一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)60年代Nass M.等首次用電子顯微鏡直接觀察到線粒體內(nèi)細(xì)絲狀的DNA以來(lái)(Nass M M K.，et al.1963)，至上世紀(jì)80年代末90年代初，人們對(duì)線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)結(jié)構(gòu)與遺傳特性的研究更為深入，mtDNA分析方法已滲入傳統(tǒng)的分類(lèi)、系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳、法醫(yī)學(xué)及人類(lèi)學(xué)等研究領(lǐng)域，并逐步成為這些領(lǐng)域重要的研究工具。由于技術(shù)條件的限制，早期應(yīng)用mtDNA的工作主要是對(duì)mtDNA進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，自聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)出現(xiàn)以及DNA序列測(cè)定技術(shù)推廣以來(lái)使得對(duì)mtDNA的分析更加簡(jiǎn)便，特別是非損傷性DNA分析技術(shù)的建立克服了以往取樣的困難?，F(xiàn)在，可利用毛發(fā)、干皮張標(biāo)本、液體浸泡標(biāo)本、石蠟包埋組織、骨骼、木乃伊、化石、甚至動(dòng)物糞便和尿液等材料提取并擴(kuò)增出特定的mtDNA片段用于序列分析(Cockbuurn A，et al.1980；方盛國(guó)等，1997；Matthias H，et al.1993；PaaboS，et al.1988)。1988年，Pabbo等人首先從7000年前的人腦中擴(kuò)增出mtDNA片段，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)代的美洲土著人中未曾發(fā)現(xiàn)的線粒體基因型(Paabo S，et al.1988)。此后，有關(guān)mtDNA用作分子標(biāo)記進(jìn)行分類(lèi)學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳、人類(lèi)學(xué)、法醫(yī)學(xué)等方面研究的成果層出不窮(Pavel L I.et al，1996；于寧等，1998；Yun N.et al.2000；Vigilant L，et al.1991)。
同動(dòng)物mtDNA相比較，高等植物的線粒體基因組(mitochondrial DNA，mtDNA)主要具有以下特點(diǎn)1)大小差異很大，介于208×103bp(油菜)與2500×103bp(西瓜)之間。不僅科間差異大，即使同是葫蘆科的植物間也可相差7～8倍(Levings III C S，et al.1989)；2)基因組的存在形式很不相同。一般認(rèn)為呈環(huán)狀(Levings III C S，et al.1989)，但也有人報(bào)道玉米S型CMS材料的mtDNA呈線型(Schardl C L，et al.1984)，更有人根據(jù)分離的mtDNA分子主要是線型的結(jié)果認(rèn)為植物mtDNA以線型為主，環(huán)狀僅是復(fù)制的一種暫時(shí)狀態(tài)(Bendich A T.et al.1993)；3)存在大量的非編碼序列(Gray M W，et al.1992)；4)發(fā)現(xiàn)有其它細(xì)胞器漂流而來(lái)的DNA成分，即漫游DNA(Ellis J.1982)；5)線粒體基因存在嵌合現(xiàn)象，并能編碼出新的閱讀框架(Bonen L，et al.1993)；6)線粒體中還存在大量的類(lèi)質(zhì)粒DNA或RNA質(zhì)粒，且類(lèi)質(zhì)粒DNA在不育系和保持系間表現(xiàn)特異分布(Levings III C S，et al.1989；Newton K J，et al.1988)。
運(yùn)用線粒體基因組序列進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定的報(bào)道已屢見(jiàn)不鮮，這些報(bào)道主要有三個(gè)特點(diǎn)1)所研究的多以動(dòng)物的線粒體基因組為主。2)所采用的證據(jù)標(biāo)本多以犯罪嫌疑人或受害者或其家屬身上攜帶的遺傳信息為主，如毛發(fā)、血跡等。3)所用的檢測(cè)試劑盒都是從國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格非常昂貴。這樣，不僅大大限制了能夠提供證據(jù)的范圍和數(shù)量，也使受害家庭不堪負(fù)重。若能從案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)及犯罪嫌疑人身上找到除了人和動(dòng)物標(biāo)本作為證據(jù)外的其它遺傳信息，并對(duì)此進(jìn)行基因組DNA和RFLP分析，根據(jù)植物線粒體的特點(diǎn)，將犯罪嫌疑人攜帶的標(biāo)本與作案現(xiàn)場(chǎng)獲得的標(biāo)本進(jìn)行同一性鑒定，不僅能夠提供更充分的證據(jù)，同時(shí)也能擴(kuò)大所得證據(jù)的范圍和數(shù)量，使犯罪分子早日伏法。但以植物線粒體基因組序列為手段設(shè)計(jì)引物，并進(jìn)行法醫(yī)學(xué)鑒定至今尚未見(jiàn)報(bào)道。
