具有抗腫瘤功能的雙功能融合蛋白及其制備方法和應用的制作方法

專利名稱：具有抗腫瘤功能的雙功能融合蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤免疫學領域，具體涉及一種具有抗腫瘤功能的雙功能融合蛋白及其編碼核酸、制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤的免疫治療是指主要通過腫瘤宿主防御機制或生物制劑的作用以調節機體自身的生物學反應，從而抑制或殺滅腫瘤細胞。它已經成為繼手術、放療、化療之后的第四種治療模式，被譽為常規手段的“完善療法”，為腫瘤的治療提供了新的希望。在我國，肝癌，乳腺癌淋巴細胞瘤的發病率很高，是最常見的惡性腫瘤之一。肝癌患者就診時約有2/3已喪失手術時機，即使能行手術切除者，因為無法切除肉眼看不見的腫瘤組織，術后復發率較高，更主要的是手術不能除去腫瘤發生的根本原因。放化療對造血和免疫系統均有嚴重的抑制作用，甚至導致機體免疫力進一步下降，致使腫瘤廣泛轉移。因而，尋找有效的腫瘤免疫治療新方法對于肝癌的徹底治愈具有極其重要的意義。
近年來的研究表明針對腫瘤凋亡或細胞增殖的細胞表面分子(如FAS，EGFR，HER2等)的單克隆抗體可直接誘導腫瘤細胞的凋亡(Shimizu M等，Biochem Biophys ResCommun.1996，228(2)375-9)。該發現拋棄了腫瘤治療中抗原抗體反應的傳統理念，而轉向利用mAb靶向性調控細胞凋亡和增殖的信號傳導通路，抗人HER2的單抗Herceptin成為第一個被FDA批準上市的治療乳腺癌的單克隆抗體，其療效已得到充分的肯定，為腫瘤的免疫治療開辟了一個新的領域。目前研究的腫瘤靶向性治療靶基因雖然較多，但主要集中于兩條信號傳導通路之中。其一是激活腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族，通過Caspase介導的細胞凋亡信號通路發揮作用；其二是阻斷表皮生長因子受體(EGFR)家族介導的Ras途徑。
TNF-R家族主要包括Fas、TNF受體和TRAIL受體。高表達于某些大腸癌、乳腺癌、前列腺癌、神經母細胞瘤組織細胞中。它們在單體狀態下沒有活性，但在相應配體(如FAS-配體、TNF或TRAIL)，或單克隆抗體(mAb)的作用下，可最終激活Caspase3。Caspase3可切割凋亡底物使其活化，造成細胞程序化死亡。FAS配體也可造成部份肝癌和黑色素瘤細胞的凋亡。但是，由于FAS也同時表達于胸腺，肝臟，心和腎。在體內實驗中，抗FAS mAb或FAS配體可對上述正常組織細胞產生傷害(尤其是肝)，從而大大限制了它們在抗腫瘤治療中的應用。
EGFR亞家族由4個密切相關的受體組成EGFR，HER2，HER3和HER4。均為具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，高表達于某些前列腺癌、大腸癌、乳腺癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌、非小細胞肺癌組織細胞中。它們在腫瘤的發生和發展過程中發揮著十分重要的作用。與FAS類似，在單體狀態下沒有活性，一旦在配體作用下發生結合形成二聚體，即可通過強有力的酪氨酸激酶活性激活下游的信號傳導通路，誘導腫瘤的發生。EGFR或HER2特異的單克隆抗體(mAb)可靶向性地阻斷它們與其配體的結合，從而阻斷腫瘤細胞增殖的信號傳導通路，抑制腫瘤生長并誘發細胞凋亡。
無論是FAS還是EGFR或是HER-2，雖在某些腫瘤細胞中高表達，但也表達于某些重要的正常組織中(如肝，腎，淋巴結等)。對這些正常組織信號傳導通路的干擾有可能帶來較大的副作用。P230是特異表達于人肝癌、乳腺癌和黑色素瘤組織細胞中的蛋白分子。由于它在Western bloting中可與單克隆抗體SM5-1(US專利申請號09/915,746)結合，并在230KD處顯現特異條帶故而得名。在體外無補體作用的培養液中，SM5-1可通過p230誘導肝癌細胞株(XJC)和黑色素瘤細胞株(U10)發生凋亡。裸鼠荷瘤實驗也證實p230在SM5-1的誘導下可抑制腫瘤生長。流式細胞術表明SM5-1不能標記來源于C57BL/6小鼠的黑素瘤細胞B16和肝癌細胞hepal-6，將人抗原基因p230轉染B16和hepal-6細胞，用流式細胞術等方法證實了p230抗原蛋白能夠表達于小鼠腫瘤細胞的表面，應用SM5-1可誘導轉染有p230基因的B16(B16p230)和hepal-6(hepap230)細胞發生凋亡。將B16p230和hepap230細胞分別接種C57BL/6小鼠，發現它們均能在小鼠體內成瘤，給予SM5-1能夠造成腫瘤細胞大量壞死，抑制腫瘤的生長并造成腫瘤消退。
以上研究結果表明，p230是一個新發現的可用于肝癌治療的靶基因，抗人p230單抗可通過與p230的作用介導人肝癌細胞凋亡，是一個新的肝癌靶向治療單抗。
隨著治療性單抗技術的不斷進步，有越來越多的單抗藥物被用于腫瘤的臨床治療。但是，大量實驗結果表明，單純給予抗體治療并不能解決目前惡性腫瘤存在高復發率的問題，這也是其它治療性單抗包括已經上市的抗HER-2單克隆抗體Herceptin及抗CD20的單抗Rituximab等所遇到的共同難題。導致這一問題的主要障礙是，用這些抗體藥物施治后，總有少量腫瘤細胞不能被殺死。這些殘存的細胞一旦條件合適(如抗體治療結束)，則會重新形成腫瘤。針對這個問題，如果能在發揮單抗良好的抗腫瘤療效的同時，充分激發機體對腫瘤的特異性主動免疫應答，將機體對腫瘤的被動免疫與主動免疫反應有機地結合起來，就能更強地發揮抗腫瘤作用并且產生對同種腫瘤的“免疫力”，解決抗體治療或其他治療方法中存在的腫瘤復發的實際問題。
作為被動免疫治療劑，過去十年單抗藥物獲得了巨大成功，已被用于臨床治療腫瘤等重大疾病。鼠源、人源的制備，鼠源抗體人源化改造、重組細胞株構建、重組抗體純化等技術已經日益成熟，引物設計、定點突變、表達載體的構建、受體細胞的轉染和重組細胞的篩選方法、細胞培養技術已經成為當今分子生物學的成熟技術。
腫瘤疫苗作為一種腫瘤特異性主動免疫治療的方式，是指給機體輸入具有腫瘤抗原性的疫苗，刺激機體免疫系統產生抗腫瘤免疫效應，用于治療腫瘤及免疫機體對腫瘤的復發進行預防。目前研究得較多的是以樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)為基礎的融合細胞性腫瘤疫苗。DC是機體免疫系統中功能最強的專職性抗原提呈細胞(Antigen-presenting cells，APC)，其最大特點是能激活初始型T細胞(CD4+Th細胞和CD8+CTL細胞)，生成輔助性T細胞和殺傷性T細胞，DC能識別、加工、提呈抗原，表達高水平MHC類分子、共刺激分子、粘附分子，同時分泌高水平的IL-12，激活相應的免疫細胞，在抗腫瘤免疫中起重要作用。腫瘤患者體內的DC可能因數量或功能原因而缺乏對腫瘤特異性抗原的有效提呈，使腫瘤逃脫了機體的免疫監視。如果將機體的DC提取出來，經體外各種免疫調節劑的激活，用各種形式腫瘤抗原修飾DC，然后回輸體內，通過DC對腫瘤抗原的高效提呈作用則可打破機體對腫瘤的免疫耐受，有效激發機體的特異性抗腫瘤免疫反應。目前，以DC為基礎的腫瘤疫苗已經在抗腫瘤免疫治療中展現了突出的療效，臨床應用已迅速展開。但是，DC疫苗運用于臨床還有許多亟待解決的問題①由于MHC的嚴格限制作用，必須從患者外周血中分離、擴增制備大量的DC后再回輸入血，此技術難度較高。②體外擴增后，DC的性質、抗原提呈能力是否發生變化以及由此對研究結果的影響還有待驗證。③針對不同的腫瘤治療方案，需要確定致敏DC所需的抗原/RNA劑量、DC的免疫途徑、劑量、次數、間隔時間等。針對以上實際問題，考慮到如果能使DC細胞的擴增、活化及抗原修飾在肝癌患者機體內完成，將會大大簡化DC疫苗的制備程序。但這個設想的實現基于兩個問題的解決，一是如何在體內完成DC的擴增及活化，二是如何在體內為有功能的DC提供足夠的腫瘤抗原進行修飾。對于以上的第二個問題，制備的肝癌靶向性單抗SM5-1有效地誘導肝癌細胞凋亡所產生的細胞裂解物及凋亡小體等可作為腫瘤抗原修飾DC。因此，如何在體內完成DC的擴增及活化并在腫瘤局部選擇性集聚就成為了突出的問題。
因此，本領域迫切需要開發新的有效治療腫瘤的藥物。

發明內容
簡述本發明的目的就是一種新的有效治療腫瘤的物質，它是含有(a)具有誘導腫瘤細胞凋亡功能的分子作為第一部分和(b)Flt3配體作為第二部分的雙功能融合蛋白。
在本發明的第一方面，提供了一種具有抗腫瘤功能的雙功能融合蛋白，所述融合蛋白包括第一部分和第二部分，第一部分為具有誘導腫瘤細胞凋亡功能的分子，第二部分為Flt3配體。
在一優選例中，所述的誘導腫瘤細胞凋亡的分子選自單克隆抗體、單克隆抗體的可變區、或誘發腫瘤細胞凋亡的蛋白分子或其變異體。
在另一優選例中，所述的誘導腫瘤細胞凋亡的分子選自(a)SM5-1抗體、CD20抗體、Her2抗體、Her3抗體、Her4抗體、EGFR抗體或其可變區；(b)Fas、TNF受體、Trail受體、或其胞外區。
在另一優選例中，在第一部分和第二部分之間還含有長度為10-25個氨基酸的接頭序列或異亮氨酸拉鏈序列。
在另一優選例中，所述融合蛋白含有SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO44，SEQ ID NO46，SEQ IDNO48，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66或SEQ ID NO68所示的氨基酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發明的雙功能融合蛋白。較佳地，所述的核酸分子具有SEQ ID NO23，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQID NO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO43，SEQ ID NO45，SEQ ID NO47，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65或SEQ IDNO67所示的核苷酸序列。
在本發明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發明上述的核酸分子，以及與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列。
在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發明上述的載體。
在本發明的第五方面，提供了一種制備本發明的雙功能融合蛋白的方法，該方法包括a)在表達條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達雙功能融合蛋白，b)分離或純化所述的雙功能融合蛋白。
在本發明的第六方面，提供了本發明雙功能融合蛋白的用途，它被用于制備抗腫瘤藥物。
在本發明的第七方面，提供了一種藥物組合物，它含有本發明的雙功能融合蛋白以及藥學上可接受的載體。


圖1顯示了雙特異四價抗體分子(A)和雙功能蛋白Flex/Fc/Fv(B)融合蛋白基因結構。
圖2顯示了FLex的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸(SEQ ID NO2)序列。SP為信號肽序列。
圖3顯示了FLex-Ig的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQ ID NO4)序列。SP為信號肽序列；FLex，人FL膜外區基因。
圖4顯示了接頭(Gly4Ser)3的核苷酸(SEQ ID NO5)和氨基酸(SEQ ID NO6)序列。SP為信號肽序列。
圖5顯示了抗人p230單抗(SM5-1)可變區基因PCR產物的1％瓊脂糖凝膠分析。其中泳道1SM5-1重鏈可變區；泳道2SM5-1輕鏈可變區；泳道3DL2000 DNA標準物。
圖6顯示了SM5-1單抗的重鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO7)和氨基酸(SEQ ID NO8)序列。SP為信號肽序列。
圖7顯示了SM5-1單抗的輕鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO9)和氨基酸(SEQ ID NO10)序列。SP為信號肽序列。
圖8顯示了SM5-1嵌合抗體(chSM)重鏈的核苷酸(SEQ ID NO11)和氨基酸(SEQ IDNO12)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖9顯示了SM5-1嵌合抗體(chSM)輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO13)和氨基酸(SEQ IDNO14)序列。SP為信號肽序列；Stop，翻譯終止密碼；圖10顯示了SM5-1嵌合重鏈表達載體示意圖；其中HCMV pro表示人巨細胞病毒Major Immediate早期啟動子；VH表示人源化SM5-1的重鏈可變區基因；CH表示人γ1鏈恒定區編碼基因；BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信號；SV40 ori表示SV40病毒早期復制起點；DHFR表示二氫葉酸還原酶基因；pUC origin為質粒復制起點；Amp為氨芐青霉素抗性基因。
圖11顯示了SM5-1輕鏈表達載體示意圖，其中VL表示人源化SM5-1的輕鏈可變區基因；CL表示人鏈恒區基因，其余元件同圖10。
圖12顯示了SM5-1人源化抗體(huSM)重鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO15)和氨基酸(SEQ ID NO16)序列。SP為信號肽序列。
圖13顯示了SM5-1人源化抗體(huSM)輕鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO17)和氨基酸(SEQ ID NO18)序列。SP為信號肽序列。
圖14顯示了SM5-1人源化抗體(huSM)重鏈的核苷酸(SEQ ID NO19)和氨基酸(SEQID NO20)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖15顯示了SM5-1人源化抗體(huSM)輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO21)和氨基酸(SEQID NO22)序列。SP為信號肽序列；Stop，翻譯終止密碼；圖16顯示了HuSMVH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO23)和氨基酸(SEQ IDNO24)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖17顯示了huSMVH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO25)和氨基酸(SEQID NO26)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖18顯示了FL/Fc/huSMFv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO27)和氨基酸(SEQ IDNO28)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖19顯示了SM5-1與Flex融合后的hFLex/Fc/Fv融合蛋白基因結構。
圖20顯示了chSMVH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO29)和氨基酸(SEQ IDNO30)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖21顯示了chSMVH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO31)和氨基酸(SEQID NO32)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖22顯示了FL/Fc/chSMFv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO33)和氨基酸(SEQ IDNO34)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖23顯示了2B8單抗的重鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列。SP為信號肽序列。
圖24顯示了2B8單抗的輕鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列。SP為信號肽序列。
圖25顯示了CD20嵌合抗體重鏈的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖26顯示了CD20嵌合抗體輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。SP為信號肽序列；Stop，翻譯終止密碼；圖27顯示了CD20VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ IDNO44)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖28顯示了CD20VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQID NO46)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；
圖29顯示了FL/Fc/CD20Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO47)和氨基酸(SEQ IDNO48)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖30顯示了CD20與Flex融合后的hFLex/Fc/scFv融合蛋白基因結構圖31顯示了Her2人源化抗體重鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ IDNO50)序列。SP為信號肽序列。
圖32顯示了Her2人源化抗體輕鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ IDNO52)序列。SP為信號肽序列。
圖33顯示了Her2人源化抗體重鏈的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ ID NO54)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖34顯示了Her2人源化抗體輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ ID NO56)序列。SP為信號肽序列；Stop，翻譯終止密碼；圖35顯示了her2VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ IDNO58)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖36顯示了her2VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQID NO60)序列。SP為信號肽序列，陰影區表示內含子序列；Stop，翻譯終止密碼；圖37顯示了FL/Fc/her2Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ IDNO62)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖38顯示了Her2與FL融合后的hFLex/Fc/Fv融合蛋白基因結構圖39顯示了hFLex/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ IDNO64)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖40顯示了hFLex/TRAILex融合蛋白基因結構圖41顯示了hFLex/IZ/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ IDNO66)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖42顯示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ IDNO68)序列。SP為信號肽序列，Stop，翻譯終止密碼；圖43顯示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白基因結構圖44顯示了SM/FL對人臍血CD34+細胞的體外擴增作用。
圖45顯示了SM/FL對NK和DC細胞的體內擴增作用。
圖46顯示了抗人SM5-1嵌合性單抗/FL融合蛋白(A)、抗SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白(B)對各種細胞的體外抑制增殖曲線圖47顯示了FL融合蛋白對B16(A)、Hepal-6(B)、B16p230(C)和Hepal-6p230(D)等細胞的體外抑制增殖曲線圖48顯示了Her2/FL融合蛋白(A)和heceptin(B)對各種腫瘤細胞的體外抑制增殖曲線圖49顯示了Her2/FL融合蛋白(A)和heceptin(B)對各種腫瘤細胞的體外殺傷活性圖50顯示了CD20/FL融合蛋白對各種腫瘤細胞的體外殺傷活性圖51顯示了Trail/FL融合蛋白(A)和Trail(B)對各種腫瘤細胞的體外抑制增殖曲線圖52顯示了Trail/FL融合蛋白(A)和Trail(B)對各種腫瘤細胞的體外殺傷活性圖53顯示了抗HER-2/FL融合蛋白體內抗腫瘤活性。
圖54顯示了CD20/FL融合蛋白體內抗腫瘤活性。
圖55顯示了TRAIL/FL體內抗腫瘤活性。
圖56顯示了chSM/FL、huSM/FL融合蛋白的體內分布。
圖57顯示了抗人Her2單抗、抗人CD20單抗和TRAIL與FL組成的三種融合蛋白的體內分布實驗。
發明詳述發明的詳細內容將分以下幾部分介紹。
A、定義除非另有詳細說明，本文所用的技術和科學術語同常規術語。
B、含有(a)具有誘導腫瘤細胞凋亡功能的分子作為第一部分和(b)Flt3配體作為第二部分的雙功能融合蛋白。
一方面，本發明是一種雙功能融合蛋白，該蛋白包括Flt3配體或其中的生物活性片段，和一種蛋白質或多肽分子，該分子能誘導腫瘤細胞調亡。更好的是，該融合蛋白是一個獨立的蛋白，與其它蛋白、多肽或分子無聯系，是重組宿主細胞培養的純化產物或作為一種純化的提取物。
任何適合的Flt3配體均涉及本文提供的成分和方法。本文使用的術語“Flt3配體”是指一種多肽，能結合Flt3受體并誘導信號傳導。Flt3配體或其中的生物活性片段包括一部分保守氨基酸替代序列，該序列并不影響其活性。適當替換氨基酸是本領域的共知技術，此項工作可以很容易進行并且保證不改變所得分子生物活性。這些技巧使人們認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。表1是這種替換的一些示例。
表1原氨基酸殘基 保守性置換Ala(A) Gly；SerArg(R) LysAsn(N) Gln；HisCys(C) SerGln(Q) AsnGlu(E) AspGly(G) Ala；ProHis(H) Asn；GlnIle(I) Leu；ValLeu(L) Ile；Val
原氨基酸殘基 保守性置換Lys(K) Arg；Gln；GluMet(M) Leu；Tyr；IlePhe(F) Met；Leu；TyrSer(S) ThrThr(T) SerTrp(W) TyrTyr(Y) Trp；PheVal(V) Ile；Leu可能還有其他的類似的可替換性，這種可替換性往往可以根據經驗確定或者根據已知的保守序列進行確定。
Flt3配體是I型跨膜蛋白，以可溶性同源二聚體的形式釋放到細胞外。見Lyman et al.，Flt3 ligand in THE CYTOKINE HANDBOOK(Thomson et al.ed.，4th ed(2003))。一種具體情況，Flt3配體或其生物活性片段是可溶的。在氨基酸水平人Flt3配體與鼠Flt3配體有72％的同源性，具有鼠源蛋白的很多特點，如糖基化位點，關鍵的半胱氨酸殘基及剪切連接點。很多研究都提示了合適的Flt3配體的蛋白。如Cell751157-67(1993)，Hannum et al.，Nature，368364-67(1996)；U.S.Patent No.5,843,423；U.S.Patent Application Serial Nos200030113341and 20030148516；and Genebank AccessionNos.NM 001459，U2 9874，U03858，and U04806.等。
Flt3配體的受體，即Flt3，是三型受體酪氨酸激酶受體家族的成員。在正常的細胞，Flt3表達于未成熟的造血細胞，如CD34+細胞，胎盤，生殖腺及腦組織。見，e.g.，Rosnet，et al.，Blood 821110-19(1993)；Small et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91459-63(1994)；and Rosnet et al.，Leukemia 10238-48(1996).Flt3高表達在惡性血液組織，如急性骨髓型白血病，急性前B細胞性淋巴細胞性白血病，急性T細胞性淋巴細胞性白血病和慢性骨髓性白血病。Flt3配體與其受體結合以后活化細胞內的信號轉導途徑，如STAT5，PI 3’-激酶，PLCγ，MAPK，SHC，SHP2，和SHIP。見e.g.，Gilliand et al.，Curr.Opin.Hematol.9274-81(2002).膜型FL和可溶性FL都可以結合并活化Flt3受體。
具體說來，Flt3配體(FL)或具有生物活性的片段都能刺激造血干細胞或祖細胞的增殖。特殊地，Flt3配體或具有生物活性的片段能選擇性地刺激骨髓前體細胞或單核細胞，巨噬細胞，B細胞，樹突狀細胞和自然殺傷細胞增殖。FL最初表達在骨髓微環境的造血細胞和其他細胞，包括B細胞，T細胞和骨髓前體細胞。FL是CD34+祖細胞的生長刺激因子，促進樹突狀細胞和天然殺傷細胞的增殖和分化。比如我們的研究表明Flt3通過NK細胞的活性介導抗腫瘤信號。Péron et al.，J.Immunol.1616164-70(1998).
