一種改良的高比活植酸酶及其編碼基因和高效表達的制作方法

專利名稱：一種改良的高比活植酸酶及其編碼基因和高效表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種改良的植酸酶及其編碼基因。本發明還涉及含有該植酸酶基因的、能高效表達植酸酶的重組酵母細胞。
背景技術：
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一種能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。植酸酶廣泛存在于微生物中，如真菌中的曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；VanGorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)，酵母(NayiniN.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)；細菌中的枯草芽孢桿菌(Paver，V.K.J.，Bacteriol.1511102-1108，1982)，假單孢桿菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸桿菌(Shirai K.，Letters Appl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大腸桿菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)等。
植酸酶可廣泛應用于單胃動物飼料中(Ware J.H.et al.，USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，糞便中磷排泄量減少40％，還可降低植酸磷的抗營養作用。因此對提高畜牧業生產效益及降低植酸磷對環境的污染有重要意義。
通過基因工程手段使植酸酶基因在重組菌株中高效表達是植酸酶得以大規模廉價生產和實際應用的有效途徑。1995年Van Gorcomd等(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)將酸性植酸酶基因phyA重組到黑曲霉中，使植酸酶在重組菌株中的表達量達到了2.8×105U/mL，與天然植酸酶產生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生產成本。1997年姚斌等構建的基因工程酵母在小試水平上其酸性植酸酶的表達量達到5×105U/mL(相當于每毫升發酵液中表達5mg植酸酶蛋白)(姚斌等，中國發明專利97121731.9，2000)，中試水平上將表達量提高到1×106U/mL發酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger963中的植酸酶表達量高3000倍，比國外正在用于商品化生產酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent 5436156，1995)高一倍以上。最近姚斌等采用來源于大腸桿菌的高比活植酸酶基因構建了重組酵母，將植酸酶的表達水平提高到6×106以上(姚斌，生物工程學報，Vol20，No1，2004)。
植酸酶的pH特性是影響植酸酶實際應用效果的關鍵因素之一。植酸酶的作用場所是動物的胃腸道，而胃腸道的pH值是從約1.5～2.0逐漸升高到6.5～7.5，如果植酸酶在pH2.0～7.0的整個范圍內均能維持高活性，就能充分發揮植酸酶的效率，達到更好的飼喂效果。來源于大腸桿菌的植酸酶APPA具有高比活性的優點，是目前最具應用潛力的植酸酶。1999年，Rodriguez等(Rodriguez E.Arch Biochem Biophys，365262～267，1999)從豬糞中篩選的產植酸酶的大腸桿菌，并克隆到植酸酶基因appA，該基因全長1299bp，編碼432個氨基酸。appA基因除了與Bacillus sp.DS11植酸酶基因有47％同源性外，與其它來源植酸酶基因基本沒有同源性，酶學性質上也有較大差異。該植酸酶為6-植酸酶，是迄今所報道的比活最高的植酸酶(Golovan S.Can JMicrobiol，4659～71，2000)，比活可達3,000,000IU/mg左右。
APPA的最適pH是4.5，但它作用的pH范圍較窄，在pH2.5和pH6時，酶活性僅為最適酶活性的50％，這樣，它不能在動物整個的胃腸道中發揮高效率。

發明內容
本發明總的目的是通過DNA shuffing技術，對植酸酶基因appA進行突變，使突變后的植酸酶在pH性質上得到改良，在pH2～7的范圍內較原酶能維持更高的酶活性。進一步，利用生物反應器畢赤酵母(Pichia pastoris)高效表達此突變基因，使植酸酶得以廉價生產。
