動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法及其培養基的制作方法

專利名稱：動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法及其培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法及其培養基，更具體地說是利用多孔微載體將動物細胞固定化，在生物反應器中無血清高密度培養動物細胞，高效表達基因工程產品或其他生物制品的方法以及所使用的培養基，屬于細胞工程領域和生物制藥領域。
背景技術：
以基因工程和細胞融合技術為標志的現代生物技術在醫藥工業中形成了一支新的高科技產業——現代生物技術制藥工業。據統計，2001年全球現代生物技術藥品的銷售額超過300億美元，并且每年以15％-20％的速度增長，而常規藥物的增長率為5％-8％。動物細胞大規模培養技術是生物制藥產業中的最關鍵的一個技術平臺，目前一半以上獲得批準用于臨床治療的生物制品均通過細胞培養技術來生產，而且，隨著大分子功能蛋白和人源(化)抗體的開發，基因治療和細胞治療的進步，以及組織工程和人造生物器官產品的研發，細胞培養技術將在生物制藥產業化領域中發揮更大的作用。
用動物細胞大規模培養技術生產的生物制品包括所有治療性單克隆抗體、病毒疫苗、干擾素、t-PA、EPO、凝血因子、G-CSF、融合蛋白(如Enbrel)、組織工程產品及其他生物制品。美國FDA批準的很大部分生物制品均是由動物細胞表達生產的。目前主要有細菌(E.coli)、酵母、哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞，即CHO細胞)三種表達系統表達重組蛋白。細菌等原核表達系統繁殖快、易于培養，但表達的蛋白質缺乏轉錄后的修飾，如缺乏蛋白質限制性酶切位點、二硫鍵、特殊的糖基化、磷酸化、酰胺化作用以及形成天然蛋白質精確的三維結構的環境等。而許多蛋白的生物活性與轉錄后的修飾有關，并且原核系統表達的蛋白一般為胞內產物，需要破碎細胞才能提取產物，給產物的分離純化帶來困難，同時還容易受到外源毒素的污染。而真核表達系統如CHO細胞表達的蛋白具有轉錄后的修飾作用，與人體自身分泌的天然蛋白無論在結構和功能上都非常近似，因而美國FDA傾向在21世紀采用真核表達系統生產蛋白質藥物。幾乎所有用原核細胞表達的蛋白均可采用真核表達系統生產，反之則不盡然，用動物細胞表達系統表達的蛋白都是胞外分泌的，產物的分離純化過程非常簡單，但是，由于細胞大規模培養技術比較復雜，目前仍處于發展完善階段，因而許多重組蛋白仍選用原核表達系統生產。2001年全球銷售額位列前20位的生物制品，用CHO動物細胞表達的占11種，銷售額占總數的65％。由此可見動物細胞表達產品的大規模高效培養技術在生物制藥領域中的重要性。
技術的發展要求用動物細胞真核表達系統生產的生物制品的比重越來越大。原核表達系統一般用于小分子、結構簡單的蛋白生產，蛋白轉錄后無需修飾，如胰島素。而真核表達系統主要用于生產大分子、結構復雜的蛋白，并且轉錄后的修飾對蛋白的生物活性具有重要影響，如組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、促紅細胞生成素等(EPO)。生物制品的一個發展趨勢是開發分子量較大的功能蛋白和人源抗體、基因治療產品、治療用疫苗以及組織工程產品，這些產品一般都是通過動物細胞大規模培養技術來生產的。尤其是治療用抗體藥物的開發是最近5年生物制品研發的重要領域。目前幾乎所有的嵌合抗體和人源化抗體都是用CHO細胞表達的，而且檢測用鼠源單克隆抗體的生產也可經培養雜交瘤細胞獲得。因此，隨著生物制藥產業的發展，通過動物細胞大規模培養技術生產的生物制品比重將越來越大。
動物細胞表達產品生產能力不能滿足市場需求。動物細胞培養技術復雜，至今還沒有一種公認的比較標準的高效培養技術。由于各制藥公司技術保密的需要，在公開發表的論文中很難看到真正應用于生產的工藝和技術。一般來講，幾乎所有的制藥公司都采用與細菌發酵相似的批式培養工藝，這種培養工藝技術難度相對較低，但反應器的生產能力也很低，大大限制了動物細胞表達產品的生產和供應。劑量在幾百毫克～幾克/人/年的藥物如Enbrel，生產商已經應用6個12,500L的生物反應器生產，年產量低于10公斤，可見其反應器的生產效率并不高。據Bains&Company預計，今后十年，用哺乳動物細胞生產的生物制品遠不能滿足市場的需求。