由于植物線粒體基因組序列具有變化相差巨大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣(基因組呈現(xiàn)環(huán)狀、線狀；點(diǎn)突變、缺失、置換、倒位等)、DNA漂移、以及質(zhì)粒和類(lèi)質(zhì)粒等的存在，這對(duì)線粒體基因組的測(cè)序帶來(lái)了很大的不便，致使到目前為止，在互聯(lián)網(wǎng)上公開(kāi)的植物線粒體基因組屈指可數(shù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。本文正是根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)，按照擬南芥為依據(jù)設(shè)計(jì)了一系列的引物，PCR擴(kuò)增并用2％的瓊脂糖凝膠分離，無(wú)論是不同引物對(duì)同一物種或同一引物對(duì)不同物種，都在一定程度上對(duì)不同植物加以區(qū)分。
引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。引物設(shè)計(jì)需遵循一定的規(guī)則，否則達(dá)不到預(yù)期的目的。因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)，我們的原則是1)根據(jù)國(guó)外的相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道和引物設(shè)計(jì)軟件的原理，所設(shè)計(jì)的引物必須是保守序列，且每一對(duì)引物之間所要擴(kuò)增的序列在不同物種當(dāng)中存在差異(包括點(diǎn)突變、缺失、置換、倒位等)，這種差異至少存在于兩個(gè)以上的物種之間；包含的物種越多，引物的質(zhì)量就越高。2)要設(shè)計(jì)的每一對(duì)引物必須以一種已知線粒體基因組序列的物種為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)。3)要確證已知的線粒體基因組序列存在序列多態(tài)性。4)設(shè)計(jì)的所有引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，必須在相同的條件下進(jìn)行，這樣，才能進(jìn)行高通量的PCR，減少不必要的工作量。5)所設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度要適合以增加引物的特異性。6)堿基隨機(jī)分布引物中4種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚膘吟或聚嘧啶的存在。7)引物自身引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)形成引物本身復(fù)性。8)引物之間兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。
由于法醫(yī)學(xué)所提供證據(jù)的多樣化以及不可預(yù)測(cè)性，以及線粒體基因組的相對(duì)穩(wěn)定性，針對(duì)植物線粒體基因組的特點(diǎn)，若按照一定的引物設(shè)計(jì)原則，建立一個(gè)以覆蓋整個(gè)線粒體基因組PCR引物為基礎(chǔ)用以區(qū)分任何不同物種的線粒體基因組PCR引物數(shù)據(jù)庫(kù)，顯得尤為突出和重要。同時(shí)應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)研究與線粒體基因控制的生物學(xué)特性的相關(guān)基因克隆、生物學(xué)功能及其作用機(jī)理、法醫(yī)學(xué)鑒定將具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
從國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站http//www.ncbi.nih.hlm.gov中查找擬南芥(ababidopsisthaliana)、水稻(oryza sativa)、高粱(grain sorghum)、小麥(wheat)和煙草(tobacco)等幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運(yùn)用DNAtools和ClusterW等相關(guān)軟件進(jìn)行序列比較，挖掘其相對(duì)保守的序列(長(zhǎng)度為20～25bp)，對(duì)這些保守序列進(jìn)行網(wǎng)上查詢(xún)，觀察其所在物種的數(shù)量并遵循上述引物設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)了一系列的引物。然后從各種不同的植物當(dāng)中抽提基因組DNA和線粒體DNA，以此為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。對(duì)所合成的引物進(jìn)行篩選。