本發明的目的之一是對植酸酶APPA進行分子改良，使它在pH2～7的范圍內具有更高的酶活性。改良的植酸酶(定名為APPA-m)，與原植酸酶相比，有7個氨基酸的差異，分別由原來的+47A、+56P、+169R、+210C、+251M、+252P和+347D突變成+47D、+56Q、+169G、+210F、+251I、+252R和+347N。本發明中的植酸酶APPA-m在pH2～7的范圍內具有更高的酶活性。它在2.5和pH6.0時的酶活性有最適酶活性的70％以上，而原酶僅有50％左右。本發明的植酸酶具有圖4所示的氨基酸序列。
本發明的另一個目的是提供一種編碼本發明的植酸酶的DNA分子。所述的DNA分子可以具有圖3的核苷酸序列。
本發明的目的之三是提供改良后的appA-m基因在表達系統中高效表達的方法。包括整套重組表達載體的構建、受體菌的遺傳轉化方法、重組子的篩選與分子鑒定方法以及重組子中植酸酶表達方法。本發明采用畢赤酵母(P.pastoris)作為appA-m基因的表達受體，它為利用重組酵母工業化大規模、低成本發酵生產植酸酶奠定了基礎。
技術解決方案本發明的技術途徑如下1.基因突變 可采用的基因突變方法有定點突變、PCR致錯突變和DNA shuffling等。本專利中應用DNA shuffling技術(周佳海等，生物化學與生物物理進展，27655～657，2002)對植酸酶基因進行突變。將植酸酶基因appA經DNAase I消化成10～200bp的小片斷，經無引物PCR、引物PCR擴增后得到大量的突變分子。
2.基因克隆 按常規方法克隆(Maniatis T.，et al.Molecularcloning.New YorkCold Spring harbor laboratory，1982)。將上述植酸酶突變分子克隆到大腸桿菌載體pET-22b(+)上，同樣的方法也可克隆到大腸桿菌克隆載體或表達載體上，如pPUC18、pPGEM等，轉化大腸桿菌，獲得重組子。
3.改良植酸酶的篩選 對重組大腸桿菌表達的植酸酶進行性質測定，篩選出在pH得到改良的植酸酶基因，并進行序列測定。
4.重組高效表達體系的構建 選擇高效表達系統-P.pastoris作為表達植酸酶基因的生物反應器。通過體內重組使植酸酶基因整合到酵母的基因組上，篩選出陽性重組子。別的真核表達系統如桿狀病毒的昆蟲表達系統、霉菌表達系統、植物表達系統等也適應于此基因的高效表達。


圖1大腸桿菌重組載體pBY的物理圖譜圖2突變后的植酸酶APPA-m與原植酸酶AppA作用的pH特性系列1為AppA；系列2為APPA-m圖3appA-m基因DNA序列圖4推導出的appA-m編碼的氨基酸序列圖5重組酵母表達載體pFF02的物理圖譜圖6在5L發酵罐中不同誘導時間所積累的植酸酶的SDS-PAGE1為標準蛋白分子；2-10分別為誘導后0、12、24、36、48、60、72、96、108小時；具體實施方式
實驗條件1.菌株與載體 大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質粒pET-22b(+)等購自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His-Mut+)、質粒pFF01由加拿大Alberta大學D.Luo博士惠贈。
2.酶與試劑盒 限制性內切酶、連接酶、Taq酶、DNAaseI為Boehringer公司產品。PCR Kit均購于Promega公司。
3.生化試劑 DNA合成試劑為Milipore公司產品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產品。
4.培養基 大腸桿菌培養基為LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培養基為YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母轉化培養基為RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖]；酵母選擇培養基為MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖)；酵母誘導培養基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發酵培養基為10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖)；發酵中所用的微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸)。
實驗一本實驗說明進行植酸酶基因突變的程序。
取1μg植酸酶基因appA的DNA，用0.05U的DNAase I在室溫下處理5、10、15、20分鐘，通過電泳觀察DNA片斷大小，確定最佳酶解時間，使酶解產物大小集中在20～100bp。利用DNA膠回收試劑盒從電泳凝膠中回收20～100bp的DNA片斷。回收的片斷在無引物的情況下，進行PCR擴增，電泳回收大于原appA基因長度的DNA片斷，再進行引物PCR擴增。所使用引物根據appA基因的5’和3’端序列合成，2個引物序列分別為5’GAATTCATGAAAGCGATCTTAATC 3’和5’GAATTCTTACAAACTGCACGC 3’(下劃線部分為設計的EcoRI酶切位點)，擴增后進行凝膠電泳，回收大小與原appA基因相同的DNA片斷。這些DNA片斷中就包含了大量的突變的植酸酶基因分子。