Flt3配體還促進樹突狀細胞的成熟，使之針對腫瘤細胞更有效地發揮抗原遞呈細胞的作用。見，e.g.，Fong et al.，Gene Ther.9(17)1127-38(2002).更重要的是經Flt3配體誘導，成熟的樹突狀細胞從骨髓釋放到外周血，使刺激免疫應答的樹突狀細胞數量增多。但是這種有效的誘導需要其他造血生長因子和細胞因子的存在。
任一FL的生物活性片段都可以應用到目前的研究方法中。在這里，FL片段的生物活性的含義是指作為Flt3的刺激因子，其仍然能保持功能。通常情況下，Flt3配體與Flt3在細胞表面結合，刺激一個或多個信號傳導通路或途徑并引起細胞反應，例如增殖。正常情況下，活性片段至少保持50％的刺激Flt3的活性。在更適宜的條件下，活性片段能夠保持60％，70％，80％，90％，95％，99％和100％的刺激活性。Flt3的活性取決于采用一種合適的方法，包括但不僅僅限于信號分子的活性，這些信號分子包括STAT5，PLCγ，或者對Flt3依賴的細胞體外的體外增殖活性。例如，BAF/BO3細胞株缺乏Flt3受體，是IL-3依賴型細胞株。但是，用Flt3轉染BAF/BO3細胞株，能夠使其對Flt3配體誘導的增殖產生應答。見Hatakeyama，et al.，Cell59837-45(1989).
具體地說，Flt3配體或生物活性片段在融合蛋白中具有SEQ ID NO2氨基酸序列。Flt3配體能夠特異性與和SEQ ID NO2氨基酸序列相結合的抗體相結合，并且，Flt3配體能夠持續保持其生物學活性，任何合適的Flt3配體特異性抗體都能應用。另外，Flt3配體包含一段序列，該序列與SEQ ID NO2的28到128位具有80％的同源性。Flt3配體還包含一段氨基酸序列，該序列是從SEQ ID NO2的28到160位和28到182位的氨基酸殘基中選擇出來的。在特殊情況下，Flt3配體還包含一段SEQ ID NO2的28到128位的氨基酸殘基。Flt3配體包含至少100個氨基酸殘基，并且Flt3配體與SEQ ID NO2具有至少40％的同源性，這種同源性取決于SEQ ID NO2中的相同氨基酸序列的大小，并且，Flt3配體始終保持其生物學活性。
任何的生物活性片段都可應用到在這里提到的腫瘤有關方法當中。應用于此，“腫瘤藥物”指的是能引起腫瘤細胞死亡的藥物。這種藥物通常是蛋白類的或多肽類的，這種細胞死亡可以是凋亡，壞死或類似情況。一般情況下，細胞死亡是由凋亡引起的，這種凋亡或者直接由能夠誘導Fas配體的凋亡信號途徑或間接地通過生長因子的失活而產生的。在這里，凋亡指的是腫瘤細胞的程序性死亡及最終導致染色質的凝集和DNA的裂解。任何一種合適的方法都可以用于細胞凋亡的評估，包括但不僅僅限于流式分析，例如TUNEL分析，瓊脂糖凝膠分析和caspase 3活性分析。另外，融合蛋白的腫瘤藥物在自然情況下發生抗腫瘤活性。這種藥物包括能誘導腫瘤細胞生長停滯或死亡的受體的配體，包括自然情況下出現配體等分子，可以誘導包括TNF-α，Fas(CD95)配體，TRAIL，淋巴毒素(LT)，TWEAK，以及其他TNF配體超家族成員的凋亡。具體講，以后的腫瘤藥物是從FAS配體，TNF，TRAIL或者具有生物活性的細胞外基序中挑選出來的。另外，腫瘤藥物的生物活性片段具有至少50％的凋亡活性，在合適的情況下，衍生片段具有60％，70％，80％，90％，95％，99％及100％的凋亡活性。
另外，腫瘤藥物是一種能夠抑制腫瘤增殖，在一些情況下，也能誘導凋亡的蛋白。這些抗體的靶向分子包括例如表皮細胞生長因子受體亞家族(包括EGFR，HER2，HER3和HER4)這些都是具有酪氨酸激酶活性的穿膜蛋白，這些蛋白在大多數惡性腫瘤(包括前列腺癌，結腸癌，乳腺癌，腎癌，卵巢癌，肺癌，胰腺癌)中表達，特異地抗EGFR或抗HER2抗體能夠阻斷這些蛋白與EGFR和HER2的結合從而阻斷腫瘤細胞增殖的信號傳導途徑，直接或間接抑制腫瘤生長，誘導腫瘤細胞的凋亡。見e.g.，Clin.CancerRes.81720-30(2002)；Brodowicz et al.Br.J.Cancer851764-70(2001)；Crombet-Ramos et al.，Int.J.Cancer101567-75(2002)；Herbst et al.，Expert Opin.Biol.Ther.1719-32(2001).
另外，腫瘤藥物是一種能與腫瘤特異或相關抗原結合的誘導凋亡的蛋白。例如，p230是一種在人肝癌，乳腺癌，淋巴瘤細胞中特異表達的蛋白，其命名源于應用SM5-1單抗通過Western blotting檢測方法得到的一條明顯的特異的230KD的條帶。See U.S.PatentApplication Serial No.09/915,746.P230由于其特異性提示它可以作為腫瘤免疫治療的目標靶向基因，P230與配體或抗體的結合可以誘導細胞凋亡。一些抗SM5-1抗體可以在例3中得到描述。在一些特殊情況下，應用Serial No.(Attomey Docket No.54906-2000100)蛋白可以封閉SM5-1。
另外，腫瘤藥物是一種抗體或具有生物學活性的片段，在這里，抗體是指完整的抗體，Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2片段，Fv片段，二體，單鏈抗體，和抗體片段組成的多特異性抗體，其分子仍能夠保持生物學活性。現在應用在各種方法中的抗體能夠通過細胞培養，抗生素和動物中產生，這些動物包括但不僅僅局限于牛，兔，山羊，小鼠，大鼠，倉鼠，豚鼠，綿羊，狗，貓，猴，猩猩，人猿等。因此，目前應用的抗體都是哺乳動物來源的抗體。
噬菌體技術可以用來分離初始抗體或者生產不同的特異性或親和力。這種技術已經成熟。具體地說，可以通過眾所周知的重組技術來得到抗體。例如，可以通過含有編碼抗體DNA序列的載體轉染宿主細胞而得到重組抗體。一個或多個載體可以用來轉染表達至少一個VL和一個VH區至宿主細胞。對于得到和生產抗體的重組技術規范性的描述包括Delves，ANTIBODY PRODUCTIONESSENTIAL TECHNIQUES(Wiley，1997)；Shephard，et al.，MONOCLONAL ANTIBODIES(Oxford University Press，2000)；以及Goding，MONOCLONAL ANTIBODIESPRINCIPLES AND PRACTICE(Academic Press，1993)。
目前抗體的使用中可通過重組方法來修飾以提高抗體所需功能的有效性。同時可以預期抗體可以通過重組替換得以修飾。典型的這種替換為保守替換。例如，至少一個恒定區的氨基酸用其他殘基來取代。詳見U.S.Patent No.5,624,821，U.S.Patent No.6,194,551，Application No.WO 9958572；and Angal et al.，Mol.Immunol.30105-08(1993)。氨基酸的修飾包括缺失、添加和取代。在一些情況下，這種改變可以降低不需要的活性，如補體依賴細胞毒性。
抗體可以是人源化抗體。在這里所說的“人源化抗體”指抗體中非抗原結合區的氨基酸被改變，這樣抗體更加類似于人的抗體，而仍然保留其原始的抗原特異性。典型的是可變區為一種物種如小鼠，而恒定區為人的。抗體也可以是嵌合抗體。在這里所說的“嵌合抗體”指抗體中氨基酸序列被改變，抗體含有的序列來自一種以上的哺乳動物，而仍然保留其原始的抗原特異性。在這里所說的“單鏈抗體(ScFv)”指基因工程抗體，含有免疫球蛋白的重鏈可變區和輕鏈可變區，通過柔性多肽連接。
更佳的，這里所述的方法及組合物中的抗體為單克隆抗體。這里所說的“單克隆抗體”指由一個B細胞得到的單一抗體。
抗體可以是人的抗體。在這里所說的“人的抗體”指基本上抗體的完整的輕鏈和重鏈區包括互補性決定區均來自人。例如，通過人雜交瘤技術、人B細胞技術可得到人單克隆抗體(詳見Kozbor，et al.，Immunol.Today 4；72(1983)，EBV轉化技術(詳見Cole et al.MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96(1985))，或者使用噬菌體呈現技術(詳見Marks et al.，J.Mol.Biol.222581(1991))。一個特殊的例子，通過轉基因小鼠得到了人抗體。這種部分或完全的人抗體已有文獻發表，任何這種技術都可以應用。依據一個特別指出的例子，在轉基因小鼠中得到了表達人抗體輕鏈和重鏈基因的完整人抗體序列。對于制備生產人抗體的轉基因小鼠的規范性描述見于Application No.WO 02/43478。來自生產所需抗體的轉基因小鼠的B細胞可以再以雜交瘤細胞融合，這樣可以連續生產抗體。詳見U.S.Patent Nos.5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；and 5,545,806；and Jakobovits，Adv.Drug Del.Rev.3133-42(1998)；Green，et al.，J.Exp.Med.188483-495(1998)。
一個具體的例子，這里所用的抗體可以抑制目標腫瘤細胞的增殖。如果在某種抗體存在時細胞增殖是抑制的，而沒有該抗體或為非結合抗體時細胞增殖，則認為該抗體對于細胞增殖是抑制的。增殖可以通過任何一種合適的方法定量測定。典型的方法是通過體外測定放射標記的核苷酸(如3H-胸腺嘧啶核苷)與DNA的結合來定量增殖。具體來說，可以通過ATP發光，如CellT iter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(Promega)測定增殖。這樣，抗體可以特異的或針對任何調節細胞生存或生長的分子。
一個具體的例子，從一組含有抗p230、抗CD20、抗Her-2、抗Her-3、抗Her-4、抗EGFR抗體或其生物活性片段中篩選抗體。對于這些抗體包括例子規范性描述見于U.S.Patent Nos.5,677,171；6,399,061；6,458,356；6,455,043；and 5,705,157。
含有Flt3配體的融合蛋白或其生物活性片段以及殺癌細胞試劑的嵌合抗體可以用合適的連接子連接。例如，Flt3配體和殺癌細胞試劑可通過多肽連接子連接。一個特殊的例子，連接多肽是(Gly4Ser)3。
這里說的融合蛋白的成分和方法可以含有Flt3配體和殺癌細胞試劑以任何順序連接。例如，Flt3配體位于融合蛋白的N端。再例如，Flt3配體也可位于融合蛋白的C端。
融合蛋白可進一步包括在其C端含有一個多肽片段的多肽標簽。任何合適的標簽都可以使用。例如，標簽可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1(見表2)。這些標簽可用于融合蛋白的純化。
表2可使用的標簽系統


1.Prickett，et al.，BioTechniques，7(6)580-584(1989)2.Xie，et al.，Endocrinology，139(11)4563-4567(1998)3.Nagelkerke，et al.，Electrophoresis，182694-2698(1997)4.Tolbert and Lameh，J.Neurochem.，70113-119(1998)5.Chen and Katz，BioTechniques，25(1)22-24(1998)6.Tseng and Verma，Gene，169287-288(1996)7.Rudiger，et al.，BioTechniques，23(1)96-97(1997)8.Olah，et al.，Biochem.，22194-102(1994)9.Wang，et al.，Gene，169(1)53-58(1996)10.Grose，U.S.Patent No.5,710,24811.Bastin，et al.，Mol.Biochem.Parasitology，77235-239(1996)Invitrogen，Sigma，Santa Cruz Biotech另一方面，本發明提供了編碼一種融合蛋白的分離的核酸，也可以是其互補鏈；這種融合蛋白包括Flt3配體、其有活性的片段或者能殺傷腫瘤的蛋白質和多肽。在一個實例中，分離的編碼融合蛋白的核酸具有SEQ ID NO1、9、13、17、21或、25所示的核苷酸序列。本發明還提供了包含分離的編碼融合蛋白的核酸分子的載體。載體還可能包含所述核酸分子的序列操作性相連的表達調控序列。
任何編碼Flt3配體或其有活性的片段的合適的DNA結構都適用于本發明。這樣的結構包括但不限于Genbank編碼U03858和ATCC編碼ATCC 69382的核酸序列。可應用于本發明的還包括美國專利5,843,423和美國應用專利200030113341和20030148516中的DNA序列及其相應蛋白。
任何編碼能殺傷腫瘤的蛋白質和多肽的DNA結構也適用于本方法。下文實例中提及的序列都適用于本方法。
任何合適的載體都可以使用。用于細菌、真菌、酵母和哺乳動物細胞的克隆和表達載體均已敘及，如Pouwels et al.，CLONING VECTORS實驗室手冊(Elsevier最新版)。
表達載體包括連接有合適的轉錄和翻譯調節序列的融合蛋白DNA序列，如哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因。調節序列包括轉錄啟動子、操縱子、增強子、核糖體結合位點或控制轉錄和翻譯起始和終止的合適序列。在融合蛋白序列需要調節序列功能的時候，則連接合適的調節序列。這樣，啟動子序列被連接在編碼融合蛋白DNA序列前端。在宿主細胞內的復制的能力通常由復制起始點控制。用于轉化株識別的篩選基因也可加入表達載體另外，非天然的Flt3配體或能殺傷腫瘤的蛋白質和多肽的信號肽的編碼序列可以引入表達載體。例如信號肽(分泌引導物)序列可以和與融合蛋白編碼序列融合，從而使翻譯的融合蛋白有。信號肽可增強宿主細胞向胞外分泌嵌合多肽。信號肽在嵌合多肽從細胞內分泌出來的過程中可被切去。
哺乳動物或昆蟲宿主細胞培養系統也可用于重組融合蛋白的表達。Luckow andSummers綜述了痘病毒系統用于在昆蟲細胞中生產異種蛋白的情況(Bio/Technology647(1988).)哺乳動物來源的建系細胞也可應用。哺乳動物細胞系包括猴腎細胞COS-7(ATCC CRL 1651)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、Chinesehamster ovary(CHO)細胞、HeLa細胞、and BHK(ATCC CRL 10)細胞、來源于非洲綠猴腎細胞系CVI(ATCC CCL 70)的CV-1/EBNA-1細胞系(EMBO J.102821，1991)及NSO細胞系Galfre et al.，Methods Enzymol.733-46(1981))用于哺乳動物細胞表達載體的轉錄和翻譯調節序列可從病毒基因組中獲得。常用的啟動子和操縱子序列來源于多瘤病毒、腺病毒2、SV40和人巨細胞病毒。來源于SV40病毒基因組的序列，如SV40復制起始點、早期和晚期啟動子、增強子、連接子、POLYA位點，可為在哺乳動物細胞中表達其他基因序列提供基因元件。病毒早期和晚期啟動子尤其適用，因為二者容易從病毒基因組中獲得，并包括一個病毒的復制起始點。參照，Fiers et al.，Nature273113(1978)。大SV40片段和小SV40片段也可應用，它可提供從Hind III位點到Bgl I位點的大約250bp的序列，包括了SV40的復制起始點。
可用的哺乳動物細胞表達載體可如Okayama and Berg(所述構建Mol.Cell.Biol.3280(1983)。一種在C127鼠乳腺上皮細胞中高表達的系統可如Cosman et al所述構建(Mol.Immunol.23935，1986)。一種高表達載體PMLSV N1/N4已保存于ATCC，編碼39890，(Cosman et al.，Nature 312768，1984)。另外一種有用的哺乳動物表達在見EP-A-0367566和U.S.Pat.application Ser.No.07/701,415，在此也適用。逆轉錄病毒載體也適用。在天然信號肽序列的位置，可添加異源的信號肽序列，如U.S.Pat.No.4,965,195描述的IL-7的信號肽序列、Cosman等描述的IL-2受體的信號肽序列(Nature 312768(1984)、EP 367,566描述的IL-4的信號肽序列、U.S.Pat.No.4,968,607描述的I型IL-1受體的信號肽序列和EP 460,846描述的III型IL-1受體的信號肽序列。
生產融合蛋白的方法也已包括。該方法包括培養含有融合蛋白編碼核酸的重組細胞。該融合蛋白包括Flt3配體、其有活性的片段或者能殺傷腫瘤的蛋白質和多肽。細胞表達編碼的融合蛋白，表達的融合蛋白的復性。在一個實例中，方法還包括復性的融合蛋白的分離和/或純化。該方法的產物也被保護。可將融合蛋白純化為基本均一的性質，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當重組蛋白為分泌表達時，可以采用商品化的超濾膜，例如Millipore、Amicon、Pellicon等公司產品，首先將表達上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質。SP基團是較為理想的離子交換基團。最后，還可用反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產物進一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達到基本均一。
可利用含有flt3配基的親和層析柱對表達的融合性多肽進行純化。根據所使用的親和柱的特性，可利用常規的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結合在親和柱上的融合性多肽。另一種替代的方法是利用含有結合Flt3-L的抗體親和柱純化該融合性多肽。
為簡化純化步驟，可利用轉化的酵母細胞作為宿主細胞分泌性表達融合蛋白。從酵母細胞發酵上清中純化重組多肽的方法可參考Urdal等(J.Chromatog.296171，1984)論著。
利用含有特定核酸序列的重組細胞表達融合蛋白也包括在內。實例之一，該細胞可為真核細胞。特指的實例之一中，該細胞可為CHO細胞、COS細胞，或NSO細胞。
重組蛋白以及編碼該重組蛋白的核酸可利用適當的方法制備，例如，化學合成、重組表達，或其合并應用。參見John Wiley & Sons，Inc 2000年出版的《CurrentProtocols in Molecular Biology》，以及Cold Spring Harbor Laboratory Press1989年出版的《Molecular ConingA Laboratory Manual》。在一個實例中，編碼融合蛋白的核酸序列是利用PCR技術制備的，方法參見Prodromou等(Protein Eng.5(8)827-29；1992)論著。
提請保護的藥物成分含有一種融合蛋白，該融合蛋白即含有Flt3-L融合蛋白或其活性成分，又含有具有抗腫瘤活性的蛋白或多肽成分。該藥物成分還可含有賦形劑成分。本專利所述的藥用成分可利用常規的一種或多種方法制成藥用配方，以利于藥物活性成分發揮其藥理作用。這種制藥配方工藝可用常規的混懸、水針劑、顆粒、片劑、糖丸、膠囊、軟膏、噴霧干燥、凍干等制劑工藝。如何選擇適當的劑型取決于采用的給藥途徑。當采用液體制劑時，可選用水溶液、油(含動物、植物、礦物油)溶液、作為輔料。溶液中可含有生理性鹽溶液、甘油、PEG等。當使用液體制劑時，其中本發明所提及的蛋白含量從0.5％至90％(w/w)，尤其是指從1-50％。
另一方面是一種組合物，該組合物由以下部分組成a)有效劑量的Flt3配體和有腫瘤殺傷作用的肽或蛋白組成的融合蛋白；b)有效的抗腫瘤制劑。我們所指的抗腫瘤制劑是能夠抑制黑色素瘤、乳腺癌或肝癌的形成。它們通過誘導腫瘤細胞的生長抑制或凋亡發揮作用。還有一些抗腫瘤制劑包括細胞因子，配體，抗體，放射性核素和化療成分。比如IL-2，TNF等；131I，90Y等；阿霉素，柔紅霉素等；還有細菌、植物和其它毒素；酪氨酸激酶抑制劑；ly207702；含抗腫瘤成分的脂質體；其他抗體或抗體的部分(Fab)。
提供操作方法的試劑盒。這樣的試劑盒由一個或多個有效劑量的融合蛋白和使用這些融合蛋白的作用說明組成。融合蛋白是由Flt3配體和有腫瘤殺傷作用的肽或蛋白組成。具體來說這個試劑盒還要包含以上所說的有效的抗腫瘤制劑。最好的藥用形式是溶在無菌生理鹽水，葡萄糖，其它平衡液，或其它能發揮藥效的無菌液體中。另外還可以凍干或干燥。在這種情況下這一試劑盒還應說明不影響藥效的溶劑最好是無菌的生理鹽水和葡萄糖液。還有一些試劑盒最好還有無菌包裝針頭和注射器。還可以含有指導醫生或患者操作說明。
如本文所用，所謂的治療有效劑量或有效組成是指單獨使用融合蛋白或與其他治療聯合應用能有效的預防或緩解腫瘤生長、或腫瘤相關疾病。治療的有效劑量是指復合體能有效緩解癥狀的劑量。比如治療，治愈，預防，或緩解的相關醫療條件或提高治療，治愈，預防，或緩解的醫療條件。當針對個體僅使用有活性的成分時，治療的有效劑量僅指有效成分。當使用復合物時，治療的有效劑量是指活性成分的組合量，無論是聯合使用，續貫使用或同時應用。
C、含Flt3配體的融合蛋白及殺腫瘤制劑的用法本發明還包括給需要治療或合乎要求的動物服用有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白。適用的細胞包括哺乳動物細胞。特殊情況下是哺乳類腫瘤細胞。具體說也可以是哺乳動物體內細胞。
Caspase活化途徑在細胞的凋亡中起著重要的作用，(budihardjo等，ann。Reev。cell dev。Biol。15269-90)，caspase家族是具有很高的特異性的半胱氨酸蛋白酶家族，其裂解必須識別4個天門氡氨酸在靠近裂解的N-末端(Grutter，Curr.Op.Struct.Biol.10649-55(2000).)。caspase3又稱作CPP32，YAMA和apopain，其特異性的裂解位點WEHD。它是個下游的或者是執行者caspase，可裂解多種底物如lamins，PARP，DFF等。caspase3以未激活的酶原存在于胞內，被上游的caspase9和Apaf-1裂解后活化，而caspase9和Apaf-1的活化則依賴于細胞外凋亡信號的刺激，如Fas-L，TNF和TRAIL。Caspase活化途徑可被多種實驗方法所證實，具體的一些方法見APOPTOSISAPRACTICAL APPROACH(Studzinski，ed.1999).