綜上所述，運(yùn)用線粒體基因組自身的特點(diǎn)，按照上述引物設(shè)計(jì)原則，以其保守序列進(jìn)行一系列的引物設(shè)計(jì)，并進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以對(duì)不同的植物加以區(qū)分，對(duì)研究與線粒體基因控制的生物學(xué)特性的相關(guān)基因克隆、生物學(xué)功能及其作用機(jī)理、法醫(yī)學(xué)鑒定將具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法。
方法的步驟為1)從新鮮的或干枯的植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體基因組DNA；2)從國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站中查找擬南芥、水稻、高粱、小麥和煙草幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運(yùn)用DNAtools和ClusterW相關(guān)軟件進(jìn)行序列比較，挖掘其相對(duì)保守的序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件DNAUser軟件設(shè)計(jì)引物；3)以提取的基因組DNA和線粒體DNA為模板，對(duì)2)當(dāng)中的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；4)對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分析。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)以植物線粒體基因組序列為手段設(shè)計(jì)引物，并用于法醫(yī)學(xué)鑒定；2)可以以此為思路，按照一定的引物設(shè)計(jì)原則，擴(kuò)大到整個(gè)線粒體而進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，建立一個(gè)以覆蓋整個(gè)線粒體基因組PCR引物為基礎(chǔ)用以區(qū)分任何不同物種的線粒體基因組PCR引物數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)研究與線粒體基因控制的生物學(xué)特性的相關(guān)基因克隆、生物學(xué)功能及其作用機(jī)理、法醫(yī)學(xué)鑒定將具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。3)應(yīng)用該方法設(shè)計(jì)的引物應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)進(jìn)行同一性鑒定，可以大大降低費(fèi)用。目前應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)所用的檢測(cè)試劑盒都是從國(guó)外進(jìn)口，價(jià)格非常昂貴。這樣，不僅大大限制了能夠提供證據(jù)的范圍和數(shù)量，也使受害家庭不堪負(fù)重。若能從案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)及犯罪嫌疑人身上找到除了人和動(dòng)物標(biāo)本作為證據(jù)外的其它遺傳信息，并對(duì)此進(jìn)行基因組DNA和RFLP分析，根據(jù)植物線粒體的特點(diǎn)，將犯罪嫌疑人攜帶的標(biāo)本與作案現(xiàn)場(chǎng)獲得的標(biāo)本進(jìn)行同一性鑒定，不僅能夠提供更充分的證據(jù)，同時(shí)也能擴(kuò)大所得證據(jù)的范圍和數(shù)量，使犯罪分子早日伏法。另外，該方法具有高敏感性和特異性、穩(wěn)定性好以及不需要特殊儀器設(shè)備、易于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。


圖1.引物1-12對(duì)薺菜染色體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖2.引物1-12對(duì)玫瑰染色體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖3.引物1-12對(duì)醡漿草染色體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖4.引物1-12對(duì)茶樹(shù)染色體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，圖中，1-12分別為引物1-12；圖5.引物10、13對(duì)芹菜、大白菜、甘藍(lán)、菠菜、玫瑰、茶樹(shù)和香菜的電泳圖，圖中，左邊一組是引物10，右邊一組為引物13；圖6.引物6、7對(duì)芹菜、大白菜、甘藍(lán)、菠菜、玫瑰、茶樹(shù)和香菜的電泳圖，圖中，左邊一組是引物6，右邊一組為引物7。
具體實(shí)施例方式
以下具體實(shí)驗(yàn)步驟有關(guān)的其他未列出的常用試劑及其配制方法請(qǐng)參考文獻(xiàn)DNA PROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)書(shū)籍如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(1989年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社。
