專利名稱：造血細胞連續灌注懸浮培養過程細胞沉降截留裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于造血細胞連續灌注培養生物反應器系統的細胞截留裝置，具體地說涉及一種用于連續灌注培養過程中截留造血細胞的沉降分離裝置。
背景技術：
臍血造血干細胞移植在治療造血功能障礙，及惡性腫瘤患者放療后造血能力的恢復等方面有著良好的應用前景。但由于臍血的來源局限性，臍血造血干細胞數量不足已成為臍血造血干細胞移植研究和臨床應用的瓶頸，所以臍血造血干細胞體外大規模擴增的研究變得非常迫切。灌注培養過程因其能在培養過程中不斷更新培養基，維持良好的培養環境，有利于細胞擴增，而被認為是實現細胞高密度培養的有效途徑。
平板灌注腔被用來培養造血細胞，Koller等開發了無基質細胞的灌注式培養體系，成功地將CFU-GM擴增了17-19倍。這種培養腔包括多個微槽(與培養基流動的方向垂直)，它能提供均一的環境，允許營養物的擴散，但把細胞保留在腔體中，不易回收。固定床生物反應器也是實現造血細胞關注培養的一種構思，一般也需要采用一定的介質來截留細胞，同樣存在細胞難于回收的問題。
造血細胞懸浮培養在傳質和檢測方面具有優勢，在培養過程中有效截留細胞是懸浮灌注培養反應器系統開發的關鍵問題。旋轉絲網過濾是動物細胞(雜交瘤、CHO細胞等)連續灌注培養中常用的細胞截留裝置，該裝置通過旋轉過濾絲網分離細胞和培養基，該方法的顯著缺點在于絲網作為過濾介質容易被堵塞。造血細胞與一般動物細胞(雜交瘤、CHO細胞等)相比，細胞的均一性較差，故難于確定旋轉過濾絲網的轉速。此外，造血細胞對剪切較為敏感，高剪切會引起較大的細胞損傷，故不宜采用旋轉絲網過濾截留。膜過濾，特別是錯流膜過濾也被用來分離細胞與培養基，但膜過濾不僅同樣存在剪切較大和易被堵塞的問題，而且膜材料與造血細胞的生物相容性較差，所以會引起較大的細胞損傷。
沉降過程由于不存在堵塞失效問題，也被應用于成系動物細胞的截留。垂直細胞沉降器因必須保證沉降器截面向上的流速小于細胞的沉降速率，往往需要較大的橫截面積，從而使垂直沉降裝置體積龐大。細胞截留過程中，大量細胞懸液離開反應器的培養空間，加上細胞沉降沉降速率較小，致使細胞在反應器外的平均停留時間較長，不利于細胞的正常生長。傾斜式細胞沉降器利用細胞在狹槽中的沉降效應，能使細胞較快沉降到底面，但傾斜式沉降器操作中細胞回流的方向與沉降器內主體流動的方向相反，導致大量細胞沉積于沉降器底面，難于回流至反應器，同樣存在細胞在反應器外的平均停留時間較長的問題。大量細胞的積累會惡化沉降器內的培養環境，對細胞擴增不利。
王兆偉，譚文松等(ZL 00116518.6)提出的沉降器設計雖然能有效地進行雜交瘤細胞或其他成系動物細胞的截留，但由于該沉降器操作參數的確定需要確定臨界沉降速率，而造血細胞為非均一細胞群，其中干細胞、祖細胞和成熟細胞之間存在顯著的大小差異，難于確定臨界沉降速率，故操作困難。若對造血細胞進行細胞全截留時，又由于其沉降面長度較大和流場不易控制等，細胞易沉積于沉降器下底面無法順利回流，造成細胞損傷。一系列實驗也發現，該方法不適用于造血細胞連續灌注培養過程的細胞截留。
細胞沉降器的尺寸對細胞截留效果有較大的影響。沉降器截面的寬高比太小(＜1)時，細胞懸液在不同徑向高度的流速將出現較大的差異，造成沉降器內部流體的整體流動，不利于細胞沉降過程的控制，嚴重時徑向漩渦引起的返混，會破壞整個沉降過程的定態；沉降器截面的寬高比太大(＞5)時，懸液中的大量細胞易沉積于沉降器底面，不利于細胞的回收。
沉降器長度的確定是依據細胞的平均沉降速率通過模型計算加以設計的，對于造血細胞，沉降器長度過小會削弱沉降器的細胞截留能力，使部分個體較小的細胞隨上清液溢出；而沉降器長度過大，不但會加大沉降器的加工難度和材料成本，而且在操作中需要更長的系統穩定時間。所以本專利通過一系列的模型計算和實驗研究，確定了較為優化的寬高比和沉降器長寬比。