caspase3是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，其在細胞凋亡或程序性細胞死亡中發揮重要的作用。(Grütter，Curr.Opin.Structural Biol.10649-55(2000))，它以酶原的形式存在于細胞內，其典型的激活方式是由啟動者caspase如caspase8，9，10通過蛋白水解被激活。活化后的caspase3接著裂解其他的底物蛋白，包括參與DNA修復的蛋白，細胞骨架及核骨架蛋白，這些蛋白在天門氡氨酸后都含有其識別序列DEVD。caspase3活化狀態的檢測可參考下列文章美國專利6,342,611；6,391,575；6,335,429；和美國專利申請No.20030186214。因此，任何檢測caspase 3活性的合適方法都可用于本發明。
這里我們提供了一種用嵌和蛋白治療腫瘤的方法。即用含有FLt3-L，或其活性片段，和蛋白或多肽的腫瘤殺傷分子組成融合蛋白，用于治療哺乳動物腫瘤，該方法還闡述了其必要性及有效劑量。見SUPRA的第二部分，其具體應用是腫瘤為黑色素瘤，乳腺癌及肝細胞癌時。
另一方面，該方法可產生腫瘤特異性的淋巴細胞。即通過給予有效劑量的上述融合蛋白(用含有FLt3-L，或其活性片段和蛋白或多肽的腫瘤殺傷分子組成融合蛋白)是哺乳動物產生腫瘤特異性的淋巴細胞。
通過給予有效劑量的上述融合蛋白和抗腫瘤分子來治療需要該處理的哺乳動物。
任何哺乳動物都適用該治療方法，尤其是人。只要該對象患有腫瘤，需要接受該種治療。
該方法可用于患有腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤的對象。腫瘤組織的來源可以是腎上腺、膽囊、骨、骨髓、腦、乳腺、膽管、胃腸道，心臟、腎臟、肝臟、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、陰莖、前列腺、皮膚、唾液腺、脾臟、睪丸、胸腺、甲狀腺和子宮。除了上述的腫瘤外，還可用于中樞神經系統的腫瘤如膠質細胞多樣性瘤、星細胞溜、少樹突狀膠質瘤、室管膜和脈絡膜叢腫瘤、松果體腫瘤、神經元腫瘤、成神經管腫瘤、雪旺氏細胞瘤、腦脊膜瘤、腦脊膜肉瘤；此外眼部的腫瘤如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤，橫紋肌肉瘤、成視網膜細胞瘤；還有內分泌腺腫瘤如垂體瘤、甲狀腺榴、腎上腺皮質腫瘤，神經內分泌系統腫瘤、胃腸道胰腺內分泌系統腫瘤，生殖系統腫瘤；頭和頸部腫瘤頭頸腫瘤、口腔腫瘤、咽部腫瘤、喉部腫瘤、牙源性腫瘤；胸部腫瘤大細胞性肺癌，小細胞性肺癌、非小細胞性肺癌、胸腔腫瘤、惡性間皮瘤、胸腺榴、胸部原始胚胎細胞瘤；消化道部位的腫瘤食道瘤、胃部腫瘤、肝臟腫瘤、膽道腫瘤、胰腺腫瘤、結直腸腺癌、肛門腫瘤；泌尿生殖道腫瘤腎細胞癌、腎輸尿管腫瘤、膀胱腫瘤、尿道腫瘤、前列腺腫瘤、陰莖腫瘤、睪丸腫瘤；女性生殖器腫瘤陰道腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮體腺瘤、卵巢癌、婦科肉瘤、乳腺腫瘤；皮膚腫瘤基地細胞癌、鱗狀細胞癌、成纖維肉瘤、MERKEL細胞瘤、惡性黑色素瘤；骨及軟組織腫瘤骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、chrondrosarcoma、ewing氏肉瘤、神經外胚層腫瘤、血管肉瘤；造血系統腫瘤脊髓發育不良綜合癥、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴系白血病、HTLV-1、T細胞白血病/淋巴瘤、慢淋巴系白血病、毛細胞白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、巨細胞白血病；兒童腫瘤急性淋巴漿細胞樣白血病，急性髓細胞性白血病、成神經細胞瘤、骨腫瘤、橫紋肌肉瘤、淋巴瘤、腎臟及肝臟腫瘤。
在這里，我們說的“抑制或治療”作用包括伴隨腫瘤生長相關癥狀發展的延遲或/和這些癥狀嚴重程度的降低，它還進一步的包括已存在的腫瘤生長伴隨癥狀的減輕，并防止其他癥狀的出現，還可減少或防止轉移。因此，抑制或治療”作用指的對那些有惡性或具有發展為這些疾病或癥狀的哺乳動物有利的作用。
在實施這種治療方法時，這種蛋白的有效劑量是根據個人情況決定的。如本發明提供的方法，這種融合蛋白可單獨應用或聯合使用其它方法例如用其它免疫分子(細胞因子)，化療藥和抗腫瘤藥等。當于其它藥物聯用時，這種蛋白可以與其它藥物同時注射或隨后注射。如果隨后注射，由實施醫生決定它們先后的次序。這種治療成分的有效性和毒性是由基本的藥理動力學或實驗動物來決定的，例如它們的半數致死量和半數有效量，這可以用LD50與ED50的比率來表示。融合蛋白表現好的療效是所需要的。從細胞培養和動物研究所得到的數據可以用作人使用時的參考。劑量的改變根據注射的途徑和使用形式來決定。醫生根據患者的情況選擇注射途徑、藥物形式和精確的劑量。根據個人的有效藥物在血漿中水平決定藥物的劑量和間隔時間，從而達到理想的療效或最低的有效濃度。每種成分可以根據有效濃度而改變，也可以根據體外的數據而改變。
采用合適的注射途徑。劑量形式包括片劑、藥片、散劑、膠囊等，例如見雷明頓藥理學。
根據每個患者的年齡、體重和反應，醫生常規要決定這里給予的抗體劑量。
迅速形成蛋白和注射的方法技術可以參見REMINGTON’S PHAR-MACEUTICALScience。在這里提到的融合蛋白的形式和注射方法與抗體相似。合適的途徑有口服、皮下、以及直接動脈注射、靜脈注射或眼內注射等。觀察這類蛋白的藥理以及其實施這種方法可以按照傳統方法來研究。
另外，人可以根據情況在局部注射這種蛋白而不是全身注射，比如將抗體直接注入腫瘤。而且，人可以用靶向藥物輸送系統注射蛋白，例如用脂質體包裹組織特異性抗體靶向輸入腫瘤。
當通過靜脈，皮內或皮下注射有效量的蛋白時，它是無熱源的腸胃外可接受的水溶液。按照它的PH，穩定性等制備相應的蛋白。靜脈，皮內和皮下注射的藥物成分除了我們介紹的蛋白還有等滲液例如氯化鈉等。對于肌肉內注射，滲透劑如何滲入是一障礙。
對于吸入法來說，融合蛋白常規是用合適的推進力以氣霧劑形式吸入。就壓縮的氣霧劑來說，吸入的劑量是由提供送入量的閥門來決定。注射形式可以是單個劑量或多個劑量，也可以是溶液或栓劑。
不經腸的藥物形式包括有活性的水溶液。另外，活性成分中的懸浮物可以以油劑懸浮物來制備。親脂性溶液包括脂肪比如芝麻油，或合成的脂肪酸酯比如脂質體。水的注射懸浮成分包含能夠增加可見度的物質。隨意地，懸浮劑可以是能夠增加高濃度的液體水溶性和穩定性的物質。可以替代的是活性成分可以是粉末形式，例如無菌無熱源的水。
在藥的成分中嵌合抗體的使用量依賴患者的條件和患者已經使用過的處理條件來決定的。最后，實施醫生決定用不同的蛋白量治療不同的患者。起初，醫生用低劑量的蛋白來觀察患者的反應情況，然后劑量逐漸增加直到達到用最合適的劑量取得最合適的治療效果。然后劑量不再增加。不同的藥物成分應該在0.01ug和1mg/kg之間使用。當使用時這些成分是無熱源的，物理形式可以接受的。有療效的物質除了融合蛋白還有其它成分，它們可以選擇性的或另外的和蛋白同時或系統的注射。可仿效的代理藥包含抗腫瘤藥。
本文所述的融合蛋白可單獨使用，也可與其它治療方法聯合使用。例如，在融合蛋白所結合的腫瘤局部進行放射治療。放射治療的劑量應足以殺滅增殖期的腫瘤細胞。理想的情況是，聯合治療的效果須高于放射治療或融合蛋白的單一治療效果。典型的放射治療方法包括beta-射線、X-射線、alpha-粒子等。對腫瘤照射的放射源可以為外照射，也可為利用放射性核素產生內照射。實施內照射的方法可以是業內所熟悉的方法。腫瘤放射治療的方法可參見V.T DaVita Jr.等所編《CancerPrinciples &Practice of Oncology 248》1993年第4版中S.Hellman所著“Principles of RadiationTherapy”章節。放射治療的典型劑量為1至500cGy(例如，由1至500rads)。
可將含有Flt3-L或其有效成分，以及抗腫瘤蛋白/多肽的融合蛋白，與免疫增強劑作為疫苗使用。
另一方面，本文列出了利用含有Flt3-L或其有效成分，以及抗腫瘤蛋白/多肽的融合蛋白，與免疫增強劑作為疫苗使用，從而激活哺乳動物體內有效的抗腫瘤免疫的使用方法。
在此使用的“免疫增強劑”一詞系指可增強或延長針對某靶抗原，如腫瘤抗原的免疫反應的物質。這種免疫增強作用可為疊加的或協同的。在此使用的“免疫反應”一詞的涵義包括B細胞介導的免疫反應、T細胞介導的免疫反應、以及T、B細胞均參與的免疫反應。免疫反應增強劑的實例如細胞因子，如IL-12、IL-2、IFN-γ、免疫佐劑、免疫刺激多肽，等等。本發明所述的組合物和方法中，免疫增強劑與融合蛋白可同時使用或先后使用，可使用相同的給藥途徑或不同的給藥途徑。
可以用傳統的方法來制備疫苗。例如，用合適的液體如鹽水、完全或不完全佐劑來稀釋免疫原。此外，免疫原分子也可以與或不與載體分子連接制備蛋白質抗原。這樣的載體分子并不局限于小牛血清白蛋白、KLH、破傷風毒素等等。免疫原也可以與脂蛋白或脂質體、佐劑一起注射。免疫原可以以任何適合抗體產生的途徑如靜脈、皮下、皮內、肌肉注射等途徑免疫動物。免疫原可以一次或規律間歇給藥直到有顯著的抗腫瘤T細胞反應或抗腫瘤細胞抗體產生。抗腫瘤細胞反應出現的評價可以通過在免疫前后檢測抗腫瘤抗原細胞毒性T淋巴細胞的前體細胞的出現比率來實現。抗體的檢測可以如文獻報道用免疫檢測的方法從血清測得。
當前傳統注射疫苗是為了預防和治療的目的。當以預防為目的時，融合蛋白在腫瘤任何癥狀或任何跡象出現前給予。給哺乳動物特別是人類預防性的注射融合蛋白是為了預防或減輕惡性癥狀。當以治療為目的時，融合蛋白在疾病開始(或剛開始)、或任何癥狀出現前給藥，其目的是為了減輕疾病。
局部給藥至病變受累的部位可以用文獻報道的方法，但并不局限于此，如，局部注射，植入多孔滲水裝置，里面包括細胞表達的融合分子、融合蛋白或免疫增效劑。
疫苗的評價可以首先在動物模型中進行，從嚙齒類動物開始，然后到非人類的靈掌類動物，最后到人。免疫程序的安全性是通過觀察免疫動物的一般健康狀況(體重、體溫、胃腸功能的變化等等)和尸檢的病理變化來決定的。動物實驗之后，可以在腫瘤患者身上檢測。傳統的方法可以通過評價患者的免疫反應來決定疫苗的效能。例如，從體內分離到T淋巴細胞、外周血淋巴細胞、淋巴結、或腫瘤侵潤淋巴細胞。這樣的淋巴細胞能夠從治療的患者或志愿者身上用文獻報道的方法分離到并做體外培養。其活性用臺盼藍染色檢測。評價參數用來確定T淋巴細胞的效能、治療后動物體內產生免疫細胞的情況和腫瘤的發展。可以用傳統的方法來評估這些參數，包括細胞毒性實驗、混合淋巴細胞反應、細胞因子的產生實驗。
任何合適的腫瘤模型何以用來作為融合蛋白的測試模型。鼠類可以接受腫瘤而成為合適的品系。腫瘤可以是同種的或同種異型的或異體的。受者可以是一個或多個免疫相關功能具有活性或缺失，包括但并不限于nu/nu，scid，以及beige小鼠。例如受者是Balb/c或C57BL/6小鼠。任何合適的腫瘤都可用于動物模型實驗，包括已建系的細胞，腫瘤活體組織中分得的細胞，短期多克隆腫瘤細胞。腫瘤細胞系包括Renca，B16黑色素瘤細胞，Hepal，BT-474，Raji，QYC，D2F2，4T1，A20。融合蛋白的劑量為1μg/小鼠～1mg/小鼠，至少給藥一次。抗體可以通過任何合適的方法給予。一個具體的例子，給予抗體100μg/mouse/小鼠一周兩次。一個特殊的例子，第0天時皮下種植腫瘤，在特定的時間里用游標卡尺測定腫瘤的體積。任何合適的對照蛋白均可使用。例如，對照蛋白是純化了的IgG1同型對照抗體。
下述的實施舉例是為了更好的說明這項發明的使用范圍廣泛，而并非限制這項發明的使用。
實施例1FL膜外區片段編碼DNA的合成FL是一個I型跨膜蛋白，其N端為膜外區，這樣的蛋白分子對其N端進行修飾有時會嚴重影響生物學活性，Morrison(Coloma MJ，Morrison S.Design and production of noveltetravalent bispecific antibodies.Nat Biotech，1997，15159-163)將一單鏈抗體分子置于另一完整抗體分子重鏈恒定區的C端，成功構建的雙特異性四價抗體分子(如圖1A所示)給提供了新的思路。為了保證獲得高活性的雙功能蛋白，考慮構建FL膜外區(Flex)在N端而抗體分子在C端的融合蛋白，將Flex基因的3′-端與人抗體恒定區(鉸鏈區+CH2+CH3)基因的5′-相連，構建成Flex/Fc融合基因，然后再將SM5-1單鏈抗體接在Flex/Fc的C端，構建成雙功能融合蛋白(Flex/Fc/Fv，請參見圖1B)。
人FLT3配體基因cDNA序列是已知的(參見GenBank數據庫http//www.ncbi.nkn.nih.gov/entrez/中登錄號U03858的序列)，其中84-161為信號肽編碼區，162-629為膜外區片段編碼區，兩者相加共546堿基。
按照Prodromou C，Pearl LH.(Recursive PCRa novel technique for total genesynthesis.Protein Eng.1992 Dec；5(8)827-829.)的方法進行全基因合成。委托上海生工生物工程公司進行基因全合成以及PAGE純化。
對于回收的DNA，將其連接到pGEM-T載體(Promega公司產品)的多克隆位點，測序驗證后確認獲得了正確的克隆(圖2，SEQ ID NOS1和2)。本例中的正確克隆記作pGEM-T/hFlex。
實施例2人抗體IgG1恒定區(Fc)編碼序列的克隆與鑒定全長人IgG1 cDNA序列(5’→3’)的獲得和克隆天然全長IgG1編碼區含有1416bp，編碼471個氨基酸以及終止密碼子(參見Genbank登錄號BC024289)。
通過反轉錄獲得IgG1 cDNA序列，并克隆到載體pGEM-T上。具體操作過程為100毫升人外周血，用淋巴細胞分離液(Sigma產品)分離獲得白細胞，用Qiagen的mRNA抽提純化試劑盒抽提mRNA，在1.2％瓊脂糖凝膠電泳上鑒定其完整性后用GIBCO公司的RT-PCR試劑盒進行反轉錄和PCR擴增人IgG1 Fc片段，獲得了所需的cDNA，電泳鑒定后克隆到pGEM-T載體上，記作pGEM-T/IgFc，測序驗證無誤后保存備用。
實施例3嵌合和人源化SM5-1抗體的構建1.SM5-1單抗的可變區基因與序列測定用Trizol試劑[Gibco公司產品]提取雜交瘤細胞SM5-1總RNA，然后按5’-RACE試劑盒[Gibco公司產品]說明書分別擴增抗體重鏈和輕鏈可變區基因。首輪PCR和巢式PCR反應均采用熱啟動，反應條件94 C 5分鐘；94 C 45秒，60 C45秒，72 C 1分10秒，30個循環；72 C 7分鐘。以上2次PCR產物分別經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，首輪PCR擴增產物均無明顯的特異性條帶，巢式PCR擴增顯示重鏈產物中有一條約590bp的特異帶，輕鏈產物中有一條約530bp的特異帶(參見圖5)。將得到的PCR產物克隆到pGEM-T[Promega公司產品]載體，篩選陽性克隆進行測序，確定獲得了正確的SM5-1重鏈可變區(圖6 SEQ ID NO7)和輕鏈可變區基因(圖7 SEQ ID NO9)。并根據上述的基因序列推斷出其蛋白質序列(參見圖6 SEQ ID NO8和圖7 SEQ ID NO10)。為了克隆方便，采用PCR在抗體重鏈可變區基因的5’-端設計EcoRV和XbaI，3’-端加上NheI位點，在輕鏈可變區基因5’-端設計HindIII位點。將以上可變區基因分別克隆到pGEM-T載體，經測序驗證無誤。
2.SM5-1嵌合抗體表達載體的構建經測序鑒定后用EcoR V和Nhe I將SM5-1的重鏈可變區基因VH從pGEM-T-VH切下并克隆到經同樣酶切的pAH4604[Coloma MJ，Hastings A，Wims LA，Morrison SL.Novelvectors for the expression of antibody molecules using variable regionsgenerated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods，1992，15289]載體中，構成了嵌合抗體重鏈基因的完整表達框架pAH4604-VH，圖8顯示了SM5-1嵌合抗體(chSM)重鏈的核苷酸(SEQ ID NO11)和氨基酸(SEQ ID NO12)序列.用XbaI和BamHI酶解pAH4604-VH，分離純化其中約3200bp的嵌合重鏈條帶(VHCH)并克隆到pDR中，得到嵌合抗體重鏈表達載體pDR-VHCH(圖10)。
由于輕鏈載體pAG4622[Coloma MJ，Hastings A，Wims LA，Morrison SL.Novelvectors for the expression of antibody molecules using variable regionsgenerated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods，1992，15289]上的κ鏈基因中有大段內含子，不便于以后的載體構建，采用Overlapping PCR將SM5-1的人源化輕鏈可變區與人抗體輕鏈恒定區cDNA直接拼接起來，Overlapping PCR反應條件為94 C 5分鐘；94 C 55秒，55 C 55秒，72 C 1分30秒，30個循環；72 C 7分鐘，最后得到產物VLCL，其5’含有限制酶位點HindIII，3’端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體中，得pGEM-T-VLCL，篩選陽性克隆測序。圖9顯示了SM5-1嵌合抗體(chSM)輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO13)和氨基酸(SEQ ID NO14)序列.最后用Hind III和EcoR I雙酶消化，將VLCL從pGEM-T-VLCL載體上切下，克隆到同樣酶解的pDR中，得pDR-VLCL(圖11)，經酶切確定構建的表達載體。
3嵌合抗體的表達及純化于3.5cm組織培養皿中接種3.5×105/孔的CHO-dhfr-細胞，細胞在含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培養基中培養至90-95％融合時進行轉染取質粒10μg(嵌合重鏈表達質粒4μg，嵌合輕鏈表達質粒6μg)和20μlLipofectamine2000 Reagent[Gibco公司產品]分別溶于500μl無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時后補加3ml含10％血清的DMEM完全培養基，置于CO2孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8×105/皿傳到10cm培養皿中，換不含H、T、G的選擇培養基，待克隆形成后用二氫葉酸還原酶抑制劑氨甲喋呤(MTX)進行加壓篩選，濃度從2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加壓，用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用Protein A親和柱分離純化嵌合抗體。
