專利名稱：一種降解對氯代硝基苯的睪丸酮叢毛單胞菌及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物生物技術和環境生物技術領域，具體地說，它涉及一株睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液、固定化細胞菌可以降解對氯代硝基苯；該菌株能以對氯代硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長，并將對氯代硝基苯完全降解利用。該菌株在以對氯代硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長時，先將硝基還原成羥胺，然后在菌株產生的2-氨基酚1，6-雙加氧酶的作用下，通過間位開環的方式，將2-氨基-5-氯苯酚開環成烴類，從而進一步被降解利用。該菌株適用于生產對氯代硝基苯的工業廢水的生物處理和對氯代硝基苯污染土壤的生物修復(生物整治)。
背景技術：
氯代硝基苯類化合物(Chloronitrobenzenes，CNBs)作為重要的化工中間體被廣泛用于生產和制造橡膠、染料、農藥、醫用藥品等，以對氯硝基苯為例，我國2000年產量為12萬噸。氯代硝基苯等芳香族化合物具有多種途徑進入環境成為污染物，例如殘留在生產過程中排放的廢水，或者由環境中含芳香環化合物的不徹底降解和轉化而來，例如硝基苯胺和氯代硝基苯胺是農藥、染料、顏料等不徹底分解產生的；我國自來水供應多采用氯化消毒，氯代硝基苯是檢測到的氯化消毒副產物之一。歐共體早已宣布氯代硝基苯是一種特別有害的化合物且在環境中難以降解，其危害包括引起人和動物的高鐵血紅蛋白血癥(Methemoglobinemia)，并且是一種誘變劑和致癌劑，五氯硝基苯破壞肺、肝、腎的功能，并直接損害神經系統。因此，研究氯代硝基苯類化合物的生物降解對于保護環境及提高人類健康具有重要意義。
目前，國內外就氯代苯類或者硝基苯類有機物的生物降解進行了大量研究，而對芳環上同時存在氯原子和硝基的氯代硝基苯類化合物的研究報道則較少，其主要原因是當氯原子和硝基同時存在時，由于二者的吸電子特性，導致芳環裂解更加困難。許多能夠降解氯代苯或硝基苯等芳烴衍生物的菌種并不能降解對氯硝基苯。迄今，除了國外個別報道之外，單一菌種或混合菌種對氯硝基苯的降解能力、降解性質等所知甚少。因此，研究氯代硝基苯生物降解途徑、開發微生物菌種資源有著重要的意義。
發明內容
本發明的目的在于針對氯代硝基苯類芳香族化合物污染對環境造成的嚴重危害，提供了一種叢毛單胞菌CNB1和該菌用于治理工業廢水的生物治理技術，該菌是具有降解對氯硝基苯的叢毛單胞菌，在處理工業廢水和治理環境污染中可以應用。具體地說，涉及了一株睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液、固定化細胞菌可以降解對氯代硝基苯；該菌株能在含碳源、氮源或以對氯代硝基苯為為唯一碳源、氮源和能源的培養基生長，并將對氯代硝基苯完全降解利用。該菌株在以對氯代硝基苯為碳源、氮源和能源生長時，先將硝基還原成羥胺，然后在菌株產生的2-氨基酚1，6-雙加氧酶的作用下，通過間位開環的方式，將2-氨基-5-氯苯酚開環成烴類，從而進一步被降解利用。該菌株適用于生產對氯代硝基苯的工業廢水的生物處理和對氯代硝基苯污染土壤的生物修復(生物整治)。
本發明提供的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1菌株，于2003年11月04日，在北京保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC No.1028。
該菌具有以下特征(1)菌落特征在LB平板上培養2天的菌落大小位直徑1～2mm，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，凸起，無色。(2)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028的細胞形態特征適宜于pH6～11范圍內常溫培養，細胞為短桿狀，極毛2根，革蘭式染色陰性，細胞大小為0.45μm×1.5μm。(3)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028的生理生化特征好氧生長，積累PHB，接觸酶陰性，氧化酶陽性，不產生熒光色素，不水解淀粉和酪素，不液化明膠，能利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不能利用葡萄糖、木糖、核糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、棉籽糖、松三糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、果糖、鼠李糖、山梨醇、蔗糖、蜜二糖、麥芽糖、纖維二糖、L-精氨酸、β-丙氨酸、酒石酸鹽和乙醇；能利用L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、組氨酸和葡萄糖酸鈉。(4)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028的16SrRNA基因序列特征其16S rDNA具有如序列表所示的核苷酸序列，在GenBank中的登錄號為AY291591。