為了提高反應器的生產效率，降低運行成本，理想的商業用工業化的動物細胞培養工藝應具有以下特點“大規模、高密度、長時間、高表達”。用較小規模的反應器高效率生產生物制品一直是動物細胞大規模培養技術研究的重點，自1980年代以來，動物細胞大規模培養技術成為生化工程領域最為重要的研究內容之一，但是由于存在以下難點，至今仍沒有一種成熟的細胞高效培養技術，這些難點包括(1)動物細胞非常脆弱，如何解決供氧與細胞損傷的矛盾。這是細胞高密度培養的主要限制因素。提高氧傳遞速率一般會增加混合強度，從而可能對細胞造成損傷。引起細胞機械損傷的因素主要包括機械碰撞、流體剪切、氣泡凝聚破裂等，解決的主要方法是添加保護劑如Pluronic F68、血清等；膜包埋培養如中空纖維膜反應器；采用多孔細胞支持物培養，如多孔微載體、燒結陶瓷等；改進反應器結構，使攪拌溫和，氣泡與細胞隔離，如籠式曝氣反應器、無泡通氣反應器，氣液雙升反應器等。
(2)如何解決傳質混合與過程放大的矛盾。這是實現動物細胞大規模培養的關鍵。反應器放大培養后應保證具有良好的傳質混合性能和溫和的細胞生長環境。許多類型反應器如固定床反應器和中空纖維膜反應器在小規模實驗中具有很好的細胞培養效果，但都難以用于商業化、大規模生產，主要原因是不能放大培養。目前能夠做到放大培養的一般是采用細胞懸浮培養技術。在過去一度認為多孔微載體培養難以逐級放大。
(3)如何解決細胞長期連續培養的細胞凋亡問題。這是保持細胞長期高密度培養的關鍵。細胞體外培養時，誘發細胞凋亡的主要原因是細胞生長的環境條件較惡劣，如營養缺乏，代謝產物的累積，pH和溶氧控制不當，機械攪拌剪切力較大等，尤其在無血清培養基中更易發生。細胞凋亡大大影響了細胞培養時間，從而嚴重降低反應器的生產能力和利用效率，增加了運行成本和勞動強度。正因如此，近幾年來對細胞培養中細胞凋亡的研究正成為細胞培養技術中的一個熱門課題。為解決這一問題，許多學者嘗試利用基因工程技術改造細胞株，將抑制細胞凋亡的基因bcl-2轉染到宿主細胞中，或在細胞培養基中加入昂貴的抑制細胞凋亡的因子，期望抑制或延緩細胞凋亡，延長單個細胞的壽命以延長培養時間，但目前效果并不明顯，存在效果不穩定，成本較昂貴，延長時間不長(延長2-3天)等不足，在大規模細胞培養中并未見有應用。
(4)如何解決細胞在高密度條件下，由于存在密度效應，單個細胞的表達水平下降問題。如何保持或提高細胞在高密度生長條件下的表達水平，關系到產物的濃度和產量以及培養基的利用率。細胞生命活動賴依存在的內部結構是自然界最復雜的非線性系統之一，簡單用傳統的化學反應工程原理來設計和運行生物反應器是遠不夠的，尤其是培養結構更為復雜的動物細胞(細胞表面具有與細胞通訊有關的受體，信息在細胞與環境之間、細胞與細胞之間以及細胞內部的傳遞直接影響細胞的生長、增殖、代謝及產物表達)。不少文獻嘗試利用溫度的變化、培養液滲透壓的變化及其他外部刺激，提高細胞的表達水平。
(5)無血清培養基的研究與開發。用含血清培養基生產生物制品有許多不利，如增加培養成本和污染機會，增加純化難度和成本，增加產品質控指標，因此，大規模生產臨床使用的生物制品應盡可能使用無血清培養基。
(6)細胞截留技術的研究。由于單個細胞表達產物的水平是一定的，提高細胞密度就能夠提高上清中產物濃度，從而提高反應器的生產能力。而要獲得較高的細胞培養密度，前提是要將細胞截留在反應器中。截留細胞的方法主要有三類(A)分離法，如在位離心、旋轉濾器、循環反應器、超聲波隔離等；(B)包埋法(封閉式)，如中空纖維膜反應器、微囊化、膜反應器；(C)裹夾法(開放式)，如多孔陶瓷、無紡布培養、海綿/泡沫基質、多孔微載體等。