實(shí)施例1植物基因組DNA的提取
在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液I，60℃水浴預(yù)熱。水稻幼苗或葉子5～10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動(dòng)混勻，60℃水浴保溫30～60min(時(shí)間長(zhǎng)，DNA產(chǎn)量高)，不時(shí)搖動(dòng)。加20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻(需帶手套，防止損傷皮膚)，室溫靜置5～10min，使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。室溫5000rpm離心5min。仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻棒撈出DNA絮團(tuán)，干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含TE的離心管中，DNA很快溶解于TE。若DNA未形成絮狀沉淀，則可用5000rpm離心5min，再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀，往往難溶于TE，可在60℃水浴置15min以上，以助溶。將DNA溶液3000rpm離心5min，將上清倒入干凈的5ml離心管。加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA對(duì)DNA的操作、分析一般無(wú)影響，可省略該步驟)。加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃置20min左右，DNA形成絮狀沉淀。用玻棒撈出DNA沉淀，70％乙醇漂洗，吸水紙吸干。將DNA重溶于1ml TE，-20貯存。取2μl DNA樣品在0.7％Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取15μl稀釋20倍，測(cè)定OD260/OD280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。分裝后存放于-20℃。
實(shí)施例2植物線粒體基因組的提取所需試劑STE緩沖液400mM蔗糖，50mM Tris(pH7.8)，20mM EDTA，0.2％牛血清白蛋白，0.2％β巰基乙醇。
ST緩沖液400mM蔗糖，50mM Tris(pH7.8)，20mM EDTA，0.1％牛血清白蛋白。
TEN緩沖液100mM Tris(pH7.2)，50mM EDTA，100mM NaCl和0.2％β巰基乙醇。
NETF緩沖液1.25M NaCl，50mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，50mM NaF。
1M醋酸鎂5M醋酸銨5M醋酸鉀20％SDS1M EDTA苯酚(用Tris(pH8.0)飽和)
苯酚∶氯仿＝1∶1氯仿∶異戊醇(24∶1)96％和70％乙醇異丙醇DNA酶(一)線粒體的分離1)準(zhǔn)備STE緩沖液。加入BSA和β巰基乙醇。
2)將樣品漂洗(0℃)，隨后的步驟都要求在0℃進(jìn)行。
3)將樣品用20ml STE緩沖液勻漿。
4)用50μm尼龍膜過(guò)濾并用4,000rpm離心20min。
5)丟棄核酸沉淀，12,000rpm離心20min。
6)用毛筆輕輕懸浮沉淀，12,000rpm離心20min。
加入不超過(guò)200μl的ST緩沖液，用毛筆輕輕懸浮沉淀。DNA酶用含有0.02M醋酸鎂的新鮮的ST緩沖液溶解，并加入植物材料，使DNA酶的終濃度為25μg/mlDNA酶每克材料。DNA酶和Mg/EDTA的比例對(duì)完全去除核DNA是很重要的。醋酸鎂可以用氯化鎂或硫酸鎂代替(Herrmann，1982)。DNA酶處理在37℃進(jìn)行20分鐘(Crouzillat et al.，1987)。用NETF緩沖液除去DNA酶(Loeb和Chouvean，1969)。
(二)線粒體基因組的提取7)不超過(guò)200μl的ST緩沖液重新懸浮細(xì)胞器。
8)在加有0.02M醋酸鎂的0.2ml ST緩沖液溶解125μgDNA酶，并加入細(xì)胞器懸浮液。調(diào)節(jié)終體積到0.5ml。DNA酶的終濃度為250μg/ml。
9)37溫浴20min，定時(shí)混合(Crouzillat et al.，1987)。
10)加入EDTA使終濃度為0.2M，用以終止反應(yīng)。
11)用NETF緩沖液除去DNA酶(Loeb和Chouvean，1969)。緩沖液越多，效果越好。離心收集線粒體細(xì)胞器。
12)-20℃保存，或馬上裂解。
13)用600μl TEN緩沖液重新懸浮細(xì)胞器(0℃)，滴加30μl的20％SDS，不斷地振蕩混合液。
14)如果組織聚合在一起，將試管放入60℃水浴，直到組織完全裂解。
15)去除蛋白。加入等體積的平衡酚后劇烈振蕩5min。12,000rpm離心10min。
16)去除上層水相。加入苯酚/氯仿重復(fù)上述步驟。加入氯仿/異戊醇重復(fù)上述步驟。