參照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的內容，根據其形態特征和生理生化特征，以及根據其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索結果，鑒定該菌(CGMCC No.1028)為睪丸酮叢毛單胞菌屬(Comamonas testosteroni)。
該菌具有較高的降解對氯硝基苯的能力，并且還可以降解鄰苯二酚、氯苯和苯胺等芳烴的衍生物。用Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028生長細胞進行降解試驗的結果表明，降解200mg/L的對氯硝基苯時，經過20h的培養，OD600可達0.12，對氯硝基苯的降解率達87％。該菌的最佳生長和降解條件為28℃，pH9.0。
睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028也可以在以部分芳烴的衍生物，如鄰苯二酚、氯苯、苯胺和對氯代硝基苯為唯一碳源的無機鹽基礎培養基中培養。應用前如在以對氯硝基苯為底物的基礎培養基中馴化則效果更好，菌株在20～40℃之間的一適當溫度下，進行好氧生長。
本發明提供的CGMCC No.1028菌能在碳源、氮源營養培養基，如普通牛肉汁、LB、營養瓊脂中培養或在以對氯硝基苯為為唯一碳源、氮源和能源的無機鹽基礎培養基中生長并降解利用對氯硝基苯，以下是以水為基質的無機鹽基礎培養基百份比組成(％)磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.05g，MgSO4·7H2O 0.003g，微量元素溶液0.5mL，對氯硝基苯20mg，pH7.0。固體培養基中加入1.5g％的瓊脂。121℃滅菌30min。
圖1 Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028以對氯硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長的生長和降解曲線圖2 Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028在不同溫度下的生長曲線圖3 Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028在不同pH條件下的生長曲線具體實施方案為了更好地理解本發明，通過一下實施實例予以進一步說明，但并非對本發明的限定。
實施例1睪丸酮叢毛單胞菌Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028的培養及生物學特征。
睪丸酮叢毛單胞菌Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028接種于無機鹽培養基中，培養基組成磷酸氫二鈉1g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，對氯硝基苯200mg，蒸餾水1000mL，pH7.0，固體培養基中加入15g/L的瓊脂。121℃滅菌30min。于28-30℃、130rpm的搖床上振蕩培養。該菌具有以下特征(1)在LB平板上培養2天的菌落大小為直徑1～2mm，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，凸起，無色。(2)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028的細胞形態特征適宜于pH6～11范圍內常溫培養，細胞為短桿狀，極毛2根，革蘭式染色陰性，細胞大小為0.45μm×1.5μm。(3)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028的生理生化特征好氧生長，積累PHB，接觸酶陰性，氧化酶陽性，不產生熒光色素，不水解淀粉和酪素，不液化明膠，能利用檸檬酸鹽和丙二酸鹽，不能利用葡萄糖、木糖、核糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、棉籽糖、松三糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、果糖、鼠李糖、山梨醇、蔗糖、蜜二糖、麥芽糖、纖維二糖、L-精氨酸、β-丙氨酸、酒石酸鹽和乙醇；能利用L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、組氨酸和葡萄糖酸鈉。
參照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的內容，根據其形態特征和生理生化特征，以及根據其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索結果，鑒定該菌(CGMCC No.1028)為睪丸酮叢毛單胞菌屬(Comamonas testosteroni)。
睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028可以在營養培養基，如普通牛肉汁、LB、營養瓊脂中培養，也可以在以部分芳烴的衍生物，如鄰苯二酚、氯苯、苯胺和對氯代硝基苯為唯一碳源的基礎培養基中培養。應用前如在以對氯硝基苯為底物的基礎培養基中馴化則效果更好，菌株在20～40℃之間的一適當溫度下，進行好氧生長。
該菌具有較高的降解對氯硝基苯的能力，并且還可以降解鄰苯二酚、氯苯和苯胺等芳烴的衍生物。用Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028生長細胞進行降解試驗的結果表明，降解200mg/L的對氯硝基苯時，經過20h的培養，OD600可達0.12，對氯硝基苯的降解率達87％。該菌的最佳生長和降解條件為28℃，pH9.0。
