菌株中獲得泛酸鈣缺陷型的酵母，將菌株在不含泛酸鈣并添加制霉菌素(10μg/ml)的培養基中30℃培養2小時，然后把培養過的培養基涂布在YPD瓊脂培養基上。用復制法將產生的突變菌株接種到不含泛酸鈣的瓊脂培養基和含有泛酸鈣的瓊脂培養基中(每種瓊脂培養基的組分見表1)。然后，篩選出不能在前面的瓊脂培養基但是能在后面的瓊脂培養基中生長的酵母。根據這些方法，獲得了泛酸鈣營養缺陷型的酵母Pa0001菌株(MATa)。
<4>培養泛酸鈣缺陷型并且GSH2基因和MET30基因都發生突變的酵母(GMP菌株；二倍體gsh2 met30pa-)根據常規方法，使AJ14819菌株和Pa0001菌株交配獲得二倍體。使得到的二倍體產生孢子，通過隨機孢子分析，得到了含有突變的MET30基因并且為泛酸鈣缺陷型的單倍體酵母MP菌株。隨后，使MP菌株和YN0002菌株交配獲得二倍體菌株。使得到的二倍體產生孢子，通過隨機孢子分析，獲得了單倍體酵母GMP-1菌株(MATα)和GMP-2菌株(MAT a)，其中每個菌株都含有突變的GSH2基因和突變的MET30基因并且表現泛酸鈣缺陷型。使GMP-1菌株和GMP-2菌株交配獲得二倍體酵母GMP菌株。
<5>用GMP菌株生產γ-谷氨酰半胱氨酸將GMP菌株接種到YPD培養基中(試管中裝4ml培養基)，30℃振蕩培養1天。將獲得的培養物接種到含有0.4mg/dl泛酸鈣的培養基中，30℃振蕩培養。在其對數生長期，將含有酵母細胞的培養基分成等份，并將等分試樣以60mg(干酵母重量)/dl(培養基)的濃度，分別加到不含泛酸鈣的培養基以及含有0.4mg/L泛酸鈣的培養基中進行培養。隨時程測定單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量。結果如圖1所示。當菌株培養在不含泛酸鈣的培養基中時，其體內γ-谷氨酰半胱氨酸含量隨時程的增加量高于在含有高濃度泛酸鈣的培養基中培養的菌株。
上述結果表明，GMP菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量隨著泛酸鈣的缺乏而增加。
對比實施例1.培養含有突變GSH2基因和突變MET30基因的酵母根據常規方法，將前述的含有突變MET30基因的AJ14819菌株，與從市售酵母中獲得的單倍體Pa0001菌株交配獲得二倍體。使得到的二倍體產生孢子，并通過隨機孢子分析，獲得含有突變的MET30基因的單倍體酵母M菌株(MAT a)。隨后將M菌株和前述的YN0002菌株交配，得到二倍體。使二倍體形成孢子，通過隨機孢子分析獲得單倍體GM-1菌株(MAT a)和GM-2菌株(MAT a)，其中每個菌株都含有突變的GSH2基因或突變的MET30基因。GM-1菌株和GM-2菌株交配得到二倍體酵母GM菌株。
實施例2.用GMP菌株和GM菌株生產γ-谷氨酰半胱氨酸將GM菌株和GMP菌株分別接種到YPD培養基中，30℃振蕩培養。將獲得的培養物接種到含有0.4mg/dl泛酸鈣的培養基中，30℃振蕩培養。收集對數期的細胞，并以60mg(干酵母重量)/dl(培養基)接種到不含泛酸鈣的培養基中，30℃振蕩培養。隨時程測定單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量。結果如圖2所示。
結果顯示，當在缺乏泛酸鈣的條件下培養GMP菌株時，其單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量隨時程而增加。
實施例3.培養泛酸鈣營養缺陷型酵母(AJ14861菌株)，其中MET30基因突變而且GSH2 基因被破壞<1>制備用于破壞谷胱甘肽合成酶基因的表達盒以GSH2-AUR1-C-F(SEQ ID NO11)和GSH2-AUR1-C-R(SEQ ID NO12)為引物，用KpnI消化的pAUR123載體(Takara Shuzo code No.3602)為模板，進行PCR，反應條件如下用KpnI消化的pAUR123載體 1μl10×PCR緩沖液(不含MgCl2) 5μldNTP4μl10pmol/μl GSH2-AUR1-C-F引物1μl10pmol/μl GSH2-AUR1-C-R引物1μlKOD Dash DNA聚合酶(Takara Shuzo code LDP-101)0.5μl純水37.5μl總計50μlPCR反應的一個循環為94℃40sec，54℃ 40see，74℃ 1min，重復30個循環。
