專利名稱：全封閉雙循環柱層析純化滅活病毒疫苗技術的制作方法
發明所屬領域本發明屬于生物制藥領域，涉及全封閉雙循環柱層析工藝，其整個純化過程無暴露工作，保證系統在密閉狀態下既完成洗脫和上樣交替操作以及洗脫和收集的交替操作，又保證了在待用狀態下不會進入氣泡，以及保證系統在任意時間或在管道中任何位置都可以排放氣泡。以上特點不僅省去了產品需經微孔濾膜除菌步驟，而且還保證最終產物無外源因子污染。
背景技術：
病毒顆粒經細胞培養繁殖出來后，需經滅活、分離純化等工藝后方能作為疫苗使用。目前的分離純化方法只是簡單的離心、超濾，雜質去除率只能達到98％，且產物最終需經用0.22μm的微孔濾膜過濾技術除菌，單此一項工藝目的的產物的含量將損失20-40％，故如何建立一個先進的純化技術來提高雜質的去除率以及避免除菌過濾而造成產物損失十分必要。
而且細胞培養病毒疫苗，在生產工藝上存在以下缺陷(1)疫苗不純，含有細胞碎片，這些碎片是人體的異性蛋白，它會導致人體局部或者全身變態反應。(2)效價低，很難達到WHO(世界衛生組織)所規定的2.5iu(國際單位)/毫升，所以只能以2毫升的含量代之。(3)被注射者疼痛感明顯，重者有變態反應。最近生物制品單位亦提出研制高純度的病毒疫苗，其路線是用超速離心技術，但是由于這種裝置價格昂貴；使用壽命短；生產投入比低而未能實現。
發明的技術內容本發明的目的是提供一個全封閉的雙循環層析柱工藝。
本發明的另一個目的是提供這個全封閉的雙循環層析柱工藝在純化狂犬病疫苗中的應用。
在本發明中涉及一個全封閉的雙循環層析柱工藝，其包括以下部分(1)上樣瓶(2)洗脫瓶(3)第一層析柱(4)第二層析柱(5)收集瓶整個純化過程無暴露工作，保證系統在密閉狀態下既完成洗脫和上樣交替操作以及洗脫和收集的交替操作，又保證了在待用狀態下不會進入氣泡，以及保證系統在任意時間或在管道中任何位置都可以排放氣泡。以上特點不僅省去了產品需經微孔濾膜除菌步驟，而且還保證最終產物無外源因子污染。
本發明還公開這個工藝在純化狂犬病疫苗中的應用。
狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一種病癥嚴重，病死率極高的自然疫源性傳染病，目前尚無有效的治療措施，唯一的控制方法是進行狂犬病疫苗的有效預防接種。目前的免疫接種分兩種類型一類為主動免疫，主要是為長期與貓、狗等動物接觸的工作人員和部分飼養寵物的家庭成員進行的一種預防措施。另一類為被動免疫，是指人被貓、狗等動物咬傷，抓傷后進行旨在抵御可能發生的狂犬病毒感染的一種免疫接種措施。然而，疫苗的質量即疫苗的免疫性和安全性是預防狂犬病的關鍵，我國是狂犬病高發區，因此格外重視對狂犬病疫苗的研制，最初的產品是用豚鼠腦生產的，不但副反應嚴重，而且產量極低，僅有少數人能得到使用。自地鼠腎細胞疫苗于1974年研制成功并批準使用后，狂犬病疫苗成為了一個大眾均能使用的藥品，產品也經歷了一個從淡苗到濃縮苗到純化苗的發展過程，1999年又開發成功了轉瓶工藝的傳代細胞純化苗，目前淡苗和濃縮苗均已被禁止使用，地鼠腎純化苗約占國內現有市場的三分之二，另外三分之一主要為采用轉瓶工藝生產的傳代細胞純化苗，法國巴斯德公司的生物反應器傳代細胞純化苗只占市場的很小部分。
國外的狂犬病疫苗生產和使用情況是兩極分化，發達國家全部使用生物反應器傳代細胞純化苗，但這些國家養犬管理規范，因而狂犬病發病率低，疫苗需求量小，而人口眾多的亞洲、非洲國家狂犬病發病率高，疫苗需求量大，但使用的絕大部分產品均為低技術的組織或原代細胞疫苗，且研制成功的還只是少部分國家。地鼠腎純化苗是國內目前預防狂犬病使用的主要疫苗，由于大量養殖地鼠(一只地鼠只能生產一人份的合格狂犬病疫苗)，人力和生產場地需求量大，生產效率低，且產品中殘留的動物來源的雜質對人體產生嚴重的副作用。由于動物個體間的差異，導致產品質量難以控制，批間差異很大。國家藥監部門最近頒令，人用疫苗必須使用清潔級動物，使得地鼠腎純化苗的生產成本大大增加，預計這類產品必將在二三年內被淘汰。現有的轉瓶工藝傳代細胞純化苗克服了地鼠腎純化苗因使用動物生產造成的弊病，但同樣存在手工操作，無法規模化生產，生產效率低，生產條件無法控制，產品質量不穩定，批間差異大等問題；進口產品保護作用強，副反應小，因而受到用戶喜愛，但由于價格昂貴，使得其不可能成為市場主導產品。