實驗表明，根據所述尺寸設計加工的沉降裝置，可有效截留造血細胞，并取得了較高的細胞截留效率。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是提供一種用于造血細胞連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，在造血細胞灌注培養系統中能有效截留細胞，而不引起較大細胞損傷、損失的造血細胞截留裝置。
本發明的技術構思顆粒沉降操作常被應用于液固分離的化工過程。1920年，醫師Boycotts首先報道了血細胞在傾斜狹槽中的沉降效應，之后許多學者對傾斜式沉降器的沉降現象進行了深入的理論研究，通過數學模型提出了上流式傾斜沉降槽工作流量的理論計算式S(vw)＝vw(L sinθ+b cosθ)其中為S(v)體積流量，v為顆粒沉降速率，L、w、b分別是沉降槽的長、寬、高，θ為沉降槽與垂直方向之間的傾角。
本發明公開的裝置首先使大多數細胞經過垂直沉降區快速回流，再利用造血細胞的Boycotts效應，使上溯細胞沉降到底面，上清液從沉降器上端的溢流口流出，有效截留細胞懸液中的造血細胞，回流反應器；少量沉積于沉降器底部的細胞在沉降器內靜態培養，最后用培養液沖洗回收。
本發明的技術方案一種用于連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器，其一端的上部設有進料口，沉降器對應于進料口位置的底部設有出料口，其另一端設有排液口和排氣口，進料口與排液口之間為傾斜沉降區，進料口與出料口之間為垂直沉降區，排氣口的作用是排除沉降器內的空氣。
沉降器可采用低毒生物玻璃制作，沉降器內部在使用前用硅化劑(二甲基硅烷2％/甲苯)進行硅化處理。管狀沉降器的寬度與高度之比為寬度∶高度＝1.5～3∶1；長度為寬度的15～30倍。
生物反應器來的細胞懸液從進料口流入，大部分活細胞在垂直沉降區沉降，并從底端出料口流出，回流至生物反應器；少量細胞向上流動，在傾斜沉降區；沉降上清液從上部的排液口排出，工作前沉降器內的空氣從排氣口排出。
本發明的優點在于避免了平板灌注腔或固定床培養反應器細胞難于回收的問題，細胞容易回收，避免了旋轉絲網過濾和膜過濾的堵塞失效問題，解決了其它截留裝置所用材料的生物相容性較差的問題，本裝置內部由垂直沉降區和傾斜沉降區組成，兼有兩者的優點，減少了細胞在沉降器底面的沉積，有效縮短了截留過程中細胞在反應器外的平均停留時間。采用水浴夾套能使沉降器內沉積細胞處于相對穩定的環境，加上定時通過使細胞回流，可緩解沉積引起的細胞損傷，。
圖1為細胞沉降截留裝置結構示意圖。
圖2為矩形沉降器橫截面圖。
圖3為細胞密度隨時間的變化。
圖4為造血細胞截留效果。
圖5為為上清液取樣和沖洗回流后沉降器下底面的顯微照片。
具體實施例方式
一種用于連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器1，其一端的上部設有進料口2，沉降器1對應于進料口2位置的底部設有出料口3，其另一端設有上清液的排液口4和排氣口5，進料口2與排液口4之間為傾斜沉降區，進料口2與出料口3之間為垂直沉降區。
所說的矩形的管狀沉降器1的寬度L與高度H之比為寬度∶高度＝1.5～3∶1；管狀沉降器1的長度為寬度的25～35倍；進料口2，出料口3與沉降器1底面的夾角為40～50°，上下構成垂直沉降區，進料口2與排液口4之間構成傾斜沉降區。
進一步，在沉降器1外設有夾套6，用于通入保溫流體(37C°)，以緩解少量細胞在沉降器底面沉積引起的細胞損傷。