4人工合成SM5-1人源化抗體可變區基因首先根據上述鼠源SM5-1抗體的重鏈和輕鏈可變區氨基酸序列和人源化設計的原則，以KOL和REI(參見Morea V et al.，Immunotechnology 1997 Mar；3(1)71-81)作人源化設計的模板，設計人源化SM5-1抗體的氨基酸序列。為了克隆方便，在人源化抗體重鏈可變區基因的5’-端設計EcoRV和XbaI，3’-端加上NheI位點，在輕鏈可變區基因5’-端設計HindIII位點。首先將SM5-1的重鏈和輕鏈CDR區分別直接移植到人源模板KOL和REI上，構成人源化的可變區重鏈和輕鏈基因，用與構建嵌合抗體表達載體同樣的方法，獲得了SM5-1人源化抗體的重鏈和輕鏈表達載體。由于抗體FR區不僅參與CDR區的空間構成，有的直接參與抗原抗體的相互結合，所以簡單的CDR移植往往會破壞抗體與抗原的作用，使抗體的親和力大大下降甚至消失，這時只有將人源FR區中某些重要殘基回復突變成鼠源殘基才能恢復抗體的活性。將得到的人源化重、輕鏈表達載體用Lipofectamine 2000[Gibco公司產品]共轉染COS細胞，用流式細胞術測定抗體的抗原結合活性，結果發現直接的CDR移植抗體的活性幾乎完全喪失。為了獲得高親和力的人源化抗體，我們對可能影響抗體結合活性的重要FR殘基進行分析和回復突變用流式細胞術測定它們的抗原結合活性。經過篩選最終獲得與鼠源SM5-1單抗活性相當的人源化抗體huSM5-1，其重鏈(huSM5VH)可變區序列見圖12(SEQ ID NOS15 and 16)，輕鏈(huSM5VL)可變區序列見圖13(SEQ ID NOS17 and 18)其人源化重鏈全長序列見圖14(SEQ ID NOS19 and 20)。其人源化輕鏈全長基因序列與氨基酸序列見圖15(SEQ IDNOS21 and 22)。
4.人源化抗體的表達及純化于3.5cm組織培養皿中接種3.5×105/孔的CHO-dhfr-細胞，細胞在含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培養基中培養至90-95％融合時進行轉染取質粒10μg(重鏈表達質粒4μg，輕鏈表達質粒6μg)和20μl Lipofectamine2000Reagent[Gibco公司產品]分別溶于500μl無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時后補加3ml含10％血清的DMEM完全培養基，置于CO2孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8×105/皿傳到10cm培養皿中，換不含H、T、G的選擇培養基，待克隆形成后用二氫葉酸還原酶抑制劑氨甲喋呤(MTX)進行加壓篩選，濃度從2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加壓，用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用ProteinA親和柱分離純化人源化抗體。
5.人源化和嵌合抗人SM5-1抗體的親和力比較用Pharmacia公司的BIAcore，參照Karlsson等(Karlsson，R.，Michaelsson，A.，and Mattsson，L.(1991)Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigeninteractions with a new biosensor based analytical system.J.Immunol.Methods145，229-240)提供的方法測定兩者的親和力常數Kd(Kon/Koff)，發現人源化的抗體與嵌合抗體的親和力接近，分別為9.31×10-9M和3.78×10-9M。
上述結果說明，本次對抗SM5-1的人源化設計改造是成功的，基本沒有降低親和力，達到了治療用單抗的親和力的要求。
實施例4FL/SM雙功能融合蛋白基因(huSM/FL)的構建構建3種結構的融合蛋白基因用于以后的生物學功能研究。
A.構建雙功能融合蛋白基因huSMFv/Fc/FL按照上述融合基因的構建方法，通過OverlapPCR將Flex基因直接與huSM5-1抗體重鏈基因(SMH)的3′-端融合，得到PCR產物huSMFv/Fc/FL，其5′-含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。然后將測序正確的重鏈融合基因用HindIII和EcoRI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pDR載體中，構建成pDR(huSMFv/Fc/FL)表達載體。huSMFv/Fc/FL的氨基酸序列和基因序列分別列于SEQ ID NOS23和24(圖16)。
于3.5cm組織培養皿中接種3.5×105/孔的CHO-dhfr-細胞，細胞在含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培養基中培養至90-95％融合時進行轉染取質粒10μg(融合基因表達質粒pDR(huSMFv/Fc/FL)4μg，人源化抗體輕鏈huSM5表達質粒6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Gibco公司產品]分別溶于500μ1無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時后補加3ml含10％血清的DMEM完全培養基，置于CO2孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8×105/皿傳到10cm培養皿中，換不含H、T、G的選擇培養基，待克隆形成后用二氫葉酸還原酶抑制劑氨甲喋呤(MTX)進行加壓篩選，濃度從2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加壓，用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，用2％BSA-PBS于37℃封閉2小時，加入待測的培養上清和標準品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進行結合反應，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用5分鐘，最后用H2SO4終止反應，測OD450值。。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用Protein A親和柱分離純化融合蛋白。
B.構建帶接頭序列的雙功能融合蛋白基因(huSMFv/Fc/Link/FL)按照前述融合基因的構建方法，用Overlap PCR將huSM5-1重鏈基因的3′-端通過(Gly4Ser1)3接頭(Fig4，SEQ ID NO5和6)同FLex的5′-融合，得到PCR產物huSMFv/Fc/Link/FL，其5′-含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。然后將測序正確的重鏈融合基因用HindIII和EcoRI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pDR載體中，構建成pDR(huSMFv/Fc/Link/FL)表達載體。huSMFv/Fc/Link/FL的氨基酸序列和基因序列分別列于SEQ ID NOS25和26(圖17)此融合蛋白的表達及純化方法同huSMFv/Fc/FL融合蛋白所用方法相同。
C.構建雙功能融合蛋白基因(FL/Fc/huSMFv)分別以pGEM-T/hFLex載體及含人IgG1恒定區cDNA的載體pGEM-T/IgFc為模板用overlapping PCR得到hFLex基因和人Fc基因(含鉸鏈區、CH2、CH3)，再通過重疊PCR，將hFLex基因的3′-端與人Fc基因的5′-端融合，獲得了FL/Fc融合基因，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體中，記作pGEM-T(FL/Fc)，篩選陽性克隆測序，圖3顯示了FL/Fc的核苷酸(SEQ ID NO3)和氨基酸(SEQ ID NO4)序列.。
采用前述融合蛋白基因構建方法，將huSM5-1的重鏈可變區的3′-端通過(Gly4Ser)3接頭與其輕鏈可變區的5′-端融合，構成huSM5-1單鏈抗體基因(Fv)。
采用前述融合蛋白基因構建方法將hFLex/Fc的3′-端與SM5-1單鏈抗體Fv的5′-端融合，構建雙功能融合蛋白基因FL/Fc/huSMFv(圖18，SEQ ID NOS27和28.)，此融合基因的示意圖見圖19。
將融合基因克隆到pDR載體，構建成pDR(FL/Fc/huSMFv)表達載體。用脂質體法將表達載體轉染CHO細胞，用MTX進行加壓篩選，取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，用2％BSA-PBS于37℃封閉2小時，加入待測的培養上清，37℃孵育2小時，加入HRP-羊抗FL進行結合反應，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用5分鐘，最后用H2SO4終止反應，測OD450值。，將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用Protein A親和柱分離純化融合蛋白。
采用-與huSM/FL同樣的構建方法構建了SM5-1嵌合抗體與FL的上述三種融合蛋白。其中chSMVH/Fc/FL的序列見圖20(SEQ ID NOS29 and 30)，chSMVH/Fc/Link/FL的序列見圖21(SEQ ID NOS31 and 32)，FL/Fc/chSMFv的序列見圖22(SEQ ID NOS33 and34)實施例5抗人CD20單抗和FL雙功能融合蛋白基因的構建
1.抗人CD20嵌合抗體的構建與表達參照美國專利6,399,061提供的抗人CD20單抗資料及序列，用實施例1描述的方法合成抗人CD20的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)cDNA。圖23顯示了238單抗的重鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO35)和氨基酸(SEQ ID NO36)序列.圖24顯示了2B8單抗的輕鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO37)和氨基酸(SEQ ID NO38)序列.在抗體重鏈可變區基因的5’端設計EcoRV，3’端加上NheI位點，在輕鏈可變區基因5’端設計HindIII位點。經測序鑒定后用EcoR V和Nhe I將CD20單抗的重鏈可變區基因VH從pGEM-T-VH切下并克隆到經同樣酶切的pAH4604載體中，構成了嵌合抗體重鏈基因的完整表達框架pAH4604-VH，用XbaI和BamHI酶解pAH4604-VH，分離純化其中約3200bp的嵌合重鏈條帶(VHCH)并克隆到pDR中，得到嵌合抗體重鏈表達載體pDR-VHCH。圖25顯示了CD20嵌合抗體重鏈的核苷酸(SEQ ID NO39)和氨基酸(SEQ ID NO40)序列。
采用Overlapping PCR將CD20單抗輕鏈可變區與人抗體輕鏈恒定區cDNA直接拼接起來，Overlapping PCR反應條件為94 C 5分鐘；94 C 55秒，55 C 55秒，72 C 1分30秒，30個循環；72 C 7分鐘，最后得到產物VLCL，其5’含有限制酶位點HindIII，3’端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體中，得pGEM-T-VLCL，篩選陽性克隆測序。最后用Hind III和EcoR I雙酶消化，將VLCL從pGEM-T-VLCL載體上切下，克隆到同樣酶解的pDR中，得pDR-VLCL，經酶切確定構建的表達載體。圖26顯示了CD20嵌合抗體輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO41)和氨基酸(SEQ ID NO42)序列。
于3.5cm組織培養皿中接種3.5×105/孔的CHO-dhfr-細胞，細胞在含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培養基中培養至90-95％融合時進行轉染取質粒10μg(嵌合重鏈表達質粒4μg，嵌合輕鏈表達質粒6μg)和20μlLipofectamine2000 Reagent[Gibco公司產品]分別溶于500μl無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時后補加3ml含10％血清的DMEM完全培養基，置于CO2孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8×105/皿傳到10cm培養皿中，換不含H、T、G的選擇培養基，待克隆形成后用二氫葉酸還原酶抑制劑氨甲喋呤(MTX)進行加壓篩選，濃度從2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加壓，用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用Protein A親和柱分離純化嵌合抗體。
2.構建3種結構的融合蛋白基因用于以后的生物學功能研究。
A.構建雙功能融合蛋白基因CD20Fv/Fc/FL按照上述融合基因的構建方法，通過Overlap PCR將Flex基因直接與CD20抗體重鏈基因的3′-端融合，得到PCR產物huSMFv/Fc/FL，其5′-含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。然后將測序正確的重鏈融合基因用HindIII和EcoRI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pDR載體中，構建成pDR(huSMFv/Fc/FL)表達載體。圖27顯示了CD20VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO43)和氨基酸(SEQ ID NO44)序列。
B.構建帶接頭序列的雙功能融合蛋白基因(CD20Fv/Fc/Link/FL)按照前述融合基因的構建方法，用Overlap PCR將CD20重鏈基因的3′-端通過(Gly4Ser1)3接頭同FLex的5′-融合，得到PCR產物CD20Fv/Fc/Link/FL，其5′-含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。然后將測序正確的重鏈融合基因用HindIII和EcoRI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pDR載體中，構建成pDR(CD20Fv/Fc/Link/FL)表達載體。圖28顯示了CD20VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO45)和氨基酸(SEQ ID NO46)序列。
C.構建雙功能融合蛋白基因(FL/Fc/CD20Fv)采用前述融合蛋白基因構建方法，將CD20單抗的重鏈可變區的3′-端通過(Gly4Ser)3接頭與其輕鏈可變區的5′-端融合，構成CD20單鏈抗體基因(Fv)。
采用前述融合蛋白基因構建方法將FL/Fc基因的3′-端與CD20單鏈抗體Fv的5′-端融合，構建雙功能融合蛋白基因FL/Fc/CD20Fv，圖29顯示了FL/Fc/CD20Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO47)和氨基酸(SEQ ID NO48)序列.此融合基因的示意圖見圖30。
以上三種融合蛋白的表達和純化方法與實施例4相同。
實施例6抗Her2人源化抗體與FL雙功能融合蛋白基因的構建1.抗人Her2人源化抗體的構建與表達參照實施例1的方法全合成抗her2人源化抗體(hcrceptin)[參見Carter P，Presta L，Gorman CM，Ridgway JBB，Henner D，Wong WLT，Rwoland AM，Kotts C，Carver ME andShepard HM.Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy.ProcNatl Acad Sci USA，1992，894285]的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因。圖31顯示了Her2人源化抗體重鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO49)和氨基酸(SEQ ID NO50)序列。圖32顯示了Her2人源化抗體輕鏈可變區核苷酸(SEQ ID NO51)和氨基酸(SEQ ID NO52)序列。在人源化抗體重鏈可變區基因的5′-端設計EcoRV，XbaI位點，3′-端加上NheI位點，在輕鏈可變區基因5′-端設計HindHI位點。瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產物，回收目的條帶并克隆到pGEM-T載體中，篩選陽性克隆測序。PCR采用Roche公司的高保真擴增系統，反應條件均為95℃ 5分鐘；94℃ 45秒，55℃ 45秒，72℃ 55秒，30個循環；72℃ 7分鐘。經測序鑒定后用EcoRV和NheI將人源化VH從pGEM-T/VH切下并克隆到經同樣酶切的pAH4604載體中，構成了人源化抗體重鏈基因的完整表達框架pAH4604-VH。
用XbaI和BamHI酶解pAH4604-VH，分離純化其中約3200bp的嵌合重鏈條帶(VHCH)并克隆到pDR中，得到人源化抗體重鏈表達載體pDR-VHCH。圖33顯示了Her2人源化抗體重鏈的核苷酸(SEQ ID NO53)和氨基酸(SEQ ID NO54)序列。
采用Overlapping PCR將her2人源化抗體輕鏈可變區與人抗體輕鏈恒定區cDNA直接拼接起來，Overlapping PCR反應條件為94C 5分鐘；94C 55秒，55C 55秒，72C 1分30秒，30個循環；72C 7分鐘，最后得到產物VLCL，其5’含有限制酶位點HindIII，3’端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到pGEM-T載體中，得pGEM-T-VLCL，篩選陽性克隆測序。最后用Hind III和EcoR I雙酶消化，將VLCL從pGEM-T-VLCL載體上切下，克隆到同樣酶解的pDR中，得pDR-VLCL，經酶切確定構建的表達載體。圖34顯示了Her2人源化抗體輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO55)和氨基酸(SEQ IDNO56)序列。
于3.5cm組織培養皿中接種3.5×105/孔的CHO-dhfr-細胞，細胞在含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培養基中培養至90-95％融合時進行轉染取質粒10μg(her2人源化抗體重鏈表達質粒4μg，her2人源化抗體輕鏈表達質粒6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Gibco公司產品]分別溶于500μl無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時后補加3ml含10％血清的DMEM完全培養基，置于CO2孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8×105/皿傳到10cm培養皿中，換不含H、T、G的選擇培養基，待克隆形成后用二氫葉酸還原酶抑制劑氨甲喋呤(MTX)進行加壓篩選，濃度從2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加壓，用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用Protein A親和柱分離純化人源化抗體。
2.構建3種結構的融合蛋白基因用于以后的生物學功能研究。