實驗二本實驗說明進行突變植酸酶基因分子的克隆程序。
實驗一中獲得的DNA分子，用EcoRI酶切后，與經EcoRI酶切的載體pET-22b(+)于15℃連接過夜，轉化大腸桿菌E.coli DH5a，LB培養基上涂板后挑選陽性重組子，提取質粒進行酶切鑒定，得到重組子。每個重組子中含有一種植酸酶基因分子。重組質粒pBY圖譜見圖1。
實驗三本實驗說明進行突變植酸酶的篩選程序。
實驗二中得到的1000個重組子，分別接種到5mL LB培養液中，37℃培養至OD值0.6，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L，繼續培養2小時，誘導表達植酸酶。離心收集菌體，菌體重懸于5mL 0.25mol/L醋酸緩沖液(pH5.0)中，超聲波破碎菌體，15000rpm離心15分鐘去細胞碎片，上清液用于進行植酸酶酶活性測定。測定方法為0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 10％TCA終止酶活反應，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測定無機磷含量。對照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mL 10％TCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。一個酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1nmol無機磷所需酶量為一個酶活性單位。首先在pH4.5的條件下測定酶活性(A)，在此條件下有活性的重組子共有520個，進一步在pH2.0的條件下測定酶活性(B)，篩選出在B/A值大于60％的重組子(原酶的B/A值約為50％)，共得到重組子8個。進一步在pH6.0的條件下測定酶活性(C)，篩選出在C/A值大于60％的重組子(原酶的B/A值約為50％)，得到1個重組子，定名為EappA-m，初步篩選到在較廣pH范圍內能維持高活性的突變植酸酶。對EappA-m所產的植酸酶進行完整的pH性質測定，在不同的pH值(pH2.0、2.5、3.0、3.5的HCl-Gly緩沖液；pH4.0、4.4、5.0、5.5、5.8的HAc-NaAc緩沖液；pH6.0、6.5的咪唑-HCl；pH7.0、7.5、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液)下測定其酶活性，結果表明(圖2)，它在pH2～7的范圍內能維持高活性，明顯高于原酶APPA。
實驗四本實驗說明突變植酸酶APPA-m的序列。
對重組子EappA-m中的植酸酶基因appA-m進行序列測定，圖3為其核苷酸序列，圖4為其氨基酸序列。結果表明，與原酶相比，有8個堿基得到了突變，其位置分別在+140、+167、+505、+629、+753、+755、+1039和+1044，其中前7個堿基的突變造成了氨基酸的突變，分別由原來的+47A、+56P、+169R、+210C、+251M、+252P和+347D突變成+47D、+56Q、+169G、+210F、+251I、+252R和+347N。正是由于這些突變，使其pH性質得到改良。
實驗五本實驗說明appA-m在酵母表達載體上的構建程序。
用于構建酵母表達載體的質粒是pFF01(帶有α-因子分泌信號)。首先將植酸酶基因插入到上述表達載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，然后通過載體與酵母P.pastoris染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩定整合到酵母染色體上。具體的過程是將去除信號肽編碼序列的植酸酶基因appA-m用EcoRI從質粒pBY上酶切下后，電泳回收約1.3Kb的DNA片段，再將它們插入到載體pFY01上的EcoRI位點，得到了用于酵母轉化的重組表達載體-pFF02(圖5)。這樣就將帶有α-因子分泌信號的植酸酶基因克隆到了AOX1啟動子下游。
實驗六本實驗是說明酵母轉化及篩選重組酵母株系的程序。
質粒pFF02的DNA經DraI酶切后電擊轉化酵母細胞后，通過體內重組，目的基因將整合到受體酵母基因組中。在外源誘導物甲醇存在的條件下，AOX1啟動子可以啟動其下游基因的表達，并且信號肽可以指導表達產物進入酵母的分泌途徑，經過切割，外源蛋白產物最終分泌至胞外，所產生的植酸酶氨基酸序列按設計應與天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白經過這樣的代謝途徑，可以進行翻譯后修飾，例如糖基化等，從而得到具有生物活性的蛋白產物。