獲得的PCR產物含有GSH2基因開放式閱讀框的N-末端區域和C-末端區域，該GSH2基因中插入了AUR1-C基因，因此它可用于破壞GSH2基因。
<2>培養谷胱甘肽合成酶基因破壞的酵母用上述制備的表達盒，按下述方法破壞GMP菌株中的GSH2基因。也就是說，在YPD培養基中培養GMP菌株，并在對數生長期收集細胞。收集的細胞用1M山梨糖醇溶液洗2次，并懸浮于溶液中5℃放置1小時，所述溶液的成分為0.1M LiCl，10mM DTT，10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA。然后，所得的細胞用1M山梨糖醇溶液洗2次。把制備到的細胞和上述的PCR產物混合，根據“BioManual Series 10，Experimental Techniques on Yeasts”第一版，Youdosha中所述的方法，對得到的混合物進行電穿孔。將電穿孔后的細胞接種到YPD培養基中，于30℃培養16小時。然后，將獲得的培養物涂布到含有0.2μg/ml aureobandin A(Takara Shuzo code 9000)作為選擇標記的YPD瓊脂平板上，30℃培養3天。注意抑制GMP菌株生長的aureobandin A的最小濃度為0.05μg/ml。將出現的菌落涂布到含有0.2μg/ml aureobandin A的YPD瓊脂平板上，篩選出具有aureobandin A抗性的菌落。該菌株被命名為AJ14861，并根據布達佩斯條約規定，于2003年11月19日保藏在國家高級工業科學和技術研究中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology)，國際專利微生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary)(Central-6，1-1，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，作為國際保藏，保藏號為FERM BP-08553。
<3>用AJ14861菌株生產γ-谷氨酰半胱氨酸將AJ14861菌株接種到YPD培養基中(試管中裝4ml培養基)，30℃振蕩培養1天。將獲得的培養物接種到含有0.4mg/dl泛酸鈣的培養基中，30℃振蕩培養。在其對數生長期，將含有酵母細胞的培養基分成等份，并將等分試樣以60mg(干酵母重量)/dl(培養基)的濃度，分別加到不含泛酸鈣的培養基或含0.4mg/L泛酸鈣的培養基(表1)中進行培養。隨時程測定單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸含量。結果如圖3所示。當菌株培養在不含泛酸鈣的培養基中時，其γ-谷氨酰半胱氨酸含量隨時程而增加的量，要高于在含有高濃度泛酸鈣的培養基中培養的菌株。
上述結果表明，AJ14861菌株中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量隨著泛酸鈣的缺乏而增加。
工業實用性本發明提供了一種泛酸缺陷型酵母，其中谷胱甘肽合成酶的活性被降低或消除，并且MET25基因的表達被去抑制。在優化條件下培養本發明的酵母，可以得到含有高濃度γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母培養物的培養基。本發明的酵母和酵母培養物的培養基，可用于生產含有γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸的食品和飲料。
序列表<110>味之素公司<120>生產γ-谷氨酰半胱氨酸的方法<130>
<150>JP 2002/361918<151>2002-12-13<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2466<212>DNA<213>釀酒酵母<220>
<221>CDS<222>(1)..(1476)<223>