A.構建雙功能融合蛋白基因her2Fv/Fc/FL按照上述融合基因的構建方法，通過OverlapPCR將Flex基因直接與her2抗體重鏈基因的3′-端融合，得到PCR產物her2/Fc/FL，其5′-含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。然后將測序正確的重鏈融合基因用HindIII和EcoRI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pDR載體中，構建成pDR(her2/Fc/FL)表達載體。圖35顯示了her2VH/Fc/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO57)和氨基酸(SEQ ID NO58)序列。
B.構建帶接頭序列的雙功能融合蛋白基因(her2Fv/Fc/Link/FL)按照前述融合基因的構建方法，用Overlap PCR將her2重鏈基因的3′-端通過(Gly4Ser1)3接頭同FLex的5′-融合，得到PCR產物CD20Fv/Fc/Link/FL，其5′-含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產物并克隆到pGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。然后將測序正確的重鏈融合基因用HindIII和EcoRI雙酶消化從pGEMT載體中切下，克隆到pDR載體中，構建成pDR(her2Fv/Fc/Link/FL)表達載體。圖36顯示了her2VH/Fc/Link/FL融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO59)和氨基酸(SEQ ID NO60)序列。
C.構建雙功能融合蛋白基因(FL/Fc/her2Fv)采用前述融合蛋白基因構建方法，將her2單抗的重鏈可變區的3′-端通過(Gly4Ser)3接頭與其輕鏈可變區的5′-端融合，構成her2單鏈抗體基因(Fv)。
采用前述融合蛋白基因構建方法將FL/Fc基因的3′-端與her2單鏈抗體Fv的5′-端融合，構建雙功能融合蛋白基因FL/Fc/her2Fv，圖37顯示了FL/Fc/her2Fv融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列.圖38顯示了Her2與FL融合后的hFLex/Fc/Fv融合蛋白基因結構以上三種融合蛋白的表達和純化方法與實施例4相同。
實施例7TRAIL和Flt3L雙功能融合蛋白基因的構建1.構建hFLex/TRAILex融合TRAIL基因的合成人TRAIL的cDNA序列參見GenBan登錄號HSU37518，其中第88-933為TRAIL的編碼區。該基因編碼281個氨基酸的蛋白質，其中第95位氨基酸起至281位為細胞膜外區。
根據上述膜外區的編碼DNA序列，按照實施例1所述的方法合成該基因，測序驗證后的質粒(pGEM-T/hTRAIL)保存備用。
融合基因的合成按照實施例4構建融合蛋白基因的方法，以含有人TRAIL和Flt3L膜外區片段的pGEM-T載體(pGEM-T/hTRAIL和pGEM-T/hFLex)為模板，通過Overlap PCR將FLt3L膜外區(hFLex)的3’-端通過(Gly4Ser1)3接頭同TRAIL膜外區基因(TRAILex)的5’-融合。融合片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后純化目的片斷，膠回收純化回收后克隆到pGEM-T載體中，得pGEM-T(hFLex/TRAILex)，篩選陽性克隆測序，圖39顯示了hFLex/Trai lex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列，圖40顯示了hFLex/TRAILex融合蛋白基因結構表達載體的構建用HindIII和EcoRI雙酶消化，將hFLex/TRAILex從pGEM-T(hFLex/TRAILex)載體上切下，克隆到pDR載體中，得pDR(hFLex/TRAILex)，經酶切鑒定構建的表達載體。
于3.5cm組織培養皿中接種3.5×105/孔的CHO-dhfr-細胞，細胞在含次黃嘌呤(H)、胸腺嘧啶脫氧核苷(T)和甘氨酸(G)的DMEM完全培養基中培養至90-95％融合時進行轉染取表達載體質粒10μg和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Gibco公司產品]分別溶于500μl無血清DMEM培養基，室溫靜置5分鐘，將以上2種液體混合，室溫孵育20分鐘以使DNA-脂質體復合物形成，其間用3ml無血清的DMEM培養基替換培養皿中的含血清培養基，然后將形成的DNA-脂質體復合物加入到板中，CO2孵箱培養4小時后補加3ml含10％血清的DMEM完全培養基，置于CO2孵箱中繼續培養。轉染進行24小時后將細胞按0.8×105/皿傳到10cm培養皿中，換不含H、T、G的選擇培養基，待克隆形成后用二氫葉酸還原酶抑制劑氨甲喋呤(MTX)進行加壓篩選，濃度從2×10-8mol/L到5×10-7mol/L梯度加壓，用有限稀釋法進行亞克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗人Trail抗體包被于ELISA板，4℃過夜，用2％BSA-PBS于37℃封閉2小時，加入待測的抗性克隆培養上清，37℃孵育2小時，加HRP-羊抗人FL進行結合反應，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用5分鐘，最后用H2SO4終止反應，測OD450值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用抗人Trail的親和柱分離純化融合蛋白。
2.構建hFLex/IZ/TRAILex融合蛋白基因TRAIL為三聚體時其活性最強，我們設計在hFLex和TRAILex之間加上一個異亮氨酸拉鏈(IZ，isoleucine zipper)[Harbury PB，Zhang T，Kim PS，et al.A sitch between two，three，and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants。Science，1993，2621401-1407]，可使此融合蛋白形成三聚體。基因構建與蛋白表達純化參照1中所述的方法，只是將(Gly4Ser1)3替換成IZ的序列。圖41顯示了hFLex/IZ/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。
3.構建hFLex/Fc/TRAILex融合蛋白基因以含人Trail膜外區基因的質粒pGEM-T/hTRAIL為模板，PCR擴增獲得Trailex基因片斷，通過重疊PCR將Trailex基因的5′端與FL/Fc基因的3′端相融合，獲得hFLex/Fc/TRAILex融合基因，其5′含有限制酶位點HindIII，3′端含有限制酶位點EcoRI。經瓊脂糖凝膠電泳純化回收融合基因片斷并克隆到pGEM-T vector(Promega)中，得pGEMT-(hFLex/Fc/TRAILex)，篩選陽性克隆測序。圖42顯示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白的核苷酸(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ ID NO68)序列。圖43顯示了hFLex/Fc/Trailex融合蛋白基因結構。
從以下的實施例8-16，chSM/FL，huSM/FL，CD20/FL，her2/FL，Trail/FL分別表示FL/Fc/chSMFv，FL/Fc/huSMFv，FL/Fc/CD20Fv，FL/Fc/HER2Fv和hFLex/IZ/Trailex等融合蛋白。
實施例8雙功能分子SM/FL的生物學功能研究一.SM/FL對人臍血CD34+細胞的體外擴增作用為了測定SM/FL對骨髓CD34+祖細胞的體外促增殖活性，用細胞因子FL，SCF，G-CSF，GM-CSF，IL-3，CSF-1與FLT3配體(以下簡寫為FL)或chSM/FL，huSM/FL進行了試驗。實驗中使用的細胞培養基主成分為IMDM，含20％胎牛血清(GIBCO)，1％甲基纖維素，0.05mmolβ-巰基乙醇，300mg/ml谷氨酰胺，66mg/L青霉素，100mg/L鏈霉素以及待測細胞因子。
免疫磁珠(購自Pharmacia公司)法分離人臍血中的CD34+細胞，操作參照廠家說明書進行，流式細胞術分析其純度，將上述分離的CD34+細胞接種至含血清、甲基纖維素及待測細胞因子的96孔細胞培養板中，每孔2×103細胞。；上述細胞板置于37℃，5％CO2孵箱培養，2周后計數集落形成數。
檢測結果見圖44，結果說明，SM/FL具有明顯刺激骨髓CD34+祖細胞增殖的作用，SM/FL融合蛋白具有與FL相同的刺激作用。
二.SM/FL對NK、DC體內活性測定本試驗所用C57BL/6小鼠購自上海市實驗動物中心，FITC-anti CD3、PE-anti NK1.1及FITC-anti CD11c單克隆抗體購自美國R&D和SIGMA公司。試驗過程如下
C57BL/6小鼠給予SM/FL，每只動物每天10ug。受試動物接受SM/FL一定時間(0天，3天，6天，8天，10天，12天，15天，18天)后，處死小鼠，取其骨髓、脾臟及肝臟組織，分離這些組織中的單個核細胞。FITC-anti CD3及PE-antiNK1.1單克隆抗體對上述單個核細胞雙染，或者用FITC-antiCD11c單克隆抗體單染后用流式細胞儀進行分析檢測，根據各器官的單個核細胞數及標記為陽性的細胞百分比計算各群細胞的數目，檢測結果(×106/ml)見圖45。
上述結果表明，SM/FL雙功能分子和FL一樣，具有在小鼠體內誘導脾臟、肝臟和骨髓NK細胞和DC細胞增殖的作用，在10-13天達到高峰。這種誘導作用有助于提高機體對腫瘤的抵抗能力。
三.SM/FL雙功能融合蛋白體外對腫瘤生長抑制作用細胞系選用SMMU，Raji，Hepal-6/230，B16p230(由上海國際合作腫瘤研究所提供)。
主要試劑選用抗人SM5-1嵌合抗體/FL雙功能融合蛋白(chSM5/FL)、抗人SM5-1人源化單抗/FL雙功能融合蛋白(huSM/FL)、胎牛血清(GIBCO公司產品)、DMEM及RPMI-1640(GIBCO公司產品)、CellTiter96AQueous細胞增殖檢測試劑盒(Promega公司產品)、0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸二鈉(溶劑為1×PBS，過濾除菌)。
將對數生長期上述各種細胞用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，計數，調整細胞密度為6×104/ml，重懸于10％FCS 1640/DMEM培養液中備用。
按如下方法稀釋抗人SM5-1嵌合抗體/FL融合蛋白與抗人SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白抗人SM5-1嵌合性單抗/FL融合蛋白的母液濃度為20mg/ml水溶液。用10％FCS1640/DMEM 10倍逐級稀釋，直至濃度為16ug/ml，200ul/孔加入96孔板。然后用100ul10％FCS 1640/DMEM培養液作2倍比稀釋，共十四個濃度。
抗人SM5-1人源化抗體/FL融合蛋白母液濃度為20mg/ml水溶液。稀釋方法做2倍比稀釋，共十四個濃度。10％FCS 1640/DMEM作為空白對照。
將上述各種細胞分別加入含兩種抗體的96孔板中，100ul/孔。每種細胞一塊96孔板。
為防止多孔板的邊緣效應，不使用96孔細胞培養板邊緣的孔，但須加入200ul/孔的PBS。在37℃，7％CO2細胞培養箱培養7天后顯色讀數。
將96孔板從細胞培養箱取出。加入PMS∶MTS＝1∶20的顯色劑，20ul/孔。96孔板蓋打開后放入細胞培養箱繼續培養3小時。
酶標儀檢測96孔板OD490nm，用Excel軟件根據光吸收值數據作圖，結果見圖46。說明這兩種融合蛋白對B16p230，hepal-6p230，SMMU等三種三種表達p230f蛋白的腫瘤細胞系的增值均能產生有效抑制作用。而這種抑制作用是特異性的，對無關細胞沒有作用。
四.嵌合抗人SM5-1/FL及人源化SM5-1/FL體外抗腫瘤作用測活細胞株使用SKBR-3、QYC細胞系，以及Hepal-6、B16細胞系(購自ATCC)。上述細胞均傳代培養于25cm2培養瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培養基。并將這兩種細胞系分別轉入P230基因。使其高表達人p230基因。
主要試劑選用抗人CD3嵌合性單抗/FL融合蛋白(chCD3/FL)、抗人CD3人源化單抗/FL融合蛋白(huCD3/FL)、抗人SM5-1嵌合性單抗/FL融合蛋白(chSM/FL)、抗人SM5-1人源化單抗/FL(huSM/FL)融合蛋白、胎牛血清(GIBCO公司產品)、DMEM及RPMI-1640(GIBCO公司產品)、CellTiter96AQueous細胞增殖檢測試劑盒(Promega公司產品)、0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸二鈉(溶劑為1×PBS，過濾除菌)。
將對數生長期的Hepal-6、B16及hepal-6p230，B16p230細胞系，用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，計數，調整細胞密度為6×104/ml，重懸于10％FCS 1640/DMEM培養液中備用。
稀釋抗人CD3嵌合性單抗/FL及抗人CD3全人源化單抗/FL融合蛋白及抗人SM5-1嵌合性單抗/FL及抗人SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白。
抗人CD3嵌合性單抗/FL及抗人SM5-1嵌合性單抗/FL的母液濃度分別為20mg/ml水溶液。用10％FCS 1640/DMEM 10倍逐級稀釋，直至濃度為16ug/ml，200ul/孔加入96孔板。然后用10％FCS 1640/DMEM培養液作2倍比稀釋，共十四個濃度。
抗人CD3人源化抗體/FL及抗人SM5-1人源化單抗/FL母液濃度分別為20mg/ml水溶液。稀釋方法同上。200ul/孔加入96孔板，然后用100ul 10％FCS 1640/DMEM培養液作2倍比稀釋，共十四個濃度。
將上述各種細胞分別加入含兩種抗體的96孔板中，100ul/孔。每種細胞二塊96孔板。抗人CD3嵌合抗體/FL與抗人CD3人源化抗體/FL融合蛋白每種細胞一塊96孔板。抗人SM5-1嵌合抗體/FL與抗人SM5-1人源化抗體/FL融合蛋白每種細胞一種96孔板。
為防止多孔板的邊緣效應，不使用96孔細胞培養板邊緣的孔，但須加入200ul/孔的PBS。37℃，7％CO2細胞培養箱培養7天后顯色讀數。
將96孔板從細胞培養箱取出。加入PMS∶MTS＝1∶20的顯色劑，20ul/孔。96孔板蓋打開后放入細胞培養箱繼續培養3小時。
酶標儀檢測96孔板OD490nm，用Excel將吸光度值數據作圖，結果見圖47。結果說明，在離體條件下，嵌合SM/FL融合蛋白和人源化hSM/FL融合蛋白有明顯的抑制人P230轉染的Hepal-6和B16細胞的作用，對不表達p230分子的Hepal-6和B16細胞沒有抑制作用。無關抗體融合蛋白抗CD3/FL對以上4種細胞均無作用。
實施例9抗人HER-2單抗/FL，抗人CD20/FL及TRAIL/FL融合蛋白體外殺傷活性為了進一步研究FL與其他能夠誘導腫瘤細胞凋亡的抗體或其他分子構成的融合蛋白也具有上述體外殺傷腫瘤細胞的作用，進行了如下實驗。這些實驗的結果證明，如同SM5-1單抗與FL構成的融合蛋白一樣，具有誘導腫瘤發生細胞凋亡的抗人CD20單抗、抗人Her2單抗以及TRAIL與FL構成的融合蛋白分子也具有體外殺傷腫瘤細胞的活性。
抗Her2單抗/FL融合蛋白對靶細胞的生長抑制和殺傷活性的體外研究1.Her2/FL雙功能分子體外抑制實驗測活細胞株使用SK-BR-3，BT-474、D2F2、4T1細胞(上述細胞均來自ATCC)。其中BT-474，SK-BR-3在其細胞膜表面表達HER2抗原分子，D2F2、4T1、Jarket細胞不表達HER2抗原分子。
上述細胞均傳代培養于25cm2培養瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培養基。采用QIAGEN公司的SuperFect Transfection Reagent(Qiagen CAT.301307)脂質體試劑將D2F2及4T1兩種細胞系分別轉染人her2基因，并使其在細胞表面獲得高表達。轉入her2基因的細胞系D2F2/e2和4T1/her2用于本實驗。
主要試劑選用抗人Her2/FL雙功能分子、Herceptin(購自Genetech公司)、胎牛血清(GIBCO公司產品)、DMEM及RPMI-1640(GIBCO公司產品)、CellTiter96AQueous細胞增殖檢測試劑盒(Promega公司產品)、0.05％胰蛋白酶+0.02％乙二胺四乙酸二鈉(溶劑為1XPBS，過濾除菌)。
將對數生長期上述各種細胞用0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，計數，調整細胞密度為6×104/ml，重懸于10％FCS 1640/DMEM培養液中備用。
抗人Her2/FL雙功能分子和陽性對照Herceptin按如下方法稀釋抗人Her2/FL雙功能分子的母液濃度為20mg/ml水溶液。用10％FCS 1640/DMEM 10倍逐級稀釋，直至濃度為16ug/ml，200ul/孔加入96孔板。然后用10％FCS 1640/DMEM培養液進行2倍比稀釋，共十四個濃度。
Herceptin標準品母液濃度為20mg/ml水溶液。稀釋方法同上，依次作2倍比稀釋，共十四個濃度。
將上述各種細胞分別加入含融合蛋白和抗人Her2抗體(Herceptin)的96孔板中，100ul/孔。每種細胞一塊96孔板。
實驗步驟按照CellTiter96AQueous細胞增殖檢測試劑盒廠家說明書進行。
實驗結果如圖48。
從上述結果可以看出，抗人HER2單抗/FL融合蛋白對表達有人Her2的各種受試靶細胞均有明顯的生長抑制作用。該融合分子對無關細胞系沒有抑制作用，說明這種抑制作用是特異性的。
2.抗人HER-2/FL融合蛋白體外殺傷活性測活細胞株使用SK-BR-3，BT-474、D2F2、4T1細胞(上述細胞均來自ATCC)，轉入her2基因的細胞系D2F2/e2和4T1/her2。其中BT-474，SK-BR-3，D2F2/e2和4T1/her2在其細胞膜表面表達HER2抗原分子，D2F2、4T1、Jarket細胞不表達HER2抗原分子，試劑盒使用CytoTox 96非同位素細胞毒性實驗試劑盒(Promega公司產品)檢測細胞活力。步驟按照廠家說明進行。
取待檢測樣品抗Her2單抗/FL，用培養液逐步稀釋至濃度為4μg/mL。而后以之為起始濃度，用培養液二倍比稀釋至15.6ng/ml。
在96孔板中加入稀釋好的待測樣品，每孔體積100μl，每一濃度設2個復孔。培養液為陰性對照。
取對數生長期的細胞，調整細胞密度至6×104/ml，加入上述96孔培養板中，0.1ml/孔。
檢測結果如圖49所示。結果表明，Her-2抗體/FL融合蛋白對BT-474、SK-BR-3，D2F2/e2和4T1/her2細胞有特異性殺傷作用。
二.抗人CD20單抗/FL融合蛋白對靶細胞的體外殺傷活性原理人B細胞淋巴瘤細胞系Raji細胞表面高表達CD20抗原分子，抗CD20單抗可與其結合。則能使結合了抗體的靶細胞溶解，在一定范圍內抗體的濃度與細胞溶解的程度呈量-效關系。細胞溶解的程度可通過檢測細胞溶解后釋放的乳酸脫氫酶來檢測。
主要試劑選用抗人CD20/FL雙功能分子、抗CD20單抗rituximab.