(7)動物細胞批式培養與連續培養的選擇及細胞生長動力學模型的建立。選擇培養方式應根據細胞和產物的具體特點來確定。從培養效果講，連續培養細胞密度高，一般截留細胞的連續培養細胞密度均在107/ml，比批式培養高10倍左右，因而反應器生產能力也比批式培養高10倍以上，并且連續培養的勞動強度小，生產成本低，但是前提是整個連續培養系統，包括反應器控制系統、細胞截留系統等必須保證長時間運行正常可靠。但是絕大多數生物制藥公司都還采用批式培養模式，因為動物細胞批式懸浮培養運行比較簡單可靠，易實現過程放大，不涉及細胞凋亡和高密度培養表達水平下降的問題，懸浮細胞個體較小，受流體剪切力的影響相對較小，比較容易借鑒細菌發酵的技術。這也說明目前還沒有一種理想的連續培養技術可供制藥公司選擇。但是，動物細胞批式懸浮培養生產能力低，設備和廠房投資高，生產成本也比較高。以生產t-PA為例，動物細胞反應器的規模達到6×6000L，相應的純化設備也很龐大，即要求純化設備能夠一次性處理細胞培養上清幾萬升。用這種工藝生產1g基因工程蛋白的成本約10,000美元，而年產量只有10公斤級水平，并且批式培養方式不適合不穩定的蛋白質的生產，如尿激酶原的生產。動物細胞表達的產品如各種人源化抗體、Enbrel、t-PA等，劑量一般都在毫克級甚至克級(EPO除外)，因此，要滿足市場需求，采用批式培養動物細胞反應器的規模都很大，如生產Enbrel的反應器規模已達12,500L，但產量仍不能滿足市場需求。
用較小規模的反應器高效率生產生物制品一直是動物細胞大規模培養技術研究的重點，這一方向更符合我國國情，并且還沒有動物細胞大規模高密度長期連續培養的成熟技術的專利。

發明內容
本發明的目的是提供一種連續培養動物細胞的多孔微載體固定化高效培養方法。
本發明的另一個目的是提供一種成本低廉、質量可控、使用安全的無血清培養基。
為實現上述目的，本發明采用以下技術方案動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，包括如下步驟(1)纖維素多孔微載體預處理將纖維素多孔微載體用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)浸泡4h后，傾去PBS，再用PBS洗滌3次。121℃高壓滅菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培養基洗滌2次后置4℃備用；(2)細胞接種攪拌瓶中加人處理好的多孔微載體和含血清培養基，將細胞懸液按所需接種密度接種到攪拌瓶中培養，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉速20-100r/min；(3)細胞馴化將生長在多孔微載體上的細胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養，并將培養基中的血清含量逐漸降到0％，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉速20-100r/min，至細胞密度大于5×106細胞/mL，換液量一般為1/2-1個培養體積；(4)細胞培養將細胞懸液轉移至反應器中逐級放大培養，使用無泡通氣供氧系統，采用批式換液連續培養工藝，定期更新部分微載體，對細胞進行無血清培養。
所述纖維素多孔微載體是Cytopore-2。
所述(2)細胞接種步驟中多孔微載體的濃度為1-4g/L。
所述(2)細胞接種步驟中血清培養基的濃度為2％。
所述(2)細胞接種步驟中細胞懸液的接種密度為2×105-5×105細胞/mL。
所述(4)細胞培養步驟中的轉移是指使用管道將長滿細胞的多孔微載體直接導入下一級反應器中。
所述(4)細胞培養步驟中的反應器中預先加入適量培養基和經過處理的多孔微載體。
所述(4)細胞培養步驟采用批式換液連續培養是指每天通過細胞截留系統換液1-1.2個工作體積，將微載體和細胞截留在反應器中，收獲含產品的上清并加入等量新鮮培養基。
所述(4)細胞培養步驟的無血清培養是指依次使用無血清生長培養基和無血清表達培養基對反應器內的細胞進行培養。
所述動物細胞為貼壁細胞如CHO細胞或懸浮細胞如雜交瘤細胞。
用于動物細胞多孔微載體固定化高效培養的無血清培養基，該無血清培養基包括生長型無血清培養基和表達型無血清培養基，每10L培養基的成分及其含量分別見下表生長型無血清培養基成分及其含量(每10L培養基)

表達型無血清培養基成分及其含量(每10L培養基)

本發明采用多孔微載體固定化細胞培養技術，保護細胞免受機械損傷，并將貼壁細胞或懸浮細胞截留在反應器中，提高細胞培養密度；利用細胞在多孔微載體間自動轉移的規律，建立簡單可靠的細胞培養過程放大的技術方法；采用無泡通氣供氧系統，解決在細胞培養過程中直接通氣供氧帶來的泡沫泛濫及損傷細胞的問題；研制的無血清培養基，降低細胞培養成本、污染機會及后續產品純化成本和難度；采用批式換液連續培養工藝，及時去除培養過程中的廢物累積，降低批式培養過程中產物降解的比例，并提高反應器的生產能力；采用定期更新部分微載體的方法，使動物細胞在微載體之間相互轉移，改善細胞生長的微環境，解決細胞長期培養的細胞凋亡問題。