首先用2～3倍過量的內切酶DraI消化質粒pFF02的DNA，使之線性化，電泳檢測酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗兩次，冷凍干燥，無菌水溶解，取1～5μg DNA轉化畢赤酵母細胞，在RDB固體培養基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下將培養皿倒置培養至轉化子出現。
轉化子可在基本培養基RDB(不含His)上生長，而非轉化子不能生長，這是因為受體菌GS115為組氨酸缺陷型，而載體上雖然帶有his4基因，但沒有酵母復制子，所以載體上的his4基因必須整合進酵母基因組中才能表達。另外，由于重組的酵母細胞中AOX1基因受到破壞，所以它就不能再利用甲醇作為碳源。這樣，在以甲醇作為唯一碳源的培養基上轉化子就不會生長(或者生長極緩慢)，表現為甲醇利用缺陷型(mut-)。
用無菌牙簽從轉化平板RDB上挑取his+重組子，首先接種到MM固體培養基上，再接種到MD固體培養基上，如此挑取his+重組子，30℃培養2天。篩選在MD平板上生長正常但在MM平板上有一點生長或完全不生長的克隆子(his+mut-)即為陽性克隆子。
為了篩選得到高表達的重組酵母菌株，直接檢測誘導培養基中植酸酶的表達情況。將his+mut-轉化子首先在BMGY培養基中培養，待其生長至飽和狀態，離心棄BMGY，換入誘導培養基BMMY，在誘導培養36h后取上清液進行植酸酶酶活性分析。通過表達植酸酶的酶活性測定，從350株重組酵母中初步篩選到66株表達植酸酶的重組子，其中表達量最高的1株重組子，定名為P.pastoris appA-m-36。
實驗九本實施例是說明重組酵母在5升發酵罐中高密度發酵生產植酸酶的程序。
發酵過程分為三個階段。具體如下1)菌株培養階段。發酵培養基10×Basal Salts接種前先加入28％氨水使培養基的pH達到5.0，再按每升培養基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養18～24h，在培養過程中隨著菌株的生長，培養基中的溶氧量由100％逐漸降低，當碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80％以上，此時菌體濕重達到90～110g/L。2)碳源飼喂階段。流加25％葡萄糖(每升中含12mLPTM1)，流加量為28mL/h/L，培養4h。調整通氣量使溶氧量始終大于20％。此步結束時菌體濕重達到180～220g/L。3)誘導表達階段。加入誘導劑甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。在誘導過程中每12h取樣一次測定表達的植酸酶的積累量并進行表達蛋白的SDS-PAGE。
隨誘導時間增加發酵液中表達積累的植酸酶的SDS-PAGE分析見圖6。結果表明，表達的植酸酶隨誘導時間的增加而積累，在誘導108小時時達到高峰，酶活性達到6×106U/mL發酵液。表達的酶蛋白分子量大小約為45kD。以上結果證明植酸酶基因不僅得到了表達、有效分泌，且表達的植酸酶具有正常的生物學活性。
5’ATG AAA GCG ATC TTA ATC CCA TTT TTA TCT CTT CTG ATT CCG TTA ACC CCG CAA TCT GCATTC GCT CAG AGT GAG CCG GAG CTG AAG CTG GAA AGT GTG GTG ATT GTC AGT CGT CAT GGTGTG CGT GCT CCA ACC AAG GAC ACG CAA CTG ATG CAG GAT GTC ACC CAA GAC GCA TGG CCAACC TGG CCG GTA AAA CTG GGT TGG CTG ACA CCG CGA GGT GGT GAG CTA ATC GCC TAT CTCGGA CAT TAC CAA CGC CAG CGT CTG GTA GCC GAC GGA TTG CTG GCG AAA AAG GGC TGC CCGCAG TCT GGT CAG GTC GCG ATT ATT GCT GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA ACA GGC GAAGCC TTC GCC GCC GGG CTG GCA CCT GAC TGT GCA ATA ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACGTCC AGT CCC GAT CCG TTA TTT AAT CCT CTA AAA ACT GGC GTT TGC CAA CTG GAT AAC GCGAAC GTG ACT GAC GCG ATC CTC AGC GGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAC TTT ACC GGG CATCGG CAA ACG GCG TTT CGC GAA CTG GAA CGG GTG CTT AAT TTT CCG CAA TCA AAC TTG TGCCTT