本發明提供的CGMCC No.1028菌能以對氯硝基苯為唯一碳源、氮源和能源的無機鹽基礎培養基中生長并降解利用對氯硝基苯，培養基組成(％)磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.05g，MgSO4·7H2O 0.003g，微量元素溶液0.5mL，對氯硝基苯20mg，pH7.0。固體培養基中加入15g/L的瓊脂。121℃滅菌30min。
CGMCC No.1028所產生的對氯硝基苯硝基還原酶的酶活測定方法為用紫外分光光度計檢測340nm處由于NADPH氧化成NADP+而引起的光吸收值的減少值，計算出還原酶的活力。反應體系包括0.3μmol對氯硝基苯，0.3μmol NADPH，50mmol/L磷酸鹽緩沖液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的細胞提取液，酶促反應總體積為3mL。NADPH的摩爾消光系數ε＝6.22mmol-1cm-1。1個單位(U)的酶活力定義為每分鐘轉化1nmole的NADPH所需的酶量。
CGMCC No.1028所產生的2-氨基酚1，6-雙加氧酶的酶活測定方法為2-氨基苯酚的反應產物2-氨基粘康酸半醛在380nm處有最大吸收峰，紫外分光光度計測定380nm處的光吸收值的增加量，可測得雙加氧酶的酶比活。反應體系包括0.3μmol 2-氨基苯酚，50mmol/L磷酸鹽緩沖液1mL，含有0.3～0.9mg蛋白的細胞提取液，酶促反應總體積為3mL。2-氨基粘康酸半醛的摩爾消光系數ε＝15.1mmol-1cm-1。1個單位(U)的酶活力定義為每分鐘生成1nmol的2-氨基粘康酸半醛所需的酶量。
實施例2Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028的16S rRNA基因的PCR擴增和序列測定Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028接種于LB平板，從平板中直接挑取一環菌體，加入100μL無菌重蒸水中，漩渦混勻后，沸水浴2min，12000r/min離心5min，上清液直接用于PCR。用于16SrDNA擴增的PCR反應的引物為一對通用引物。正向引物Pf5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物Pr5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’，分別對應于大腸桿菌的16S rRNA基因的8-27和1495-1514堿基。PCR反應體系(50μL)為10×buffer 5μL、25mmol/L MgCl24μL、10mmol/LdNTPs 1μL、30pmol/L引物各1μL、BSA 0.5μL、ddH2O.37μL、TaqDNA酶0.4μL。PCR反應條件為95℃ 4min，95℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 1min，30個循環；72℃ 10min，4℃保存。PCR產物的純化和測序由上海申能博彩生物科技有限公司完成。16S rDNA基因序列長度為1412bp，在GenBank中的登錄號為AY291591，與菌株Comamonastestosteroni isolate Q10的16S rDNA(登錄號為AF519533)序列的相似性為99％。其16S rDNA的核苷酸序列如序列表所示。
實施例3本發明提供的Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028對對氯硝基苯的降解預先在無機鹽培養基上培養的Comamonas testosteroni CNB1CGMCCNo.1028菌株培養液(OD600＝0.2)按1％的接入量接種于含有對氯硝基苯(20mg/L)的培養基中，在30℃，130r/min的搖床上振蕩培養，定時取樣測定菌體生長、對氯硝基苯含量和氯離子濃度，結果如圖1所示。圖1表明，CNB1菌的生長和對氯硝基苯的降解都有個短暫的遲緩期，然后進入對數期，到第20小時達到最高生長量，此時降解率達87％，并且對氯硝基苯摩爾數的減少與氯離子摩爾數的增加相當。
實施例4溫度對Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028降解對氯硝基苯的影響預先在無機鹽培養基上培養的Comamonas testosteroni CNB1CGMCCNo.1028培養液(OD600＝0.2)按1％的接入量接種于含有對氯硝基苯(20mg/L)的培養基中，在130rpm的搖床，不同的溫度條件下振蕩培養1天，測定細胞的生長和氯離子釋放，如圖2所示。圖2的結果表明，以對氯代硝基苯為唯一碳源和氮源培養，CNB1菌株細胞生長和對氯硝基苯的降解受溫度變化的影響，在28℃左右達到最高的生長水平和最高的底物降解率，高于或低于此溫度時細胞的生長和對氯硝基苯的降解都受到影響。
實施例5培養基初始pH對Comamonas testosteroni CNB1 CGMCC No.1028降解對氯硝基苯的影響預先在無機鹽培養基上培養的CNB1菌株培養液(OD600＝0.2)按1％的接入量接種于含有對氯硝基苯(200mg/L)的不同pH的培養基中，在30℃，130rpm的搖床上振蕩培養1天，結果見圖3。由圖3可見，菌株CNB1是比較適合在堿性的條件下生長，同時，在堿性的條件下的底物降解率也比較好，而且它的生長和降解隨pH的變化是一致的，pH9.0是細胞生長和對氯硝基苯降解的最佳pH。