17)用1/10體積的5M醋酸銨和等體積的異丙醇，-20℃放置2～3小時(shí)或過(guò)夜。12,000rpm離心3～5min。用70％的乙醇洗滌DNA，然后，用無(wú)水乙醇去除殘留的鹽分。
18)室溫干燥后，加入20μl TE緩沖液溶解。
19)DNA完全溶解后，加入150μl TEN緩沖液。
20)加入10μl 20％的SDS，65℃溫浴15min。加50μl 5M的醋酸鉀，65℃搖動(dòng)混合物幾分鐘，直到沉淀溶解。
21)-20℃放置30min。12,000rpm離心10min。
22)收集上清液。
23)加入10μl 5M的醋酸鉀和100μl異丙醇，混合后-20□放置30min。
24)12,000rpm離心10min。分別用70％和96％的乙醇洗滌DNA沉淀，室溫干燥后重新溶解于TE緩沖液中。
實(shí)施例3運(yùn)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所需試劑①10×PCR反應(yīng)緩沖液500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％Triton X-100。
②MgCl225mmol/L。
③4種dNTP混合物每種2.5mmol/L。其④Taq DNA聚合酶5U/μl。
⑤T4 DNA連接酶及連接緩沖液。
⑥經(jīng)Sma I酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。
⑦其它試劑礦物油(石蠟油)，1％瓊脂糖，5×TBE，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，無(wú)水乙醇和70％乙醇。
PCR反應(yīng)操作步驟①依次混勻下列試劑35μl H2O5μ10×PCR反應(yīng)緩沖液4μl 25mmol/L MgCl24μl 4種dNTP0.5μl上游引物(表1)0.5μl下游引物(表1)
0.5μl模板DNA(約1ng)混勻后離心5秒。
②將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
③用94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
表1.設(shè)計(jì)的引物名稱(chēng)和引物序列P1F 5’-ACGGCCTGTATTCGGAGTTT-3’P1R 5’-ATACGGGGATGACTTGTGGC-3’P2F 5’-GCTTCTCGCTGGAGACTCGG-3’P2R 5’-TTAAGCGGAAACCTGATGGC-3’P3F 5’-AAACCCAACTCACGTACCAC-3’P3R 5’-AAGGACCAATCCTGAAAGAC-3’P4F 5’-TTCTCGCTGGAGACTCGGG-3’P4R 5’-CTTTGAGTGAAGGCAGCATA-3’P5F 5’-CCAGCACCGGGCAGGTGTCA-3’P5R 5’-AAGGAACTCGGCAAAATGAC-3’P6F 5’-GCCTGTTATCCCCGGCGTAC-3’P6R 5’-GTCGCATAAGTAGCGACCTG-3’P7F 5’-CCTCGGGTTCGTAGAGTCGG-3’P7R 5’-GTCAGATCGTTCCTGCGTTT-3’P8F 5’-ACTAACTCTGCCTGGGGTGG-3’P8R 5’-CTCCTTCGTATAGGTTCCGT-3’P9F 5’-GTTTCCCGTTTACCCACAAC-3’P9R 5’-GTCAGATCGTTCCTGCGTTT-3’P10F 5’-AATACGAGACGATGGAATGC-3’P10R 5’-CCGTCCACGAGGCTGTAAAA-3’P11F 5’-CCCGCTGATCCGAAGTGATT-3’P11R 5’-GCTTTCGTCTCGGTAGGTGT-3’P12F 5’-CCGGGTGTTTTCCAGTGGTC-3’
P12R 5’-GTAAAGATGCGTAGTAGCGT-3’P13F 5’-CGGACATCTGCAACGTCCTC-3’P13R 5’-GTAAAGATGCGTAGTAGCGT-3’P14F 5’-CGTCGGAACGGTCGGTGGCT-3’P14R 5’-AGGCCTAGTCTGATCTGAGA-3’P15F 5’-CGTCGCCGGTCCGGCTTAAT-3’P15R 5’-CTCCTTCGTATAGGTTCCGT-3’P16F 5’-TATGGTTCTTTGTAGGCTCT-3’P16R 5’-TAAGGATACGGTAAAACAGG-3’實(shí)施例4瓊脂糖凝膠電泳所需試劑①5×TBE電泳緩沖液稱(chēng)取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0)20ml，定容至1000ml。
②6×電泳載樣緩沖液0.25％溴粉藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液，貯存于4℃。
③溴化乙錠(EB)溶液母液將EB配制成10mg/ml，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲(chǔ)于室溫即可。
瓊脂糖凝膠電泳①取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。
②膠液的制備稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)。