本發明的優點是采用生化工程技術，建立了一種簡單、可靠的大規模高密度動物細胞長期連續培養和高效表達的技術，采用該技術培養動物細胞(1)細胞培養密度高，一般培養密度＞2×107/ml；(2)可方便放大培養規模；(3)解決了培養中的細胞凋亡問題，培養時間長，一般可達100天左右，細胞活力保持在95％以上；(4)無血清培養基價格低廉，并能很好支持細胞生長和表達；(5)反應器的生產能力高，表達水平為5μg/106cells/d的工程細胞采用本發明中的技術培養，年生產能力可達到10g/L反應器/年，較目前的反應器生產能力提高100倍左右；(6)既可用于貼壁細胞如CHO細胞的培養，又可用于懸浮細胞如雜交瘤細胞的培養。
下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對本發明的限制。
具體實施例方式
實施例1、Cytopore-2纖維素多孔微載體培養動物細胞一、Cytopore-2纖維素多孔微載體的預處理Cytopore-2纖維素多孔微載體(Pharmacia Biotech AB，瑞典，CatNo.17-1271-02)是一種物化特性非常適合動物細胞大規模培養的細胞支持物，其主要物化特性見表1。
用前用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)浸泡4h后，傾去PBS，再用PBS洗滌3次。121℃高壓滅菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培養基洗滌2次后置4℃備用。
表1 Cytopore-2多孔微載體物化特性

Cytopore多孔微載體機械強度高，培養細胞后可回收重復使用。回收方法如下(1)將約300mL內部長有細胞的多孔微載體置于2000mL瓶中，加1000mL水，用力振蕩2分鐘后，用150目不銹鋼濾網濾除液體，以初步去除脫落的細胞及細胞碎片。(2)將微載體重新懸浮于0.2mol/L的檸檬酸溶液中，置于室溫6小時，并每隔1小時振蕩2分鐘，使多孔微載體內部中的大多數細胞裂解并脫落出來，用150目濾網濾除液體。(3)重復第一步，用水多次清洗多孔微載體，直至待微載體沉降后液體清亮透明為止。如果有必要，可再次用檸檬酸溶液浸泡洗滌。(4)用5％的碳酸氫鈉溶液浸泡洗滌一次，爾后用水洗滌三次。(5)顯微鏡下觀察，如果多孔微載體內部還有較多的死細胞，可用0.2％的粗胰酶溶液浸泡，于37℃孵育3小時并每隔半小時搖蕩2分鐘，之后用水清洗至液體清亮透明。(4)用去離子水洗滌三次，再用pH7.0～7.5的0.1M PBS緩沖液洗滌三次后，在121℃下高壓滅菌備用。(5)如有必要，加至含0.02mol/L-0.05mol/L DEAE鹽酸鹽、0.2mol/L NaOH的溶液中，置60℃下不斷攪拌10h，使其交聯-DEAE弱堿性陰離子交換基團，以促進細胞貼壁。交聯后用1％的檸檬酸溶液洗滌一次，再用蒸餾水洗滌三次，爾后用0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次，于121℃蒸汽滅菌30min后。(6)吸出PBS，用DMEM/F12培養基(美國Hyclone公司生產，CatNo.SH30004.04)洗滌2次，再用DMEM/F12培養基浸泡置4℃備用。
二、細胞接種將處理好的多孔微載體按1-1.5g/L的濃度加到攪拌瓶中，并加入含1％血清的培養基。在方瓶和轉瓶中培養的貼壁細胞如CHO細胞，經0.25％的胰酶消化，用培養基吹打制成細胞懸液，直接接種到攪拌瓶中，而在方瓶中培養的雜交瘤等懸浮細胞，可直接用培養基吹打制成細胞懸液接種到攪拌瓶中培養。一般接種密度需大于2×105細胞/mL，最好接種密度為5×105細胞/mL。接種后5h內，攪拌轉速一般為(20-40)r/min，以讓細胞較充分接觸多孔微載體，隨后可將轉速提高至(50-60)r/min，培養溫度為37.0℃±0.1℃。