由于現有的生產工藝落后，合格的狂犬病疫苗遠遠滿足不了市場的需求，受利益驅使，大量效力低下的劣質產品充斥國內市場，導致近三年狂犬病發病和死亡人數異常持續上升，國家藥監部門有意整頓狂犬病疫苗市場，大力鼓勵和支持有條件的生產單位采用先進的生產工藝—生物反應器工藝，生產vero細胞狂犬疫苗逐步淘汰現有產品生產工藝，本發明把無菌LD50達107以上的狂犬病毒細胞培養液，進行去細胞離心處理，將其以1000×g 20分鐘離心處理，棄細胞，取上清，得到狂犬病毒液，把其加入到此雙循環系統中在密閉狀態下置于NT緩沖液(PH7.8)平衡好的SephadexG75柱上，用NT緩沖液洗脫，其流速為1毫升/分，同時上樣交替操作，洗脫同時收集得到的洗脫產物。并利用紫外分光光度計對平衡好的SephadeG75柱上洗脫的病毒液進行檢測，收集和合并病毒峰。將收集到的狂犬病毒加入1/4000～1/5000甲醛，再放入37℃恒溫室內，靜止或者旋轉24～34小時。最后，可采用INH方法對經滅活的狂犬病毒液進行無菌試驗、毒力試驗、安全試驗和效力試驗后即得到狂犬病毒疫苗。
本發明與背景技術相比，具有以下有益效果(1)提高了病毒的純度，本方法的雜質去除率為99.9％；(2)目的產物回收率高，狂犬病毒的回收率為80％；(3)效價可以超過2.5iu/ml的指標；(4)安全可靠，這是提高了純度和效價的必然結果。
圖1.全封閉雙循環系統層析柱系統連接圖具體實施例實施例① 棄細胞離心處理將無菌的LD50達到107以上的狂犬病毒細胞培養液合并，以1000×g 20分鐘離心處理，棄細胞，取狂犬病毒培養液。
實施例② 配制樣品用醋酸調PH值，將所取得的狂犬病毒液用醋酸將其PH值調到6.7，用機械或者人工方法，將調定到上述PH值培養液搖勻，再將之放于4℃的環境中，靜止20分鐘。再用Tris將其PH值調到7.8。
實施例③ 層析柱的處理用NT緩沖液(PH7.8)平衡好SephadexG75層析柱。
實施例④ 洗脫將上述狂犬病毒溶液上樣至用NT(PH7.8)平衡好的全封閉雙循環柱層析系統，用NT緩沖液洗脫，其流速為1毫升/分。
實施例⑤ 檢測與收集病毒利用紫外分光光度計對平衡好的SephadexG75柱上洗脫的病毒液進行檢測，收集并合并病毒峰。
權利要求
1.全封閉雙循環柱層析工藝，其特征是一個封閉的雙循環系統，其包括以下部分(1)上樣瓶(2)洗脫瓶(3)第一層析柱(4)第二層析柱(5)收集瓶
2.權利要求1所述的雙循環系統在純化滅活狂犬病毒疫苗中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種全封閉雙循環柱層析工藝，其整個純化過程無暴露工作，保證系統在密閉狀態下既完成洗脫和上樣交替操作以及洗脫和收集的交替操作，又保證了在待用狀態下不會進入氣泡，以及保證系統在任意時間或在管道中任何位置都可以排放氣泡。以上特點不僅省去了產品需經微孔濾膜除菌步驟，而且還保證最終產物無外源因子污染。
文檔編號C12N7/04GK1614011SQ20031011204
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月6日 優先權日2003年11月6日
發明者何春輝, 樂威 申請人:廣州市嘉合生物技術有限公司