<400>1atg gca cac tat cca cct tcc aag gat caa ttg aat gaa ttg atc cag48Met Ala His Tyr Pro Pro Ser Lys Asp Gln Leu Asn Glu Leu Ile Gln1 5 10 15gaa gtt aac caa tgg gct atc act aat gga tta tcc atg tat cct cct96Glu Val Asn Gln Trp Ala Ile Thr Asn Gly Leu Ser Met Tyr Pro Pro20 25 30aaa ttc gag gag aac cca tca aat gca tcg gtg tca cca gta act atc144Lys Phe Glu Glu Asn Pro Ser Asn Ala Ser Val Ser Pro Val Thr Ile35 40 45tat cca acc cca att cct agg aaa tgt ttt gat gag gcc gtt caa ata192Tyr Pro Thr Pro Ile Pro Arg Lys Cys Phe Asp Glu Ala Val Gln Ile50 55 60caa ccg gta ttc aat gaa tta tac gcc cgt att acc caa gat atg gcc240
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<221>CDS<222>(1)..(1920)<223>
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權利要求
1.一中具有γ-谷氨酰半胱氨酸生產能力并且為泛酸缺陷型的酵母，其中，當在含有有限量泛酸的培養基中培養酵母時，單位干酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量隨時程而增加。
2.根據權利要求1的酵母，其被修飾以使得細胞內谷胱甘肽合成酶活性被降低或消除。
3.根據權利要求1或2的酵母，其被修飾以使得MET25基因的表達被去抑制。
4.根據權利要求3的酵母，其中MET25基因的表達通過錨定突變MET30基因而去抑制，所述MET30基因具有一個突變，所述突變為在MET30基因編碼蛋白第569位的絲氨酸被除絲氨酸以外的氨基酸取代。
5.根據權利要求4的酵母，其中除絲氨酸以外的氨基酸是苯丙氨酸。
6.根據權利要求1到5任一項的酵母，其屬于釀酒酵母屬。
7.一種生產能夠積累γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母的方法，包括在含有足量泛酸的培養基中培養權利要求1到6任一項的酵母，以使其增殖的步驟，和在含有有限量泛酸的培養基中培養該酵母，使酵母細胞中γ-谷氨酰半胱氨酸的含量增加的步驟。
8.一種食品或飲料，其中含有在合適條件下培養權利要求1到6任一項的酵母所得到的培養物，含有γ-谷氨酰半胱氨酸的培養物的分級產物，或通過熱處理產生了半胱氨酸的培養物或其分級產物。
9.根據權利要求8的食品或飲料，其選自酒精飲料，面包食品和發酵的食用調味物質。
10.一種酵母提取物，其是使用在合適條件下培養權利要求1到6任一項的酵母所獲得的培養物而生產的。
11.一種生產含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食品或飲料的方法，包括在合適的條件下培養權利要求1到6任一項的酵母，將獲得的培養物或其分級產物，或進行過熱處理的培養物或其分級產物，與食品或飲料的原材料混合，并將混合物加工為食品或飲料。
12.一種酵母，其中MET25基因的表達通過錨定突變MET30基因而去抑制，所述MET30基因具有一個突變，所述突變為MET30基因編碼蛋白的第569位絲氨酸被苯丙氨酸取代。
全文摘要
一種具有γ－谷氨酰半胱氨酸生產能力并且為泛酸缺陷型的酵母，其是在含有足夠量的泛酸的培養基中增殖，然后在含有有限量的泛酸的培養基中培養，以增加細胞中γ－谷氨酰半胱氨酸的含量，從而獲得了體內累積有γ－谷氨酰半胱氨酸的酵母。
文檔編號A23L2/52GK1510127SQ20031012468
公開日2004年7月7日 申請日期2003年12月12日 優先權日2002年12月13日
發明者末廣真理子, 西內博章, 西村康史, 史, 章 申請人:味之素株式會社