三、細胞馴化將生長在多孔微載體上的細胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養，培養3d后，可根據培養基中葡萄糖濃度適量換液，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉速50-60r/min，至細胞密度大于5×106細胞/mL，換液量一般為1/2-1個培養體積；并將培養基中的血清含量逐漸降到0％，以馴化細胞適應無血清培養基。
四、細胞培養將細胞懸液由攪拌瓶轉移至7.5L Biostat CT反應器(工作體積為5L，B.Braun公司，德國)，爾后再轉移至30L Biostat UC反應器(工作體積為20L，B.Braun公司，德國)逐級放大培養反應器中逐級放大培養，使用無泡通氣供氧系統，采用批式換液連續培養工藝，定期更新部分微載體，對細胞進行無血清培養。
由于細胞能在長滿細胞的載體和空載體之間自動轉移，每級放大培養時，先在更大規模的反應器中預先加入適量培養基和經過處理的多孔微載體，長滿細胞的多孔微載體通過管道直接進入下一級反應器中，而無需胰酶的消化來幫助細胞培養的接種和放大。這種種子細胞制備方法和反應器細胞接種方法非常簡便，并且可以嚴格保證無菌，為多孔微載體細胞培養的規模放大提供了條件。
五、多孔微載體中生長細胞的染色與計數1.MTT染色法取出樣品后用5mg/ml MTT溶液染色，置37℃下2h-4h后，在顯微鏡下觀察，長有細胞的多孔微載體為黑色，未長細胞的多孔微載體仍為本白色。
2.結晶紫染色法取樣5ml于10ml試管中，待多孔微載體沉降后用吸管盡可能多地吸出上清，爾后加入等量的含0.1％結晶紫的0.1mol/L檸檬酸溶液，每隔1h用吸管吹打、搖蕩，置于37℃下3小時后，搖勻待微載體稍沉降后，用吸管緊靠液面吸取適量液體于血球計數板上，數出被染成深紫色的細胞核數。
實施例2、無血清培養基的制備細胞培養密度大于2×106細胞/mL后，可以逐漸換用無血清培養基。無血清培養基有兩種一種為生長型無血清培養基，當細胞密度大于2×106細胞/mL后，用這種培養基培養CHO細胞，其比生長速率約為0.22d-1；另一種為表達型無血清培養基，當細胞密度大于107細胞/mL后，用這種培養基培養CHO細胞，其比生長速率約為0.11d-1，較低的生長速率有利于維持高密度培養條件下的細胞密度的相對穩定，對保持溶氧水平和細胞表達水平有利。
1、生長型無血清培養基的制備(1)成分及含量見表2。
表2 配制10L生長型無血清培養基成分一覽表

(2)制備方法按表2稱取各成分于10L無菌無熱源的容器中，加入10L純凈水攪拌溶解，用0.22μm濾膜過濾除菌。
2、表達型無血清培養基的制備(1)成分及含量見表3。
表3 配制10L表達型無血清培養基成分一覽表

(2)制備方法按表3稱取各成分于10L無菌無熱源的容器中，加入10L純凈水攪拌溶解，用0.22μm濾膜過濾除菌。
用無血清培養基培養雜交瘤細胞時，在細胞密度大于5×106cells/mL后換用表達型培養基，可以在表3的基礎上添加5×10-5mol/L巰基乙醇。
實施例3、生物反應器高密度長期培養基因重組CHO細胞并高效表達基因重組尿激酶原(rhPro-UK)一、纖維素多孔微載體預處理，見實施例1。
二、細胞接種將處理好的多孔微載體按1-1.5g/L的濃度加到攪拌瓶中，并加入含1％血清的培養基。在方瓶和轉瓶中培養的貼壁細胞Pro-UK的基因重組CHO細胞系CL-11G(見中國專利，專利號為ZL96119836.2，國際專利主分類號C12N 15/58)，經0.25％的胰酶消化，用培養基吹打制成細胞懸液，直接接種到攪拌瓶中，接種密度需大于2×105細胞/mL，最好接種密度為5×105細胞/mL。接種后5h內，攪拌轉速一般為(20-40)r/min，以讓細胞較充分接觸多孔微載體，隨后可將轉速提高至(50-60)r/min，培養溫度為37.0℃±0.1℃。
三、細胞馴化將生長在多孔微載體上的細胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養，培養3d后，可根據培養基中葡萄糖濃度適量換液，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉速50-60r/min，至細胞密度大于5×106細胞/mL，換液量一般為1/2-1個培養體積；并將培養基中的血清含量逐漸降到0％，以馴化細胞適應無血清培養基。