細胞株Raji細胞(ATCC)，經檢測無支原體污染。用含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培養液傳代培養于25-75cm2方瓶中。
培養液A為含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/DMEM(1∶1)培養液。B為不含血清的無酚紅RPMI-1640培養液。C為含有5％正常人血清的培養液B。
檢測試劑盒CytoTox 96非同位素細胞毒性實驗試劑盒(Promega公司產品)取對數生長期的Raji細胞，加入培養液B調整細胞密度至2×105/ml，加入96孔培養板中，0.1ml/孔。
取待測樣品用培養液C逐步稀釋至4ug/mL，并以之為起始濃度二倍比稀釋至7.8ng/ml。
以培養液C為陰性對照，在已接種過Raji細胞的培養板中，加入上步梯度稀釋液0.1mL/孔和陰性對照的培養液。每個稀釋度設2個復孔。置于37℃5％二氧化碳培養箱中培養3-4小時。
檢測結果見圖50，結果可以看出，在離體培養條件下，抗人CD20單抗/FL融合蛋白與抗CD20單抗類似，對受試靶細胞有明顯的殺傷作用。
三.TRAIL/FL對靶細胞生長抑制和殺傷作用的體外研究TRAIL/FL體外測活實驗測活細胞株選用L929、MDA-MB-231(購自ATCC)，Renca(購自韓國腫瘤研究所)。hepG2為陰性對照細胞。
上述細胞均傳代培養于25cm2培養瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培養基。
試劑盒使用CellTiter 96 Aqueous非同位素細胞增殖實驗試劑盒(Promega公司產品，Catalog#G5430)檢測細胞活力。由MTS/PMS二種溶液組成，可反復凍融，保存于-70℃以下。使用前將二者按體積比20∶1混合。混合后的試劑可臨時保存于-20℃。
取對數生長期的L929、MDA-MB-231，Renca，hepG2細胞，胰蛋白酶消化，計數，每次測活(1塊96孔板)取約5×106個細胞，離心棄上清，加入培養液B調整細胞密度至5×105/ml，加入96孔培養板中，0.1ml/孔，培養過夜(18-24h)，每種細胞一塊96孔板。
取待測定樣品，用培養液稀釋至10ug/ml，并以之為起始濃度二倍比稀釋至19.5ng/ml。
以培養液為陰性對照，在已接種過細胞的培養板中，加入上步梯度稀釋液0.1mL/孔和陰性對照的培養液。每個稀釋度設2個復孔。
置于37℃5％二氧化碳孵箱中培養12h。
終點測定96孔板加入新鮮配制的20∶1混合的MTS/PMS溶液20μL/孔，在孵箱中繼續孵育2-4小時(96孔板不蓋蓋子)，用酶標儀測量其A490-A630值。
從圖51可以看出，TRAIL/FL融合蛋白對離體培養的各種靶細胞有明顯的生長抑制作用，但是對無關細胞沒有作用。
2.TRAIL/FL體外殺傷活性細胞株L929細胞，hepG2細胞用含10％新生小牛血清(NBS)的RPMI-1640/D′MEM(1∶1)培養液傳代培養于25-75cm2方瓶中；試劑盒使用CytoTox 96非同位素細胞毒性實驗試劑盒(Promega公司產品)取對數生長期的L929細胞，胰蛋白酶消化，計數，每次測活(1塊96孔板)取約2×106個細胞，離心棄上清，加入培養液B調整細胞密度至1.5×105/ml，加入96孔培養板中，0.1ml/孔，培養過夜(18-24h)。次日用培養液稀釋放線菌素D至終濃度為20μg/mL，取0.5mL作為陰性對照。
取待測定樣品，用含有放線菌素D的培養液稀釋至1600ng/ml，并以之為起始濃度二倍比稀釋至3.1ng/ml。
以培養液C為陰性對照，在已接種過L929細胞的培養板中，加入上步梯度稀釋液0.1mL/孔和陰性對照的培養液。每個稀釋度設2個復孔。置于37℃ 5％二氧化碳孵箱中培養14-16小時。
實驗步驟按照使用CytoTox 96非同位素細胞毒性實驗試劑盒廠家說明書進行。
實驗結果見圖52，表明TRAIL/FL對L929細胞有與Trail相似的殺傷活性。
實施例10SM/FL、hSM/FL融合蛋白對B16/p230及Hepal-6/p230荷瘤小鼠的治療作用主要試劑使用抗人SM5-1嵌合性單抗、抗人SM5-1全人源化單抗，抗人CD3嵌合性單抗/FL融合蛋白、抗人CD3全人源化單抗/FL融合蛋白，抗人SM5-1嵌合性單抗/FL及抗人SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白。
將雄性C57BL/6小鼠分別于接種后待腫瘤直徑平均達0.5cm，分組進行實驗。隨機分為7個大組。一組為PBS組，共8只小鼠。一組為無關抗體抗人CD3嵌合性單抗/FL融合蛋白。一組為抗人CD3人源化單抗/FL融合蛋白。一組為抗人SM5-1嵌合性單抗。一組為抗人SM5-1人源化單抗。一組為抗人SM5-1嵌合抗體/FL融合蛋白，一組為抗人SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白，以4mg/kg尾靜脈注射，每組十只小鼠。
將各種單克隆抗體均用PBS分別稀釋至終濃度0.4mg/ml，四種不同濃度。尾靜脈注射劑量按4mg/kg/周，對照組注射等體積PBS。根據小鼠體重，平均每只小鼠尾靜脈注射體積為250ul左右。
連續觀察6周，進行統計分析。結果見表3。
表3腫瘤治療后腫瘤消退情況

從上述實驗結果可以看出，在有p230抗原表達時，無論是嵌合的還是人源化的SM5-1單抗，也不論是否與FL融合，都具有明顯的使腫瘤消退的能力。而無關抗體沒有這種能力。但是，與FL融合能夠很大程度提高在活體內的抗腫瘤能力。
實施例11SM/FL和hSM/FL融合蛋白誘導B16/P230及Hepal-6/P230荷瘤小鼠產生特異性免疫反應主要試劑選用抗人SM5-1嵌合性單抗、抗人SM5-1全人源化單抗，抗人CD3嵌合性單抗/FL融合蛋白、抗人CD3全人源化單抗/FL融合蛋白，抗人SM5-1嵌合性單抗/FL及抗人SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白。
將雌性C57BL/6小鼠分別hepal-6/P230腫瘤細胞，于接種后待直徑平均達0.5cm。隨機分為7個大組。一組為PBS組，共8只小鼠。一組為無關抗體抗人SM5-1嵌合性單抗。一組為抗人SM5-1人源化單抗。一組為抗人SM5-1嵌合性單抗與FL合并使用。一組為抗人SM5-1人源化單抗與FL合并使用。一組為抗人SM5-1嵌合抗體/FL融合蛋白，一組為抗人SM5-1人源化單抗/FL融合蛋白，以2mg/kg尾靜脈注射，每組10只小鼠。
將各種單克隆抗體均用PBS分別稀釋至終濃度0.4mg/ml，四種不同濃度。尾靜脈注射劑量按4mg/kg/周，對照組注射等體積PBS。根據小鼠體重，平均每只小鼠尾靜脈注射體積為250ul左右。
連續觀察至腫瘤消失，對腫瘤消退的小鼠進行親代腫瘤細胞接種，觀察小鼠成瘤情況，結果如表4。
表4融合蛋白的抗腫瘤作用

上述數據說明，SM或hSM與FL聯合使用時，體內抗腫瘤能力有一定程度的提高。但是，融合蛋白SM/FL和hSM/FL提高的幅度更大，并可使小鼠腫瘤全部消失，再次接種后無瘤生存率高達100％。這說明，融合蛋白SM/FL和hSM/FL使小鼠獲得了抵抗腫瘤的主動免疫能力。
抗人SM5-1嵌合抗體/FL與抗人SM5-1人源化抗體/FL融合蛋白所產生的免疫反應是特異性的。取抗人SM5-1嵌合抗體/FL與抗人SM5-1人源化抗體/FL融合蛋白治療B16p230荷瘤小鼠和Hepal-6p230荷瘤小鼠，待腫瘤消失后，分別再次接種B16、Hepal-6、B16p230或Hepal-6p230腫瘤細胞，實驗結果見表5。抗人SM5-1嵌合抗體/FL與抗人SM5-1人源化抗體/FL融合蛋白治療的B16p230小鼠僅能抵抗B16腫瘤細胞的復發，而對Hepal-6無抵抗作用，反之亦然。
表5融合蛋白誘導B16/P230及Hepal-6/P230荷瘤小鼠產生特異性免疫反應

上述結果表明，用chSM和huSM與FL構成的融合蛋白治療的B16p230小鼠獲得了明顯的抵抗再接種的B16腫瘤細胞形成腫瘤的能力，但對無關的Hepal-6腫瘤細胞顯然沒有這種作用。反之亦然。這進一步說明，兩種融合蛋白誘發的免疫反應是特異性的。
實施例12抗人HER-2/FL，抗人CD20/FL及TRAIL/FL融合蛋白的體內抗腫瘤作用為了進一步研究FL與其他能夠誘導腫瘤細胞凋亡的抗體或其他分子構成的融合蛋白也具有體內殺傷腫瘤細胞的作用，進行了如下實驗。這些實驗的結果證明，如同SM或hSM與FL構成的融合蛋白一樣，具有誘導腫瘤發生細胞凋亡的抗人CD20單抗、抗人Her2單抗和TRAIL與FL構成的融合蛋白分子也具有體內殺傷腫瘤細胞的活性。
一.抗HER-2/FL融合蛋白體內殺傷活性材料人乳腺癌細胞系BT-474，雄性BALB/c裸鼠(購自上海市實驗動物中心)。
BT-474細胞以2.5×107/ml懸于PBS中，200ul/只接種腋部皮下，即5×106/只；裸鼠于接種后七周腫瘤直徑平均達0.5cm時，隨機分為實驗組及對照組，分別靜脈注射10mg/kg/周的抗HER-2融合蛋白及等體積的PBS。連續觀察6周，對調查所得數據進行統計分析。
檢測結果見圖53。對兩組數據進行差異顯著性檢驗，t＝2.64944，結果表明，在0.05水平p＝0.03806，差異達顯著水平，說明抗人HER2單抗/FL融合蛋白具有明顯的體內細胞的能力。
二.抗人CD20/FL融合蛋白體內殺傷活性細胞系為人淋巴溜細胞系Raji；雌性BALB/c裸鼠購自上海市實驗動物中心。
Balb/c裸鼠準備BALB/c裸鼠60Co照射2GY每周一次，連續3周。Raji細胞調整密度為4×107/ml，接種0.5ml于裸鼠的腋下或背部皮下，即接種細胞總數為2×107。腫瘤生長至0.5cm大小時，無菌取瘤組織，切取8mm3組織塊，復種60Co照射的裸鼠。裸鼠于接種后一周直徑平均達0.5cm時，隨機分為實驗組及對照組，分別靜脈注射10mg/kg/周的抗CD20/FL融合蛋白及PBS，連續給藥4周。觀察結果6周并進行統計分析。
檢測結果見圖54。對兩組數據進行差異顯著性測驗，t＝2.82287，在0.05水平p＝0.03024，差異達顯著水平。這說明，抗人CD20單抗/FL融合蛋白具有明顯的活體內抑瘤作用。
三.TRAIL/FL體內殺傷活性實驗材料選用人肝癌細胞系QYC；BALB/c裸鼠。
QYC細胞以5×107/ml懸于PBS中，200ul/只接種腋部皮下，即1×107/只；裸鼠于接種后10天直徑平均達0.5cm。隨機分為實驗組及對照組，分別腹腔注射0.5mg/只/天的TRAIL及等體積的PBS。連續觀察6周，進行統計分析。
結果如圖55所示，顯著性測驗表明，兩組數據的t＝2.63092，在0.05水平的p＝0.03901，差異達顯著水平。這說明，在活體內，TRAIL/FL融合蛋白具有明顯的抑瘤作用。
實施例13HER-2/FL，CD20/FL及TRAIL/FL融合蛋白誘導的特異性抗腫瘤免疫反應為了進一步研究抗人HER-2/FL，抗人CD20/FL及TRAIL/FL雙功能融合蛋白是否象嵌合和人源化的SM單抗與FL的融合蛋白一樣在體內具有對腫瘤的特異性殺傷作用，并具有誘導體內特異性抗腫瘤主動免疫反應，用上述三種融合蛋白對荷瘤小鼠進行了體內治療實驗。
一.抗人Her2單抗/FL融合蛋白的體內抗腫瘤實驗實驗材料雌性BALB/C小鼠；D2F2，D2F2/e2，4T1，4T1/her2腫瘤細胞株。
用2×106野生型D2F2，4T1和D2F2/e2，4T1/her2細胞分別接種BALB/C小鼠，皮下注射，每周測量腫瘤生長情況，當腫瘤生長至直徑0.5厘米時進行治療，劑量為4mg/kg，連續進行3周后，觀察腫瘤的生長情況。取腫瘤消失的小鼠分別再次接種B16、Hepal-6、B16p230或Hepal-6p230腫瘤細胞，6周后對腫瘤生長、消失情況進行調查。實驗結果見表6。
表6Her2/FL融合蛋白的抗腫瘤作用

從上述結果可以看出，Her2抗體一樣，抗人Her2抗體/FL融合蛋白在體內抑制D2F2/e2和4T1/her2細胞生長，抵抗已形成的腫瘤，誘導產生抗腫瘤免疫。對第二次接種的腫瘤有強大的殺傷作用，使其不能形成腫瘤。而單純給予Her2抗體，僅僅能夠治療已形成的腫瘤，但是不能有效抵抗再次的腫瘤接種。
二.抗人CD20單抗/FL融合蛋白的體內抗腫瘤實驗試驗材料采用A20細胞(ATCC)和BALB/C小鼠。A20細胞用Qiagen的轉染試劑盒轉入人CD20基因，并使人CD20抗原在細胞表面獲得高表達，制備成A20/CD20細胞用于以后的實驗。
用2×106A20/CD20細胞接種BALB/C小鼠，皮下注射，每周測量腫瘤生長情況，當腫瘤生長至直徑0.5厘米時，用FL、抗人CD20單抗、FL+抗人CD20單抗(rituximab)聯用、CD20/FL融合蛋白進行治療，劑量為4mg/kg，連續進行3周后，觀察腫瘤的生長情況。取腫瘤消失的小鼠分別再次接種A20/CD20腫瘤細胞，對腫瘤生長、消失情況進行調查。實驗結果見表6。
6周后對腫瘤生長、消失情況進行調查。
實驗結果見表7。
表7CD20/FL融合蛋白的抗腫瘤作用

從上述結果可以看出，和抗人CD20抗體一樣，抗人CD20抗體/FL融合蛋白能夠在體內治療已形成的腫瘤，誘導產生抗腫瘤免疫。并對第二次接種的腫瘤有強大的殺傷作用，使其不能形成腫瘤。而單純給予抗人CD20抗體，僅僅能夠治療已形成的腫瘤，不能有效抵抗再次的腫瘤接種。
三.人TRAIL/FL雙功能分子對荷瘤小鼠的體內抗腫瘤實驗測活細胞株選用Renca(購自韓國腫瘤研究院)上述細胞均傳代培養于25cm2培養瓶中，使用含10％胎牛血清的RPMI-1640/DMEM(VV＝1)培養基。
主要試劑人TRAIL/FL雙功能分子 TRAIL人FL對照組 無關抗體對照(抗人CD3/FL)取雌性BALB/c小鼠分別于Renca接種后5周兩種腫瘤直徑平均達0.5cm。隨機分為五個大組。一組為PBS組，共8只小鼠。一組為無關抗體對照抗人CD3/FL，一組為人TRAIL/FL雙功能分子，一組為TRAIL陽性對照組，一組為人FL對照組，分別以八只小鼠每組，治療劑量為2mg/kg。
將各種樣品均用PBS分別稀釋至終濃度0.4mg/ml，四種不同濃度。尾靜脈注射劑量按4mg/kg/周，對照組注射等體積PBS，連續進行3周后，觀察腫瘤的生長情況。取腫瘤消失的小鼠分別再次接種Renca腫瘤細胞，對腫瘤生長、消失情況進行調查。實驗結果見表7。實驗結果見表8所示。
表8TRAIL/FL融合蛋白的抗腫瘤作用

上表結果說明，TRAIL和FL單獨使用均有一定的抗腫瘤作用，但是單獨使用時均未表現出明顯的誘導主動免疫的作用。TRAIL/FL融合蛋白對接種形成的Renca腫瘤有明顯的治療作用，并可誘導產生主動免疫反應，使其可抵抗再次腫瘤接種。這種誘導主動免疫的作用有明顯的特異性。
上述實驗結果說明，供試的幾種與FL組成的雙功能融合蛋白不但具有明顯的體內治療作用，而且均具有誘導小鼠對特定腫瘤產生免疫反應的作用。表明融合蛋白有效誘導了體內DC和NK細胞擴增，不但提高了NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，而且DC細胞使腫瘤細胞或其釋放的某些組份的免疫原性大大提高，誘發機體對特定腫瘤產生了主動免疫反應。
實施例14腫瘤組織的免疫組化分析一.SM/FL以及hSM/FL融合蛋白對腫瘤組織給藥后的免疫組化分析為了進一步闡明SM單抗/FL融合蛋白和hSM單抗/FL融合蛋白的作用機理，我們對治療的小鼠進行了免疫組化分析。發現在給藥動物腫瘤組織中有大量腫瘤細胞死亡，并伴有DC細胞、NK細胞和其他淋巴細胞的浸潤。由此可見，SM單抗/FL融合蛋白和hSM單抗/FL融合蛋白具有引導DC、NK等細胞向腫瘤組織集中并發揮其對腫瘤細胞殺傷功能的作用。
1.接種復蘇Hepal-6/P230小鼠肝癌細胞系及B16/P230小鼠黑色素瘤細胞系，用10％FCS16/DM培養。待細胞擴增至一定數目，用0.05％胰蛋白酶、0.02％EDTA消化，調整細胞密度為2.7×107/ml，分別以200ul/只皮下接種C57BL/6小鼠。待C57BL/6荷瘤小鼠腫瘤直徑達0.5cm時，用SM5/FL融合蛋白等藥物尾靜脈注射，4mg/kg。連續治療3周進行腫瘤大小觀察及免疫組化檢測。
2.組化分析(HE染色法)試劑使用10％中性福爾馬林。
用眼科剪、鑷無菌條件下取出瘤組織。一半瘤組織用10％中性福爾馬林固定24小時。固定后的瘤組織經過一系列常規脫水、透明、浸蠟，最后包埋成蠟塊。將蠟塊用切片機進行切片，每塊蠟塊分切10張10μM厚的切片，58℃烤片，18小時后，開始脫蠟。二甲苯I、II、III級各10分鐘。無水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各2分鐘。自來水洗2-3分鐘，進行HE染色。將切片在顯微鏡下觀察，計數各種細胞的數量，統計分析。
實驗結果見表9

其中，-為0細胞/mm2，+為0-5細胞/mm2，++為5-10細胞/mm2，+++為10-15細胞/mm2，++++為＞20細胞/mm2。
上述結果說明，FL單獨使用時沒有明顯的誘導腫瘤細胞死亡的能力，但是嵌合的和人源化的SM單抗單獨使用或者與FL聯合使用時均可誘導明顯的腫瘤細胞死亡。同時，觀察發現，在腫瘤組織中和其周圍有一定量的淋巴細胞浸潤，浸潤的細胞類型包括NK、DC和其他T細胞和B細胞。嵌合或人源化SM/FL融合蛋白則具有更加明顯的誘導腫瘤細胞死亡的能力，其腫瘤組織和其周圍有大量的淋巴細胞浸潤。無關的融合蛋白抗CD3單抗/FL沒有這種能力。
上述結果說明，兩種抗體與FL組成的融合蛋白具有顯著的引導DC、NK和其他淋巴細胞向腫瘤組織集中的能力。
二.抗人Her2、抗人CD20和TRAIL與FL組成的融合蛋白對腫瘤組織的免疫組化分析為了進一步闡明其他融合蛋白的作用機理，采用前述同樣的方法對抗人Her2、抗人CD20和TRAIL與FL組成的融合蛋白進行了腫瘤組織的免疫組化分析。結果見表10
表10

其中，-為0細胞/mm2，+為0-5細胞/mm2，++為5-10細胞/mm2，+++為10-15細胞/mm2，++++為＞20細胞/mm2。
上述結果與前述SM、hSM的試驗結果完全一致，說明SM、hSM、抗CD20單抗、抗Her2單抗和TRAIL及其與FL組成的融合蛋白都能通過激活免疫細胞的途徑大量殺傷腫瘤細胞，在給藥后，其能夠發揮很大的活性，將NK和DC細胞帶到腫瘤組織，從而達到治療腫瘤的效果。
實施例15融合蛋白的體內分布實驗為了研究嵌合的和人源化的SM5-1與FL構成的融合蛋白是否能夠專一性地與腫瘤結合，我們研究了融合蛋白在體內的分布。
用放射性同位素標記的chSM、chSM/FL、huSM和huSM/FL融合蛋白分別尾靜脈注射荷瘤小鼠，48小時后取其各種組織，測量其放射性強度。結果如圖56。
圖中顯示的結果說明，SM/FL和hSM/FL融合蛋白與其相應嵌合單抗SM、人源化單抗的組織分布是一致的，它們都繼承了其相應單抗的專一性，都高度集中分布在腫瘤組織。
上述單抗和融合蛋白的這種組織分布是由單抗的特異性決定的，這種組織分布的特異性在臨床治療上有重要意義。一方面，這種特異性組織分布使用藥劑量明顯降低，另外，較少的用藥和藥物特異性分布在靶組織，就減少了對非靶組織的損傷。
采用如同上述一樣的方法，對抗人Her2單抗、抗人CD20單抗和TRAIL與FL組成的共三種融合蛋白的體內分布進行了研究。實驗結果如圖57所示。
如同前述看到的結果一樣，抗人HER2、抗人CD20和TRAIL三種分子以及它們與FL形成的融合蛋白均大量集中在腫瘤組織，其他組織中的分布相對較低。這種特異性的分布情況與chSM/FL、huSM/FL形成的融合蛋白的情況相同。
實施例16淋巴細胞輸注實驗按實施例1中的實驗方案將B16/P230及Hepal-6/P230荷瘤小鼠用chSM/FL或huSM/FL進行治療，待荷瘤小鼠腫瘤消失后，殺死動物，取出脾臟，常規方法分離脾細胞。然后，調整細胞濃度達1×109/ml。制備好的脾臟細胞輸給未接種過腫瘤的小鼠，每只小鼠輸注5×107細胞，然后再接種Hepap230或B16p230細胞，6周后觀察小鼠的存活情況。實驗結果見表11。
表11淋巴細胞輸注實驗

上述結果說明，被動輸注經chSM單抗/FL融合蛋白和huSM單抗/FL融合蛋白誘導產生主動免疫能力的小鼠的脾細胞可以使受試小鼠抵抗所接種腫瘤的攻擊。無關抗體的融合蛋白抗CD3單抗/FL以及單獨使用單抗和FL均不能使輸注的淋巴細胞具有抗腫瘤作用。這說明，輸注的淋巴細胞確實具有特異性的抗腫瘤作用。
上述結果還說明，SM單抗/FL融合蛋白和hSM單抗/FL融合蛋白抗腫瘤作用的機理在于它們誘導產生了專一性的抗腫瘤主動免疫反應。
采用上述相同的方法，按實施例1中的實驗方案將荷有4T1/her2，A20/CD20；Renca的小鼠分別用her2/FL、CD20/FL或Trail/FL進行治療，待荷瘤小鼠腫瘤消失后，殺死動物，取出脾臟，常規方法分離脾細胞。然后，調整細胞濃度達1×109/ml。制備好的脾臟細胞輸給未接種過腫瘤的小鼠，每只小鼠輸注5×107細胞，然后再分別接種4T1/her2，A20/CD20；Renca細胞，6周后觀察小鼠的存活情況。實驗結果見表12。
表12淋巴細胞輸注實驗

*實驗所用關鍵細胞系為Her相關實驗用4T1/her2；CD20相關實驗用A20/CD20；TRAIL相關實驗用Renca。
上述結果與前述的chSM/FL、huSM/FL的試驗結果完全一致。說明SM、huSM、抗CD20單抗、抗Her2單抗和TRAIL與FL組成的融合蛋白都是通過激活淋巴細胞的途徑達到殺傷腫瘤細胞效果的，而且這種殺傷作用具有特異性，對無關細胞系沒有作用。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>馬，菁<120>具有抗腫瘤功能的雙功能融合蛋白及其制備方法和應用<130>037089<150>CN 03129290.9<151>2003-06-13<160>68<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>546<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>1atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccg 546<210>2<211>182<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>2Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro180<210>3<211>1242<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1242)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>3atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa600ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc660tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc720aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag780
gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 840ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 900aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 960tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat1020cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc1080acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac1140aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac1200aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctcccggta aa 1242<210>4<211>414<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(414)<223>抗SM5-1抗體<220>4Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys405 410<210>5<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>人工接頭<220>5ggcggtggag gctctggtgg aggcggttca ggaggcggtg gatct 45
<210>6<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(15)<223>人工接頭編碼序列<220>6Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>7<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(426)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>7atcgccgcca ccatggaatg gagttggata tttctctttc tcctgtcagg aactgcaggt 60gtccactctg aggtccagct gcagcagtct ggacctgagc tggtaaagcc tggggcttca120gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggatac acattcacta gctatgttat gcactgggtg180aagcagaagc ctgggcaggg ccttgactgg attggatata ttgttcctta caatgatggc240actaagtaca atgagaagtt caaaggcaag gccacactga cttcaggcaa atcctccagc300acagcctaca tggagctcag cagactgacc tctgaggact ctgcggtcta ttattgtgtc360tacggtagta ggtacgactg gtatttagat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc420tcctca 426<210>8<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(138)<223>抗SM5-1抗體<220>8Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Val Tyr Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Val Trp115 120 125Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135<210>9<211>465<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(465)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>9atcatcacca gaacagctta cgagcagacc gccagacagc tcacagggat caagcttgcc 60gccaccatgg aatcacagac tcaggtcttc ctctccctgc tgctctgggt atctggtacc120tgtgggaaca ttatgatgac acagtcgcca tcatctctgg ctgtgtctgc aggagaaaag180gtcactatga gctgtaagtc cagtcaaagt gttttataca gttcaaatca gaagaactac240ttggcctggt accagcagaa accagggcag tctcctaaac tgctgatcta ctgggcatcc300actagggaat ctggtgtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctgggac agattttact360cttaccatca gcagtgtaca agctgaagac ctggcagttt attactgtca tcaatatttc420tcctcataca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa agcgg465
<210>10<211>133<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(133)<223>抗SM5-1抗體<220>10Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser1 5 10 15Gly Thr Cys Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala20 25 30Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr100 105 110Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 120 125Leu Glu Ile Lys Arg130<210>11<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2021)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>11atcgccgcca ccatggaatg gagttggata tttctctttc tcctgtcagg aactgcaggt 60gtccactctg aggtccagct gcagcagtct ggacctgagc tggtaaagcc tggggcttca 120gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggatac acattcacta gctatgttat gcactgggtg 180aagcagaagc ctgggcaggg ccttgactgg attggatata ttgttcctta caatgatggc 240actaagtaca atgagaagtt caaaggcaag gccacactga cttcagacaa atcctccagc 300acagcctaca tggagctcag cagactgacc tctgaggact ctgcggtcta ttattgtgtc 360tacggtagta ggtacgactg gtatttagat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>12<211>468<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(468)<223>抗SM5-1抗體
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<221>misc_feature<222>(1)..(766)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>13atcatcacca gaacagctta cgagcagacc gccagacagc tcacagggat caagcttgcc 60gccaccatgg aatcacagac tcaggtcttc ctctccctgc tgctctgggt atctggtacc120tgtgggaaca ttatgatgac acagtcgcca tcatctctgg ctgtgtctgc aggagaaaag180gtcactatga gctgtaagtc cagtcaaagt gttttataca gttcaaatca gaagaactac240ttggcctggt accagcagaa accagggcag tctcctaaac tgctgatcta ctgggcatcc300actagggaat ctggtgtccc tggtcgcttc acaggcagtg gatctgggac agattttact360cttaccatca gcagtgtaca agctgaagac ctggcagttt attactgtca tcaatatttc420tcctcataca cgttcggagg ggggaccaag ctggaaataa agcggactgt ggctgcacca480tctgtcttca tcttcccgcc atcttatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg540tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc600ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac660
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc720tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag780tgttag 786<210>14<211>239<212>PRT<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(138)<223>抗SM5-1抗體<220>16Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
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<221>misc_feature<222>(1)..(465)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>17gagcattacc ggccatactc accaccatcc caggatatct ctagaaagct tgccgccacc 60atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc120agaggaaaca tcatgatgac tcagagccca tccagcttga gcgcatcagt aggcgaccgc180gtaacgatca cttgcaaatc ctctcagtca gtattgtact ccagcaacca gaagaactac240ctggccggat atcagcagac tcccggcaaa gccccaaagt tgctgattta ttgggcctcc300acgcgcgagt ctggcgtgcc atcacgcttt agcggcagcg ggtccggtac agattacacg360tttaccatta gcagtctgca gcctgaggac atagccacct actactgtca ccagtacttt420agttcctaca cttttggcca gggaactaaa ctgcagatta ctcga465<210>18<211>135<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(135)<223>抗SM5-1抗體<220>18Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser35 40 45Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr50 55 60Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser65 70 75 80Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly85 90 95Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala100 105 110Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly115 120 125Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg130 135<210>19<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2021)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>19agagccgcca ccatggattg ggtgtggacc ttgctattcc tgttgtcagt aactgcaggt 60gtccactccc aggtgcagct ggtgcagtct ggcggtggag tggtccagcc cggccgcagc120ctgaggctgt cctgcaaggc atctggctac accttcacca gctacgtgat gacatgggtg180cgccaagccc ccggaaaggg cctcgaatgg attggctaca ttgtgcctta taatgacggt240actaagtaca atgaaaagtt caagggcaga tttacaatat caagtgacaa gagcaagtca300accgcattcc tccaaatgga cagcttgcgt ccagaggaca ccgccgtata ctattgtgtg360cgcggcagcc gttacgactg gtacttggac tactggggcc aaggcactcc agtcaccgtc420tcctctgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtctggga actcaggcac cctgaccagc ggcatgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc780
tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagar1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>20<211>468<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(468)<223>抗SM5-1抗體<220>20Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asn Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Lys Ser85 90 95Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr195 200 205Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser225 230 235 240Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser275 280 285His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu450 455 460Ser Pro Gly Lys465<210>21<211>786<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(786)<223>抗SM5-1抗體核苷酸序列<220>21gagcattacc ggccatactc atcaccatcc caggatatct ctagaaagct tgccgccacc 60atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcttcagt cataatgtcc120agaggaaaca tcatgatgac tcagagccca tccagcttga gcgcatcagt aggcgaccgc180gtaacgatca cttgcaaatc ctctcagtca gtattgtact ccagcaacca gaagaactac240ctggccggat atcagcagac tcccggcaaa gccccaaagt tgctgattta ttgggcctcc300acgcgcgagt ctggcgtgcc atcacgcttt agcggcagcg ggtccggtac agattacacg360tttaccatta gcagtctgca gcctgaggac atagccacct actactgtca ccagtacttt420agttcctaca cttttggcca gggaactaaa ctgcagatta crcgaactgt ggctcaacca480tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg540tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc600ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac660agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc720tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag780tgttag 786<210>22<211>241<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(241)<223>抗SM5-1抗體<220>22Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser35 40 45Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr50 55 60Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser65 70 75 80Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly85 90 95Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala100 105 110Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly115 120 125Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile130 135 140Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val145 150 155 160Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys165 170 175Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu180 185 190Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu195 200 205Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr210 215 220His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu225 230 235 240Cys<210>23<211>2489<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2489)<223>抗p230抗體融合蛋白編碼序列<220>23agagccgcca ccatggattg ggtgtggacc ttgctattcc tgttgtcagt aactgcaggt 60gtccactccc aggtgcagct ggtgcagtct ggcggtggag tggtccagcc cggccgcagc 120ctgaggctgt cctgcaaggc atctggctac accttcacca gctacgtgat gacatgggtg 180cgccaagccc ccggaaaggg cctcgaatgg attggctaca ttgtgcctta taatgacggt 240actaagtaca atgaaaagtt caagggcaga tttacaatat caagtgacaa gagcaagtca 300accgcattcc tccaaatgga cagcttgcgt ccagaggaca ccgccgtata ctattgtgtg 360cgcggcagcc gttacgactg gtacttggac tactggggcc aaggcactcc agtcaccgtc 420tcctctgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaaac ccaggactgc tccttccaac2040acagccccat ctcctccgac ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc2100aagattaccc agtcaccgtg gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct2160ggcggctggt cctggcacag cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga2220tgcaaggctt gctggagcgc gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc2280agcccccccc cagctgtctt cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga2340cctccgagca gctggtggcg ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc2400tggagctgca gtgtcagccc gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc2460tggaggccac agccccgaca gccccgtga 2489<210>24<211>624<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(624)<223>抗p230抗體融合蛋白<220>24Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Lys Ser85 90 95Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser225 230 235 240Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser275 280 285His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Arg Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro405 410 415Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu450 455 460Ser Pro Gly Lys Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser465 470 475 480Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln485 490 495Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys500 505 510Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu515 520 525Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn530 535 540Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser545 550 555 560Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr565 570 575Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe580 585 590Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro595 600 605Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro610 615 620<210>25<211>2534<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2534)<223>抗p230抗體融合蛋白編碼序列<220>25agagccgcca ccatggattg ggtgtggacc ttgctattcc tgttgtcagt aactgcaggt 60gtccactccc aggtgcagct ggtgcagtct ggcggtggag tggtccagcc cggccgcagc120ctgaggctgt cctgcaaggc atctggctac accttcacca gctacgtgat gacatgggtg180cgccaagccc ccggaaaggg cctcgaatgg attggctaca ttgtgcctta taatgacggt240actaagtaca atgaaaagtt caagggcaga tttacaatat caagtgacaa gagcaagtca300accgcattcc tccaaatgga cagcttgcgt ccagaggaca ccgccgtata ctattgtgtg360cgcggcagcc gttacgactg gtacttggac tactggggcc aaggcactcc agtcaccgtc420tcctctgcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag 1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat 1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg 1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg 1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca 1260
tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaagg cggtggaggc tctggtggag2040gcggttcagg aggcggtgga tctacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct2100ccgacttcgc tgtcaaaatc cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca2160ccgtggcctc caacctgcag gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg2220cacagcgctg gatggagcgg ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg2280agcgcgtgaa cacggagata cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct2340gtcttcgctt cgtccagacc aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg2400tggcgctgaa gccctggatc actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc2460agcccgactc ctcaaccctg ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc2520cgacagcccc gtga 2534<210>26<211>639<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(639)<223>抗p230抗體融合蛋白<220>26Met Asp Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phc Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Lys Ser Lys Ser85 90 95Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr195 200 205Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser225 230 235 240Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser275 280 285His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val370 375 380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
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tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaagggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaagg cggtggaggc tctggtggag2040gcggttcagg aggcggtgga tctacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct2100ccgacttcgc tgtcaaaatc cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca2160ccgtggcctc caacctgcag gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg2220cacagcgctg gatggagcgg ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg2280agcgcgtgaa cacggagata cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct2340gtcttcgctt cgtccagacc aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg2400tggcgctgaa gccctggatc actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc2460agcccgactc ctcaaccctg ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc2520cgacagcccc gtga 2534<210>32<211>639<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(639)<223>抗p230抗體融合蛋白<400>32Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly1 5 10 15Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Asp Trp Ile Gly Tyr Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met GLu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Val Tyr Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Val Trp115 120 125Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr145 150 155 160Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr165 170 175Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro180 185 190Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr195 200 205Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn210 215 220His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser225 230 235 240Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu245 250 255Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu260 265 270Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser275 280 285His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly Val Glu290 295 300Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr305 310 315 320Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn325 330 335Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln355 360 365Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val370 375380Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val385 390 395 400Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro405 410 415Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr420 425 430Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val435 440 445Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu450 455 460Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly465 470 475 480Gly Gly Ser Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser485 490 495Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp500 505 510Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly515 520 525Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys530 535 540Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr545 550 555 560Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys565 570 575Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser580 585 590Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser595 600 605Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro610 615 620Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro625 630 635<210>33<211>1986<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1986)<223>抗p230抗體融合蛋白編碼序列<220>33atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaagactt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa600ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc660tcccggaccc ctgaggtcac aggcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc720aagttcaact ggtacgtgga cgacgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag780gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg840ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag900aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca960tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1020cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1080acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1140aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1200aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctcccggta aagaggtcca gctgcagcag 1260tctggacctg agctggtaaa gcctggggct tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctgga 1320tacacattca ctagctatgt tatgcactgg gtgaagcaga agcctgggca gggccttgac 1380tggattggat atattgttcc ttacaatgat ggcactaagt acaatgagaa gttcaaaggc 1440aaggccacac tgacttcaga caaatcctcc agcacagcct acatggagct cagcagactg 1500acctctgagg actctgcggt ctattattgt gtctacggta gtaggtacga ctggtattta 1560gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc gtctcctcag gcggtggagg ctctggtgga 1620ggcggttcag gaggcggtgg atctaacatt atgatgacac agtcgccatc atctctggct 1680gtgtctgcag gagaaaaggt cactatgagc tgtaagtcca gtcaaagtgt tttatacagt 1740tcaaatcaga agaactactt ggcctggtac cagcagaaac cagggcagtc tcctaaactg 1800ctgatctact gggcatccac tagggaatct ggtgtccctg atcgcttcac aggcagtgga 1860tctgggacag attttactct taccatcagc agtgtacaag ctgaagacct ggcagtttat 1920tactgtcatc aatatttctc ctcatacacg ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaag 1980cggtga 1986<210>34
<211>661<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(661)<223>抗p230抗體融合蛋白<220>34Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Glu Val405 410 415Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val420 425 430Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met435 440 445His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile Gly Tyr450 455 460Ile Val Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly465 470 475 480Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu485 490 495Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Tyr500 505 510Gly Ser Arg Tyr Asp Trp Tyr Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr515 520 525Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly530 535 540Gly Gly Gly Ser Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala545 550 555 560Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser565 570 575Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln580 585 590Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
595 600 605Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp610 615 620Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr625 630 635 640Tyr Cys His Gln Tyr Phe Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys645 650 655Leu Glu Ile Lys Arg660<210>35<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(428)<223>抗CD20抗體編碼序列<220>35gccaccatgg gattcagcag gatctttctc ttcctcctgt cagtaactac aggtgtccac 60tcccaggtac aactacagca gcctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag120atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accagttaca atatgcactg ggtaaagcag180acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc240tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc300tacatgcagc tcagcagcct gacatctgaa gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg360acttactacg gcggtgactg gtacttcaat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc420tctgca 426<210>36<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(140)<223>抗CD20抗體<220>36Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn115 120 125Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala130 135 140<210>37<211>390<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(390)<223>抗CD20抗體編碼序列<220>37accatggatt ttcaagtgca gattttcagc ttcctgctaa tcagtgcttc agtcataatg 60tccagaggac aaattgttct ctcccagtct ccagcaatcc tgtctgcatc tccaggggag120aaggtcacaa tgacttgcag ggccagctca agtgtaagtt acatccactg gttccagcag180aagccaggat cctcccccaa accctggatt tatgccacat ccaacctggc ttctggagtc240cctgttcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagtagagtg300gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga ctagtaaccc acccacgttc360ggtggtggga ccaagctgga gatcaaacga 390<210>38<211>129<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(129)<223>抗CD20抗體<220>38Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr 1le85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125Arg<210>39<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2021)<223>抗CD20抗體編碼序列<220>39gccaccatgg gattcagcag gatctttctc ttcctcctgt cagtaactac aggtgtccac 60tcccaggtac aactacagca gcctggggct gagctggtag agcctggggc ctcagtgaag 120atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accagttaca atatgcactg ggtaaagcag 180acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc 240tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 300tacatgcagc tcagcagcct gacatctgaa gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg 360acttactacg gcggtgactg gtacttcaat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420tctgcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctctc cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1690ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>40<211>470<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(470)<223>抗CD20抗體<220>40Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30
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<221>misc_feature<222>(1)..(711)<223>抗CD20抗體編碼序列<220>41accatggatt ttcaagtgca gattttcagc ttcctgctaa tcagtgcttc agtcataatg 60tccagaggac aaattgttct ctcccagtct ccagcaatcc tgtctgcatc tccaggggag120aaggtcacaa tgacttgcag ggccagctca agtgtaagtt acatccactg gttccagcag180aagccaggat cctcccccaa accctggatt tatgccacat ccaacctggc ttctggagtc240cctgttcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagtagagtg300gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga ctagtaaccc acccacgttc360ggtggtggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc420ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac480ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac540tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc600ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat660cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711<210>42<211>235<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(235)<223>抗CD20抗體<220>42Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile20 25 30Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser50 55 60Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro65 70 75 80Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile85 90 95Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp100 105 110Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu130 135 140Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe145 150 155 160Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln165 170 175Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser180 185 190Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu195 200 205Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser210 215 220Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>43<211>2489<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2489)<223>抗CD20抗體融合蛋白編碼序列<220>43gccaccatgg gattcagcag gatctttctc ttcctcctgt cagtaactac aggtgtccac 60tcccaggtac aactacagca gcctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag120atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accaattaca atatgcactg ggtaaagcag180acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc240tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc300tacatgcagc tcagcagcct gacatctgaa gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg360acttactacg gcggtgactg gtacttcaat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc420tctgcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag 1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat 1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg 1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg 1200ccctagagta gcctgcatcc aaggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca 1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac aggcgtggtg gtggacgtga 1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccggatggtc tgcgtcctca 1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc 1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta 1680ccaacctctg tcctacgggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc 1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca 1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc 1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga 1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc 1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaaac ccaggactgc tccttccaac 2040acagccccat ctcctccgac ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc 2100aagattaccc agtcaccgtg gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct 2160
ggcggctggt cctggcacag cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga2220tgcaaggctt gctggagcgc gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc2280agcccccccc cagctgtctt cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga2340cctccgagca gctggtggcg ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc2400tggagctgca gtgtcagccc gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc2460tggaggccac agccccgaca gccccgtga 2489<210>44<211>626<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(626)<223>抗CD20抗體融合蛋白編碼序列<220>44Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn65 70 75 80Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn115 120 125Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly145 150 155 160Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200 205Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn210 215 220Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro225 230 235 240Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu245 250 255Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp260 265 270Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp275 280 285Val Ser His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Gly290 295 300Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn305 310 315 320Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp325 330 335Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro340 345 350Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu355 360 365Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn370 375 380Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile385 390 395 400Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr405 410 415Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys420 425 430Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys435 440 445Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu450 455 450Ser Leu Ser Pro Gly Lys Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro465 470 475 480Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu485 490 495Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu500 505 510Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu515 520 525Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg
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<221>misc_feature<222>(1)..(2534)<223>抗CD20抗體融合蛋白<400>45gccaccatgg gattcagcag gatctttctc ttcctcctgt cagtaactac aggtgtccac 60tcccaggtac aactacagca gcctggggct gagctggtga agcctggggc ctcagtgaag 120atgtcctgca aggcttctgg ctacacattt accagttaca atatgcactg ggtaaagcag 180acacctggtc ggggcctgga atggattgga gctatttatc caggaaatgg tgatacttcc 240tacaatcaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcc 300tacathcagc tcagcagcct gacatctgaa gactctgcgg tctattactg tgcaagatcg 360acttactacg gcggtgactg gtacttcaat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 420tctgcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatggtc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg caggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaagg cggtggaggc tctggtggag2040gcggttcagg aggcggtgga tctacccagg actgctcctt ccaacacagc cccatctcct2100ccgacttcgc tgtcaaaatc cgtgagctgt ctgactacct gcttcaagat tacccagtca2160ccgtggcctc caacctgcag gacgaggagc tctgcggggg cctctggcgg ctggtcctgg2220cacagcgctg gatggagcgg ctcaagactg tcgctgggtc caagatgcaa ggcttgctgg2280agcgcgtgaa cacggagata cactttgtca ccaaatgtgc ctttcagccc ccccccagct2340gtcttcgctt cgtccagacc aacatctccc gcctcctgca ggagacctcc gagcagctgg2400tggcgctgaa gccctggatc actcgccaga acttctcccg gtgcctggag ctgcagtgtc2460agcccgactc ctcaaccctg ccacccccat ggagtccccg gcccctggag gccacagccc2520cgacagcccc gtga 2534<210>46<211>641<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(641)<223>抗CD20抗體融合蛋白編碼序列<400>46Met Gly Phe Ser Arg Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala GIu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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<221>misc_feature<222>(1)..(1976)