③膠板的制備將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg/ml(也可不把EB加入凝膠中，而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時(shí)的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現(xiàn)氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒(méi)過(guò)膠板上表面。因邊緣效應(yīng)樣品槽附近會(huì)有一些隆起，阻礙緩沖液進(jìn)入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應(yīng)注滿(mǎn)緩沖液。
④加樣取10μlPCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。每加完一個(gè)樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。
⑤電泳加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳。
⑥染色未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25min。
⑦觀察和拍照在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃面罩，以免損傷眼睛。經(jīng)照相機(jī)鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機(jī)固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時(shí)間10-120秒(根據(jù)熒光條帶的深淺選擇)。
權(quán)利要求
1.一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，方法的步驟為1)從新鮮的或干枯的植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體基因組DNA；2)從國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站中查找擬南芥、水稻、高粱、小麥和煙草幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運(yùn)用DNAtools和ClusterW相關(guān)軟件進(jìn)行序列比較，挖掘其相對(duì)保守的序列，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件DNAUser軟件設(shè)計(jì)引物；3)以提取的基因組DNA和線粒體DNA為模板，對(duì)2)當(dāng)中的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；4)對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說(shuō)的提取植物基因組DNA在50ml離心管中加入20ml DNA提取緩沖液，60℃水浴預(yù)熱；植物葉片5～10g，剪碎，在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中，劇烈搖動(dòng)混勻，60℃水浴保溫30～60min，不時(shí)搖動(dòng)；加20ml氯仿/異戊醇/乙醇溶液，顛倒混勻，室溫靜置5～10min，使水相和有機(jī)相分層，室溫6000rpm離心5min；仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管，加入1倍體積異丙醇，混勻，室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。用鉤狀玻棒撈出DNA絮團(tuán)，干凈吸水紙上吸干，轉(zhuǎn)入含1ml TE緩沖液的1.5ml離心管中，待DNA溶解后；將DNA溶液3000rpm離心5min，將上清倒入干凈的1.5ml離心管。加5μl RNaseA，37℃10min，除去RNA；加入1/10體積的3mol/L NaAc及2×體積的冰乙醇，混勻，-20℃置20min左右，DNA形成絮狀沉淀；用玻棒撈出DNA沉淀，70％乙醇漂洗，吸水紙吸干；將DNA重溶于1ml TE，-20貯存；取2μl DNA樣品在0.7％Agarose膠上電泳，檢測(cè)DNA的分子大小，同時(shí)取15μl稀釋20倍，測(cè)定OD260/OD280，檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量，分裝后存放于-20℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說(shuō)的提取植物線粒體基因組，其步驟為1)準(zhǔn)備STE緩沖液。