實施例1細胞分離與培養從新鮮臍血(取自中國福利會婦幼保健院)分離得到單個核細胞(MNCs)，用含20％FBS的IMDM培養基(Gibco BRL，USA)重新懸浮，添加SCF、IL-3和IL-6三種細胞因子，其濃度分別為50ng/ml、20ng/ml和40ng/ml，以1×106cells/ml接種至轉瓶中，置于37℃、5％CO2、濕度飽和的二氧化碳培養箱中培養備用。
實驗方法細胞懸液從沉降裝置底端上進料口2流入，從底端下表面的出料口3流出，清液從位于上端的排液口4排出，水浴夾套通以37℃水保溫。
結果考察了沉降過程達到穩定前的，排液口4和出料口3的細胞密度變化，如圖3。可以看出，沉降過程穩定時間約為50min。沉降過程穩定后，溢流出口細胞密度穩定在較低的水平。
分析了沉降過程的細胞截留效果，沉降過程穩定后，總細胞的截留狀況和截留比，如圖4。進口流量在一定程度上會影響整體截留效果，進口流量較大時(50mL/h)，總細胞密度截留率為91.88％，進口流量較小時(20mL/h)，總細胞密度截留率達到96.47％。
沉降器內沉積細胞的顯微照片，上清液取樣和沖洗回流后沉降器下底面的顯微照片見圖5。圖中，31為沉積于底面的細胞，32溢流口的細胞碎片，33沖洗后的沉降器底面。本實驗結果說明本裝置在一定實驗條件下能有效截留造血細胞。
權利要求
1.一種用于造血細胞連續懸浮灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器(1)，其一端的上部設有進料口(2)，沉降器(1)對應于進料口(2)位置的底部設有出料口(3)，其另一端的上底面設有上清液的排液口(4)和排氣口(5)。
2.根據權利要求1所述的連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，管狀沉降器(1)的長度為寬度的15～30倍。
3.根據權利要求1所述的連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，進料口(2)，出料口(3)與沉降器(1)底面的夾角為40～50°。
4.根據權利要求14任一項所述的連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，沉降器(1)外設有水浴夾套(6)。
5.根據權利要求1所述的連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，沉降器采用低毒生物玻璃制作，沉降器內部經硅化液硅化處理。
6.根據權利要求1所述的連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，管狀沉降器與垂直方向的夾角為40～50°。
7.根據權利要求1所述的連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，其特征在于，所說的細胞為造血細胞，包括臍帶血或骨髓來源單個核細胞及在其基礎上分離得到的細胞群。
全文摘要
一種用于造血細胞連續灌注培養生物反應器系統的細胞沉降截留裝置，包括斜置的橫截面為矩形的管狀沉降器，其一端的上部設有進料口，沉降器對應于進料口位置的底部設有出料口，其另一端的上底面設有排液口和排氣口，本發明的優點在于避免了平板灌注腔或固定床培養反應器細胞難于回收的問題，細胞回收方便，避免了旋轉絲網過濾和膜過濾的堵塞失效問題，解決了其它截留裝置所用材料的生物相容性較差的問題，本裝置內部由垂直沉降區和傾斜沉降區組成，兼有兩者的優點，減少了細胞在沉降器底面的沉積，有效縮短了截留過程中細胞在反應器外的平均停留時間。
文檔編號C12M3/00GK1546642SQ20031010926
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月10日 優先權日2003年12月10日
發明者譚文松, 姜華, 蔡海波, 遲占有 申請人:上海伯瑞生物技術發展有限公司, 華東理工大學