<223>抗CD20抗體融合蛋白編碼序列<220>47atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac aaagccccat ctcctccgac 120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg 180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag 240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc 300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt 360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg 420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc 480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca 540gccccggagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 600ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 660tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 720aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 780gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 840ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 900aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 960tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat1020cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc1080acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac1140aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatacatga ggctctgcac1200aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctcccggta aacaggtaca actacagcag1260cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc1320tacacattta ccagttacaa tatgcactgg gtaaagcaga cacctggtcg gggcctggaa1380tggattggag ctatttatcc aggaaatggt gatacttcct acaatcagaa gttcaagggc1440aaggccacac tgactgcaga caaatcctcc agcacagcct acatgcagct cagcagcctg1500acatctgaag actctgcggt ctattactgt gcaagatcga cttactacgg cggtgactgg1560tacttcaatg tctggggcgc agggaccacg gtcaccgtct ctgcaggcgg tggaggctct1620ggtggaggcg gttcaggagg cggtggatct caaattgttc tctcccagtc tccagcaatc1680ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt1740tacatccact ggttccagca gaagccagga tcctccccca aaccctggat ttatgccaca1800tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac1860tctctcacaa tcagtagagt ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg1920actagtaacc cacccacgtt cggtggtggg accaagctgg agatcaaacg atga 1974<210>48<211>657<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(657)<223>抗CD20抗體融合蛋白<220>48Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln GIy85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 1757hr Ala Pro Thr Ala Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gln Val405 410 415Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val420 425 430Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met435 440 445His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala450 455 460Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly465 470 475 480Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln485 490 495Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg500 505 510Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly515 520 525Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly530 535 540Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile545 550 555 560Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser565 570 575Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser580 585 590Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro595 600 605Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile610 615 620Ser Arg Val Glu Ala Glu Ala Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp625 630 635 640Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys645 650 655Arg<210>49<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(426)<223>抗Her2抗體編碼序列<220>49atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc120cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatataca ctgggtgcgt180caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt gcaaggattt atcctacgaa tggttatact240agatatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca300gcctacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgttcraga360tggggagggg acggcttcta tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc420tcctcg 426<210>50<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(142)<223>抗Her2抗體編碼序列<220>50Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr65 70 75 80Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr85 90 95Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140<210>51<211>390<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(390)<223>抗Her2抗體編碼序列<220>51atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagaca tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg120gttaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag180aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc240ccttctcgct tctctggctc cagatctggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg300cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc360ggacagggta ccaaggtgga gatcaaacgt 390<210>52<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(130)<223>抗Her2抗體<220>52Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val65 70 75 80Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Lys Arg130<210>53<211>2021<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_featute<222>(1)..(2021)<223>抗Her2抗體編碼序列<220>53atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc120cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatataca ctgggtgcgt180caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt gcaaggattt atcctacgaa tggttatact240agatatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca300gcctacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgttctaga360tggggagggg acggcttcta tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc420tcctcggcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag crtgggcacc660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt720
ggtgagaggc cagcacaggg gaggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccggtaaatg a2021<210>54<211>472<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(472)<223>抗Her2抗體編碼序列<220>54Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr65 70 75 80Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr85 90 95Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr145 150 155 160Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val225 230 235 240Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala245 250 255Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro260 265 270Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val275 280 285Val Asp Val Ser His Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp290 295 300Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln305 310 315 320Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln325 330 335Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala340 345 350Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro355 360 365Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr370 375 380Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser385 390 395 400Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr420 425 430Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe435 440 445Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys450 455 460Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470<210>55<211>711<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(711)<223>抗Her2抗體編碼序列<220>55atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagaca tccagatgac ccagtccccg agctccctgt ccgcctctgt gggcgatagg120gttaccatca cctgccgtgc cagtcaggat gtgaatactg ctgtagcctg gtatcaacag180aaaccaggaa aagctccgaa actactgatt tactcggcat ccttcctcta ctctggagtc240ccttctcgct tctctggctc cagatctggg acggatttca ctctgaccat cagcagtctg300cagccggaag acttcgcaac ttattactgt cagcaacatt atactactcc tcccacgttc360ggacagggta ccaaggtgga gatcaaacgt actgtggctg caccatctgt cttcatcttc420ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac480ttctatccca gagaggccaa attacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac540tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc600ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat660cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711<210>56<211>236<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(236)<223>抗Her2抗體<220>56Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser20 25 30Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser35 40 45Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys50 55 60Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val65 70 75 80Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr85 90 95Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln100 105 110His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile115 120 125Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp130 135 140Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn145 150 155 160Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu165 170 175Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp180 185 190Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr195 200 205Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser210 215 220Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>57<211>2489<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2489)<223>抗Her2抗體融合蛋白編碼序列
<220>57atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatatcc 60agaggagagg ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg tgcagccagg gggctcactc 120cgtttgtcct gtgcagcttc tggcttcaac attaaagaca cctatataca ctgggtgcgt 180caggccccgg gtaagggcct ggaatgggtt gcaaggattt atcctacgaa tggttatact 240agatatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg cagacacatc caaaaacaca 300gcctacctgc agatgaacag cctgcgtgct gaggacactg ccgtctatta ttgttctaga 360tggggagggg acggcttcta tgctatggac tactggggtc aaggaaccct ggtcaccgtc 420tcctcggcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540gtgtcttgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gcaggctcag cgctcctgcc 780tggacgcatc ccggctatgc agccccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctgcctc 840ttcacccgga gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc 900ccaggctctg ggcaggcaca ggctaggtgc ccctaaccca ggccctgcac acaaaggggc 960aggtgctggg ctcagacctg ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag1020cccaccccaa aggccaaact ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat1080tccagtaact cccaatcttc tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg1140cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc ctcgccctcc agctcaaggc gggacaggtg1200ccctagagta gcctgcatcc agggacaggc cccagccggg tgctgacacg tccacctcca1260tctcttcctc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac1320ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga1380gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg1440ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcactta ccgggtggtc tgcgtcctca1500ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag1560ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa aggtgggacc cgtggggtgc1620gagggccaca tggacagagg ccggctcggc ccaccctctg ccctgagagt gaccgctgta1680ccaacctctg tcctacaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc1740gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca1800gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc1860ctcccgtgct gaactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga1920gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc1980actacacgca gaagagcctc tccctgtctc ccgataaaac ccaggactgc tccttccaac2040acagccccat ctcctccgac ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc2100aagattaccc agtcaccgtg gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct2160ggcggctggt cctggcacag cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga2220tgcaaggctt gctggagcgc gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc2280agcccccccc cagctgtctt cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga2340cctccgagca gctggtggcg ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc2400tggagctgca gtgtcagccc gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc2460tggaggccac agccccgaca gccccgtga 2489<210>58<211>628<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(628)<223>抗Her2抗體融合蛋白<220>58Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser1 5 10 15Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr65 70 75 80Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr85 90 95Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser130 135 140Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr145 150 155 160Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro165 170 175Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val180 185 190His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser195 200 205Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile210 215 220Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
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<221>misc_feature<222>(1)..(1098)<223>Trail融合蛋白編碼序列<220>63atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcactcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccgggcg gtggaggctc tggtggaggc ggttcaggag gcggtggatc tgtgagagaa600agaggtcctc agagagtagc agctcacata actgggacca gaggaagaag caacacattg660tcttctccaa actccaagaa tgaaaaggct ctgggccgca aaataaactc ctgggaatca720tcaaggagtg ggcattcatt cctgagcaac ttgcacttga ggaatggtga actggtcatc780catgaaaaag ggttttacta catctattcc caaacatact ttcgatttca ggaggaaata840aaagaaaaca caaagaacga caaacaaatg gtccaatata tttacaaata cacaagttat900cctgacccta tattgttgat gaaaagtgct agaaatagtt gttggtctaa agatgcagaa960tatggactct attccatcta tcaaggggga atatttgagc ttaaggaaaa tgacagaatt 1020tttgtttctg taacaaatga gcacttgata gacatggacc atgaagccag tttttttggg 1080gcctttttag ttggctaa 1098<210>64<211>365<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(365)<223>Trail融合蛋白<220>64Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser180 185 190Gly Gly Gly Gly Ser Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala195 200 205His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn210 215 220Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser225 230 235 240Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly245 250 255Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr260 265 270Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys275 280 285Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile290 295 300Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu305 310 315 320Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu
325 330 335Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met340 345 350Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly355 360 365<210>65<211>1203<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1203)<223>Trail融合蛋白編碼序列<220>65atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac120ttcgctgtca aaatccgtga gctgtctgac tacctgcttc aagattaccc agtcaccgtg180gcctccaacc tgcaggacga ggagctctgc gggggcctct ggcggctggt cctggcacag240cgctggatgg agcggctcaa gactgtcgct gggtccaaga tgcaaggctt gctggagcgc300gtgaacacgg agatacactt tgtcaccaaa tgtgcctttc agcccccccc cagctgtctt360cgcttcgtcc agaccaacat ctcccgcctc ctgcaggaga cctccgagca gctggtggcg420ctgaagccct ggatcagtcg ccagaacttc tcccggtgcc tggagctgca gtgtcagccc480gactcctcaa ccctgccacc cccatggagt ccccggcccc tggaggccac agccccgaca540gccccgatga agcagatcga ggacaaaatt gaggaaatcc tgtccaagat ttaccacatc600gagaacgaga tcgcccggat taagaaactc attggcgaga cctctgagga aaccatttct660acagttcaag aaaagcaaca aaatatttct cccctagtga gagaaagagg tcctcagaga720gtagcagctc acataactgg gaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc780aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata aactcctgcg aatcatcaag gagtgggcat840tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt900tactacatct attcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag960aacgacaaac aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctga ccctatattg 1020ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc 1080atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca 1140aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt ttggggcctt tttagttggc 1200taa 1203<210>66<211>400<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(400)<223>Trail融合蛋白<220>66Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Thr Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu180 185 190Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys195 200 205Lys Leu Ile Gly Glu Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu210 215 220Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg225 230 235 240Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser245 250 255Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser260 265 270Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu
275 280 285Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr290 295 300Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys305 310 315 320Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro325 330 335Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys340 345 350Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu355 360 365Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu370 375 380Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly385 390 395 400<210>67<211>1749<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(582)<223>Trail融合蛋白<220>68Met Thr Val Leu Ala Pro Ala Trp Ser Pro Tht Thr Tyr Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Ser Gly Thr Gln Asp Cys Ser Phe20 25 30Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala Val Lys Ile Arg Glu Leu35 40 45Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val Thr Val Ala Ser Asn Leu50 55 60Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp Arg Leu Val Leu Ala Gln65 70 75 80Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala Gly Ser Lys Met Gln Gly85 90 95Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His Phe Val Thr Lys Cys Ala100 105 110Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe Val Gln Thr Asn Ile Ser115 120 125
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu Val Ala Leu Lys Pro Trp130 135 140Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gln Cys Gln Pro145 150 155 160Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser Pro Arg Pro Leu Glu Ala165 170 175Thr Ala Pro Thr Ala Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr180 185 190Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe195 200 205Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro210 215 220Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val225 230 235 240Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr245 250 255Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val260 265 270Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys275 280 285Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser290 295 300Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro305 310 315 320Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val325 330 335Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly340 345 350Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp355 360 365Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp370 375 380Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His385 390 395 400Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Arg405 410 415Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly420 425 430Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu435 440 445Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe450 455 460Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys465 470 475 480Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu485 490 495Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr500 505 510Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg515 520 525Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr530 535 540Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser545 550 555 560Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe565 570 575Gly Ala Phe Leu Val Gly580
權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括第一部分和第二部分，第一部分為Flt3配體或其生物活性片段，第二部分為蛋白或多肽類抗腫瘤物。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，抗腫瘤物可以是引起細胞凋亡的分子。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，在其中的Flt3配體或其生物活性片段可以刺激造血干細胞或祖細胞增殖。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體或其生物活性片段可以刺激骨髓前體細胞、單核細胞、巨噬細胞、B細胞以及樹突狀細胞和NK細胞增殖。
5.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體或其生物活性片段可以來源于哺乳動物。
6.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體或其生物活性片段可以來源于人。
7.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體或其生物活性片段是可溶性蛋白。
8.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體包含至少100個氨基酸并且與SEQ IDNO2所示氨基酸序列有至少40％同源性。
9如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體可與1種抗體結合，此種抗體可特異性與SEQ ID NO2所示氨基酸序列構成的多肽結合，且Flt3配體充分保留了其生物學活性。
10.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。
11.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體包含的氨基酸序列與SEQ ID NO2所示第28至128位氨基酸序列有至少80％同源性。
12.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體的氨基酸序列包含SEQ ID NO2所示第28至128位氨基酸。
13.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體包含的氨基酸序列可以選自SEQ IDNO2所示第28至160位氨基酸或SEQ ID NO2所示第28至182位氨基酸。
14.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，抗腫瘤物可以是抗體分子。
15.如權利要求14所述的融合蛋白，其中，抗體分子可以是完整抗體分子，Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv，二體，單鏈抗體等片段或由各種抗體片段組成的多特異性抗體。
16.如權利要求14所述的融合蛋白，其中，抗體可以是抗p230抗體，抗CD20抗體，抗Her2抗體，抗Her3抗體，抗Her4抗體，抗EGFR抗體或他們的生物活性片段。
17.如權利要求14所述的融合蛋白，其中，抗體可以是人源或人源化抗體。
18.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，抗腫瘤物可以是Fas配體，TNF，TRAIL，或他們的生物活性膜外區片段。
19.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體可以位于融合蛋白的N端。
20.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體可以位于融合蛋白的C端。
21.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，Flt3配體和抗腫瘤物可以被連接肽所分隔。
22.如權利要求1所述的融合蛋白，其中，連接肽可以為(Gly4Ser)3。
23.如權利要求1所述的融合蛋白包含SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO44，SEQ ID NO46，SEQ IDNO48，SEQ ID NO58，SEQ ID NO60，SEQ ID NO62，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66或SEQ ID NO68所示氨基酸序列。
24.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的雙功能融合蛋白。
25.如權利要求24所述的核酸分子包含SEQ ID NO23，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO29，SEQ ID NO31，SEQ ID NO33，SEQ ID NO43，SEQ ID NO45，SEQ IDNO47，SEQ ID NO57，SEQ ID NO59，SEQ ID NO61，SEQ ID NO63，SEQ ID NO65或SEQ ID NO67所示核苷酸序列。
26.一種分離的核酸分子，其特征在于，它包含與權利要求24所述核酸分子互補的核酸序列。
27.一種載體，其特征在于，它含有編碼權利要求1所述融合蛋白的核酸分子。
28.如權利要求27所述的載體包含與編碼FLt3配體和蛋白或多肽抗腫瘤物的核酸分子以及與其操作性相連的表達調控序列。
29.一種重組細胞，其特征在于，它含有權利要求24所述核酸分子。
30.如權利要求29所述的重組細胞，其特征在于，它是真核細胞。
31.如權利要求30所述的重組細胞，其特征在于，它是CHO，COS或NSO細胞。
32.一種產生融合蛋白的方法，其特征在于，它包括如何培養含有權利要求24所述核酸分子的重組細胞，以至此重組細胞表達編碼的融合蛋白并回收此融合蛋白。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，它包括分離和純化融合蛋白。
34.如權利要求32所述的方法的產物。
35.一種藥物組合物，其特征在于，它包含有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。
36.一種方案，其特征在于，它包含有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白以及如何服用所述融合蛋白的方法。
37.一種治療哺乳動物腫瘤的方法，此方法包括給需要治療或合乎要求的動物服用有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白。
38.如權利要求37所述的方法，其中，哺乳動物可以是人。
39.如權利要求37所述的方法，其中，腫瘤可以是黑色素瘤，乳腺癌或肝癌。
40.一種藥物組合物，其特征在于，它包含a)有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白。b)有效劑量的抗腫瘤制劑。
41.如權利要求40所述的組合物，其中，抗腫瘤制劑是一種治療黑色素瘤，乳腺癌或肝癌的制劑。
42.一種治療哺乳動物腫瘤的方法，此方法包括給需要治療或合乎要求的動物服用有效劑量的如權利要求40所述的組合物。
43.一種通過caspase-3誘導細胞凋亡的方法，其特征在于，它包括給需要誘導或合乎要求的細胞使用有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白。
44.如權利要求43所述的方法，其中，細胞可以是哺乳動物細胞。
45.如權利要求44所述的方法，其中，細胞可以是哺乳動物腫瘤細胞。
46.如權利要求43所述的方法，其中，細胞可以是在哺乳動物體內。
47.一種疫苗，其特征在于，它包含有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白，以及一種免疫增強劑。
48.一種在哺乳動物體內激發抗腫瘤免疫反應的方法，其特征在于，它包括給需要治療或合乎要求的動物服用有效劑量的如權利要求47所述的疫苗。
49.一種產生腫瘤特異性淋巴細胞的方法，其特征在于，它包括給哺乳動物服用有效劑量的Flt3配體和蛋白或多肽類抗腫瘤物組成的融合蛋白以產生腫瘤特異性淋巴細胞并從所述的哺乳動物回收產生的腫瘤特異性淋巴細胞。
全文摘要
本發明公開了一類具有抗腫瘤功能的雙功能融合蛋白，包括第一部分和第二部分，其中第一部分為具有誘導腫瘤細胞凋亡功能的分子，第二部分為Flt配體。本發明還公開了該雙功能融合蛋白的編碼核酸以及制備方法。本發明還公開了該雙功能融合蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應用。
文檔編號C12N5/00GK1572801SQ200310119930
公開日2005年2月2日 申請日期2003年11月25日 優先權日2003年6月13日
發明者馬菁 申請人:馬菁