一種降解對氯代硝基苯的睪丸酮叢毛單胞菌及其用途睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028的16S rDNA核苷酸序列序列表<110>中國科學院微生物研究所<120>一株降解對氯代硝基苯的睪丸酮叢毛單胞菌CNB1及其用途<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1368<212>DNA<213>Comamonas testosteroni CNB1<400>1gtcctagtag tgggggataa ctactcgaaa gagtagctaa taccgcatga gatctacgga 60tgaaagcagg ggaccttcgg gccttgtgct actagagcgg ctgatggcag attaggtagt120tggtggggta aaggcttacc aagcctgcga tctgtagctg gtctgagagg acgaccagcc180acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aattttggac240aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgcaggat gaaggccctc gggttgtaaa300ctgcttttgt acggaacgaa aagcctgggg ctaatatccc cgggtcatga cggtaccgta360agaataagca ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcaagcgtt420aatcggaatt ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttttg taagacaatg gtgaaatccc480cgggctcaac ctgggaactg ccattgtgac tgcaaggcta gagtgcggca gagggggatg540gaattccgcg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgcggag gaacaccgat ggcgaaggca600atcccctggg cctgcactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat660accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactggttgt tgggtcttaa ctgactcagt720aacgaagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt tgaaactcaa780
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1.一種具有降解對氯代硝基苯類芳香族化合物的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028。
2.根據權利要求1所述的睪丸酮叢毛單胞菌CGMCC No.1028，其16S rDNA具有如序列表所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的睪丸酮叢毛單胞菌CGMCC No.1028，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液、固定化細胞菌具有降解對氯代硝基苯的能力。
4.根據權利要求1所述的睪丸酮叢毛單胞菌CGMCC No.1028，該菌株能在含碳源、氮源或以對氯代硝基苯類芳香族化合物為唯一碳源、氮源和能源的培養基生長獲得。
5.根據權利要求4所述的培養基，包括普通牛肉汁、LB、營養瓊脂培養基，或在以部分芳烴的衍生物，如鄰苯二酚、氯苯、苯胺和/或對氯代硝基苯為唯一碳源的無機鹽基礎培養基。
6.根據權利要求5所述的無機鹽基礎培養基，以水為基質的無機鹽百份比組成(％)磷酸氫二鈉0.1g，磷酸二氫鉀0.05g，MgSO4·7H2O0.003g，微量元素溶液0.5mL，對氯硝基苯20mg，pH 7.0，上述的對氯硝基苯能用鄰苯二酚或氯苯或苯胺替代。
7.根據權利要求1、3、4、5和6所述的任選一項在治理對氯代硝基苯類芳香族化合物的污染中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1CGMCC No.1028菌株，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液、固定化細胞均可以降解對氯代硝基苯；該菌株能以對氯代硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長，同時將對氯代硝基苯完全降解利用。該菌株在以對氯代硝基苯為唯一碳源、氮源和能源生長時，先將硝基還原成羥胺，然后在菌株產生的2－氨基酚1，6－雙加氧酶的作用下，通過間位開環的方式，將2－氨基－5－氯苯酚開環成烴類，從而進一步被降解利用。該菌株適用于生產對氯代硝基苯的工業廢水的生物處理和對氯代硝基苯污染土壤的生物修復(生物整治)。
文檔編號C12N1/20GK1616650SQ20031011433
公開日2005年5月18日 申請日期2003年11月14日 優先權日2003年11月14日
發明者劉雙江, 吳建峰, 劉志培, 王保軍, 姜成英, 沈錫輝 申請人:中國科學院微生物研究所