加入0.2％BSA和0.2％的β巰基乙醇；2)將樣品在0℃漂洗，隨后的步驟都要求在0℃進(jìn)行；3)將樣品用20ml STE緩沖液勻漿；4)用50μm尼龍膜過(guò)濾并用4,000rpm離心20min；5)丟棄核酸沉淀，12,000rpm離心20min；6)用毛筆輕輕懸浮沉淀，12,000rpm離心20min；7)不超過(guò)200μl的ST緩沖液重新懸浮細(xì)胞器；8)在加有0.02M醋酸鎂的0.2ml ST緩沖液溶解125μgDNA酶，并加入細(xì)胞器懸浮液，調(diào)節(jié)終體積到0.5ml，DNA酶的終濃度為250μg/ml；9)37溫浴20min，定時(shí)混合；10)加入EDTA使終濃度為0.2M，用以終止反應(yīng)；11)用NETF緩沖液除去DNA酶，離心收集線粒體細(xì)胞器；12)-20℃保存，或馬上裂解；13)用0℃的600μl TEN緩沖液重新懸浮細(xì)胞器，滴加30μl的20％SDS，不斷地振蕩混合液；14)如果組織聚合在一起，將試管放入60℃水浴，直到組織完全裂解；15)加入等體積的平衡酚后劇烈振蕩5min。12,000rpm離心10min，去除蛋白；16)去除上層水相，加入苯酚/氯仿重復(fù)上述步驟，加入氯仿/異戊醇重復(fù)上述步驟；17)用1/10體積的5M醋酸銨和等體積的異丙醇，-20℃放置2～3小時(shí)或過(guò)夜，12,000rpm離心3～5min，用70％的乙醇洗滌DNA，然后用無(wú)水乙醇去除殘留的鹽分；18)室溫干燥后，加入20μl TE緩沖液溶解；19)DNA完全溶解后，加入150μl TEN緩沖液；20)加入10μl20％的SDS，65℃溫浴15min；加50μl 5M的醋酸鉀，65℃搖動(dòng)混合物幾分鐘，直到沉淀溶解；21)-20℃放置30min后12,000rpm離心10min；22)收集上清液；23)加入10μl 5M的醋酸鉀和100μl異丙醇，混合后-20□放置30min；24)12,000rpm離心10min，分別用70％和96％的乙醇洗滌DNA沉淀，室溫干燥后重新溶解于TE緩沖液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說(shuō)的運(yùn)用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)操作步驟1)依次混勻下列試劑35μl H2O，5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl Taq DNA聚合酶，0.5μl模板DNA，混勻后離心5秒；3)用94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR；最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，其特征在于，所說(shuō)的瓊脂糖凝膠電泳1)配制0.5×TBE稀釋緩沖液；2)膠液的制備稱(chēng)取0.4g瓊脂糖，用0.5×TBE稀釋緩沖液，配制濃度為0.8％瓊脂糖凝膠液；3)膠板的制備向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠溶液使其終濃度為0.5μg/ml，將瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層；4)加樣取10μl PCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣液混勻，加入樣品槽中；5)電泳加完樣后，合上電泳槽蓋，接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿2cm時(shí)，停止電泳；6)染色未加溴化乙錠的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的溴化乙錠溶液中，室溫下染色20-25min；7)觀察和拍照在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察染色后的或已加有溴化乙錠的電泳膠板，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度并拍照。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種源于植物線粒體序列而區(qū)分不同植物的方法，方法的步驟為從新鮮的或干枯的植物組織中提取植物基因組DNA和線粒體基因組DNA的提取；從國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站中查找擬南芥、水稻、高粱、小麥和煙草等幾種模式生物的線粒體基因組序列或者基因序列，運(yùn)用序列分析軟件進(jìn)行序列比較，挖掘其相對(duì)保守的序列，對(duì)這些保守序列進(jìn)行網(wǎng)上查詢(xún)，遵循引物設(shè)計(jì)原則，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一系列的引物；以提取的基因組DNA和線粒體DNA為模板，對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的結(jié)果檢測(cè)并分析。該方法是應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)進(jìn)行同一性鑒定，具有高敏感性和特異性、穩(wěn)定性好、成本低廉，以及不需要特殊儀器設(shè)備、易于推廣應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1546685SQ200310109140
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者徐林苗, 丁宏, 徐春法, 應(yīng)宗敏, 朱虹輝, 吳微微, 張幼芳, 姜玉新, 董海濤 申請(qǐng)人:浙江省警察學(xué)會(huì)