AAA CGT GAG AAA CAG GAC GAA AGC TTT TCA TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTCAAG GTG AGC GCC GAC AAT GTC TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA ATG CTG ACGGAG ATA TTT CTC CTG CAA CAA GCA CAG GGA ATC CGG GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACCGAT TCA CAC CAG TGG AAC ACC TTG CTA AGT TTG CAT AAC GCG CAA TTT TAT TTG CTA CAACGC ACG CCA GAG GTT GCC CGC AGC CGC GCC ACC CCG TTA TTA GAT TTG ATC AAG ACA GCGTTG ACG CCC CAT CCA CCG CAA AAA CAG GCG TAT GGT GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTGTTT ATC GCC GGA CAC GAT ACT AAT CTG GCA AAT CTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGGACG CTT CCC GGT CAG CCG AAT AAT ACG CCG CCA GGT GGT GAA CTG GTG TTT GAA CGC TGGCGT CGG CTA AGC GAT AAC AGC CAG TGG ATT CAG GTT TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAGCAG ATG CGT GAT AAA ACG CCG CTG TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACCCTG GCA GGA TGT GAA GAG CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCA GGT TTT ACG CAAATC GTG AAT GAA GCA CGC ATA CCG GCG TGC AGT TTG TAA 3’
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權利要求
1.一種改良的植酸酶，其特征在于，通過對植酸酶APPA的基因的突變，并表達該突變的植酸酶基因而獲得，且該改良的植酸酶在pH2.5和pH6.0時的酶活性達到最適酶活性的70％以上。
2.如權利要求1所述改良的植酸酶，其特征在于，在+47、+56、+169、+210、+251、+252和+347位的氨基酸發生了突變。
3.如權利要求2所述的改良的植酸酶，其特征在于，所說的氨基酸的突變是由原來的+47A、+56P、+169R、+210C、+251M、+252P和+347D突變成+47D、+56Q、+169G、+210F、+251I、+252R和+347N。
4.如權利要求1所述的改良的植酸酶，其特征在于，該酶蛋白具有如圖4所示的氨基酸序列。
5.一種編碼改良的植酸酶的基因，其特征在于，該基因是通過對植酸酶基因appA進行突變獲得的，其中在+140、+167、+505、+629、+753、+755、+1039和+1044位的堿基發生了突變，使改良的植酸酶在pH2.5和pH6.0時的酶活性達到最適酶活性的70％以上。
6.如權利要求5所述的改良植酸酶的基因，其特征在于，該改良植酸酶基因具有圖3所示的核苷酸序列。
7.如權利要求5所述的改良植酸酶的基因，其特征在于，所說的基因突變是定點突變、PCR致錯突變或DNA shuffing。
8.表達如權利要求5所述的改良植酸酶的基因的高效表達的方法，包括整套重組表達載體的構建、受體菌的遺傳轉化方法、重組子的篩選與分子鑒定方法及重組子中植酸酶基因的表達方法，其特征在于，利用高效表達系統畢赤酵母作為表達植酸酶基因的生物反應器。
9.如權利要求8所述的表達改良植酸酶的基因的高效表達方法，其特征在于，也可以利用桿狀病毒的昆蟲表達系統、霉菌表達系統、植物表達系統等其它的真核表達系統作為表達植酸酶基因的生物反應器
10.如權利要求8所述的表達改良植酸酶的基因的高效表達方法，其特征在于，大腸桿菌被用作克隆和表達該改良植酸酶基因的載體。
全文摘要
本發明提供了一種經改良的高比活植酸酶及其編碼基因，改良后的植酸酶較原植酸酶在酸性和中性pH下具有更高的酶活性。本發明還提供了含有本發明的植酸酶基因的重組酵母細胞。本發明的重組酵母中植酸酶的表達量可達到6×10
文檔編號C12N9/16GK1632110SQ200310112910
公開日2005年6月29日 申請日期2003年12月25日 優先權日2003年12月25日
發明者王軍, 張宏興 申請人:鄧州宇普生物工程有限公司