四、細胞培養將馴化好的種子細胞接種到30L Biostat UC(工作體積為20L，B.Braun，德國)無泡通氣攪拌式反應器中，接種密度一般為106細胞/mL，先用無血清生長型培養基，控制pH＝7.0±0.05，溶氧(DO)＝20％-40％，溫度＝37.0℃±0.1℃，攪拌轉速為70rpm-90rpm，多孔微載體的濃度為2g/L-4g/L培養基。采用批式換液連續培養方式，在細胞密度大于107細胞/mL后，改用無血清表達型培養基，每天通過細胞截留系統換液1-1.2個工作體積，將微載體截留在反應器中，收獲含產品的上清并加入等量新鮮培養基。為保持長期培養細胞的活力，并維持高密度培養條件下細胞的表達水平，當多孔微載體中長滿細胞后，在細胞表達水平急劇下降前，用新多孔微載體部分更換長滿細胞的多孔微載體。微載體的更換量和更換頻率視細胞表達水平而定。一般地，如果一次更換1/2-2/3的多孔微載體，可以維持細胞良好生長1個月以上，而如果每次更新1/4左右的微載體，一般每隔15d左右就需更換部分微載體。采用這種培養模式，細胞密度可一直維持在(1-2)×107細胞/mL，活細胞比例可維持在90％-95％，培養上清中Pro-UK濃度可以維持在50mg/L-100mg/L，每天可收獲上清20L-25L，可獲得產品(1-2.5)g/d，整個培養時間可維持在3個月以上。
實施例4、生物反應器高密度培養鼠-鼠雜交瘤細胞3G7-anti-Pro-UK生產抗尿激酶原單克隆抗體一、纖維素多孔微載體預處理，見實施例1。
二、細胞接種將處理好的多孔微載體按1-1.5g/L的濃度加到攪拌瓶中，并加入含1％血清的培養基。將分泌抗尿激酶原抗體的鼠-鼠雜交瘤細胞系3G7-anti-scuPA細胞懸液(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，北京市海淀區中關村北一條13號，100080，電話010-62542758，保藏日為2003年9月8日，保藏號為CGMCC No.0999，建議的分類命名為3G7-anti-scuPA鼠-鼠雜交瘤細胞系)。直接接種到攪拌瓶中，接種密度需大于5×105細胞/mL。接種后5h內，攪拌轉速一般為(20-40)r/min，以讓細胞較充分接觸多孔微載體，隨后可將轉速提高至(50-60)r/min，培養溫度為37.0℃±0.1℃。
三、細胞馴化將生長在多孔微載體上的細胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養，培養3d后，可根據培養基中葡萄糖濃度適量換液，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，pH值7.0±0.05，轉速50-60r/min，至細胞密度大于5×106細胞/mL，換液量一般為1/2-1個培養體積；并將培養基中的血清含量逐漸降到0％，以馴化細胞適應無血清培養基。
四、細胞培養將馴化后的細胞懸液直接接種到5L攪拌式反應器(Biostat CT5，B.Braun公司，德國)中培養，接種密度一般為106細胞/mL，先用無血清生長型培養基，控制pH＝7.0±0.05，溶氧(DO)＝20％-40％，溫度＝37.0℃±0.1℃，攪拌轉速為70rpm-90rpm，多孔微載體的濃度為2g/L-4g/L培養基。采用批式換液連續培養方式，在細胞密度大于107細胞/mL后，改用無血清表達型培養基，每天通過細胞截留系統換液1-1.2個工作體積，將微載體截留在反應器中，收獲含產品的上清并加入等量新鮮培養基。采用本發明中的培養模式，細胞密度可達1×107細胞/mL，活細胞比例可維持在90％-95％，培養上清中抗體滴度一般可達1∶150000-1∶300000，整個培養時間可維持在2個月以上。
權利要求
1.動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，包括如下步驟(1)纖維素多孔微載體預處理將纖維素多孔微載體用0.1mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液(PBS)浸泡4h后，傾去PBS，再用PBS洗滌3次；121℃高壓滅菌30min后，吸出PBS，用DMEM/F12培養基洗滌2次后置4℃備用；(2)細胞接種攪拌瓶中加入處理好的多孔微載體和含血清培養基，將細胞懸液按所需接種密度接種到攪拌瓶中培養，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，轉速20-100r/min；(3)細胞馴化將生長在多孔微載體上的細胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養，并將培養基中的血清含量逐漸降到0％，培養條件為溫度37.0℃±0.1℃，溶氧20％-40％，pH值7.0±0.05，轉速20-100r/min，至細胞密度大于5×106細胞/mL，換液量一般為1/2-1個培養體積；(4)細胞培養將細胞懸液轉移至反應器中逐級放大培養，使用無泡通氣供氧系統，采用批式換液連續培養工藝，定期更新部分微載體，對細胞進行無血清培養。
2.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述纖維素多孔微載體是Cytopore-2。
3.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(2)細胞接種步驟中多孔微載體的濃度為1-4g/L。
4.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(2)細胞接種步驟中血清培養基的濃度為2％。
5.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(2)細胞接種步驟中細胞懸液的接種密度為2×105-5×105細胞/mL。
6.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(4)細胞培養步驟中的轉移是指使用管道將長滿細胞的多孔微載體直接導入下一級反應器中。
7.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(4)細胞培養步驟中的反應器中預先加入適量培養基和經過處理的多孔微載體。
8.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(4)細胞培養步驟采用批式換液連續培養是指每天通過細胞截留系統換液1-1.2個工作體積，將微載體和細胞截留在反應器中，收獲含產品的上清并加入等量新鮮培養基。
9.根據權利要求1所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述(4)細胞培養步驟的無血清培養是指依次使用無血清生長培養基和無血清表達培養基對反應器內的細胞進行培養。
10.根據權利要求1至9中任何一項所述的動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，其特征在于所述動物細胞為貼壁細胞或懸浮細胞。
11.用于動物細胞多孔微載體固定化高效培養的無血清培養基，其特征在于該無血清培養基包括生長型無血清培養基和表達型無血清培養基，每10L培養基的成分及其含量分別見下表生長型無血清培養基成分及其含量
表達型無血清培養基成分及其含量
全文摘要
本發明公開了一種動物細胞多孔微載體固定化高效培養方法，包括如下步驟(1)纖維素多孔微載體預處理；(2)細胞接種攪拌瓶中加入處理好的多孔微載體和含血清培養基，將細胞懸液按所需接種密度接種到攪拌瓶中培養；(3)細胞馴化將生長在多孔微載體上的細胞懸液在攪拌瓶中逐級放大培養，并將培養基中的血清含量逐漸降到0％；(4)細胞培養將細胞懸液轉移至反應器中逐級放大培養，定期更新部分微載體，對細胞進行無血清培養。本發明的優點是(1)細胞培養密度高；(2)可方便放大培養規模；(3)細胞培養時間長，一般可達100天左右；(4)無血清培養基價格低廉；(5)反應器的生產能力高；(6)適用于貼壁細胞和懸浮細胞的培養。
文檔編號C12N11/00GK1556203SQ20031012425
公開日2004年12月22日 申請日期2003年12月31日 優先權日2003年12月31日
發明者胡顯文, 肖成祖, 高麗華, 李佐虎, 陳照烈, 劉紅, 胥照平, 張正光, 李世崇, 王菲 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所, 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工