專利名稱：一種利用基因工程技術改良植物營養品質的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和轉基因植物領域。具體地，本發明涉及一種外源基因(如人乳鐵蛋白基因)在植物種子、果實或其它組織中高效表達的載體，以及在植物種子、果實或其它組織中高效表達外源基因的方法。
背景技術：
植物果實或種子中具有較強的蛋白合成功能，如能利用轉基因技術將外源基因特別是具有重要醫療價值的基因如人促紅細胞生成素基因、人生長激素基因轉入植物中，就有可能產生出大量的藥用蛋白。人體內的許多蛋白的生理活性與翻譯后的修飾有關，通過原核生物表達的蛋白通常因為缺少翻譯后修飾而不具有生物活性。以酵母或動物細胞培養來表達這些蛋白不僅成本高而且條件要求高，以轉基因植物來表達這些蛋白，其產物接近天然即具有較高的生物活性、表達量高、成本低而且簡單易行。
利用農桿菌介導法技術轉化進植物體內的基因，其在植物體內的基因組的整合及表達是隨機的，如果外源基因具有較強的活性，如果隨機表達或異位表達有可能造成對轉基因植物的傷害，甚至死亡。
因此本領域迫切需要在植物的種子(如水稻種子)、果實(如番茄果實)及其它可食用組織(如葉片)中特異且高效表達外源基因的載體和技術。
乳鐵蛋白是乳汁中主要的鐵結合蛋白，主要分布在哺乳動物的乳汁、血液、淚液、膽汁、精液、羊水、和小腸液等分泌物中，在哺乳動物中以人乳汁中含量最高。人乳鐵蛋白(Human lactoferrin，hLF)因對胰蛋白酶及類似的蛋白酶具有抗降解能力，特別是結合鐵離子后抗降解能力增強，因此，在腸道內能以完整分子的形式被吸收，有利于嬰兒在發育中對鐵的攝入，是人體非特異性免疫系統中的重要成員之一，人乳鐵蛋白對某些人體致病菌與病毒有很強的抑制作用(Harmsen等1995)；除此之外，乳鐵蛋白還具有多種生物學功能。目前，已克隆了多種動物的乳鐵蛋白基因及cDNA序列，并在乳腺、昆蟲、曲霉等系統中表達了重組的乳鐵蛋白。荷蘭PHP公司20世紀90年代在牛乳腺中表達了以牛αs1-酪蛋白基因5’調控序列為啟動子的人乳鐵蛋白基因，按當時的物價，年產值可達50億美元，由此可以看出人乳鐵蛋白的生產具有巨大的經濟效益。
發明內容
本發明的第一目的就是提供一種適合在植物種子、果實或其它組織中高效表達人乳鐵蛋白的融合基因及載體。
本發明的第二目的是提供一種利用轉基因植物的種子、果實或其它組織高效表達人乳鐵蛋白的方法，從而在植物種子、果實或其它組織中高效表達人乳鐵蛋白。
本發明的第三目的是提供一種利用基因重組技術生產上述新的人乳鐵蛋白的方法。
本發明還提供了這種新的人乳鐵蛋白及其編碼序列在植物營養品質改良中的應用。
本發明的第一方面，提供了在植物果實、種子或其它組織中高效表達融合基因hLFSEKDEL的載體，該載體從5’至3’依次包含以下元件胚乳特異表達啟動子或果實特異表達啟動子或組成型表達啟動子、人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列(hLF)、植物內質網滯留信號肽(SEKDEL)序列、終止子序列。較佳地，在啟動子與人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列有一接頭序列，植物內質網滯留信號肽的編碼序列的末段還有一接頭序列。
在本發明的一個實施例中，在啟動子與人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列有一接頭序列帶有一BamHI位點；植物內質網滯留信號肽的編碼序列的末段還有一接頭序列帶有一SacI位點。
更佳地，人乳鐵蛋白融合基因hLFSEKDEL具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；以及由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；植物內質網滯留信號肽的編碼序列具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，以及其它相應的編碼的核苷酸序列(見表1)。
乳鐵蛋白是一種多功能的糖蛋白，具有抗菌和抗病毒等作用，是一種具有重要價值的藥用蛋白。在本發明的一個實施例中，選用人的乳鐵蛋白作為研究的外源基因。
本發明首先提供了一種調控外源基因在植物種子、果實和其它組織中特異高效表達的載體，為使外源基因(人乳鐵蛋白)在植物種子、果實及其它組織中高效表達，本發明利用了植物種子或果實特異表達調控元件，或植物組成型表達調控元件構建了植物果實、種子或其它組織如葉片中高效表達的載體。
在本發明的一個實施例中，所構建的載體包括如下序列元件胚乳特異表達啟動子或果實特異表達啟動子或植物組成型表達啟動子、終止子序列。
在本發明的一個實施例中，為了使人乳鐵蛋白在植物的特定組織中積累，在人乳鐵蛋白的全長編碼序列后加上了植物內質網滯留信號肽的編碼序列，從而構建了融合基因hLFSEKDEL。
本發明還提出了通過在植物中表達所述融合基因從而實現提高植物營養品質的方法。其步驟如下上述方法中所說的植物為高等植物，在后面的實施例中使用番茄、水稻。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步的闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不是用于限制本發明的范圍。下面具體實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規的條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 在植物種子或果實或其它組織中高效表達融合基因hLFSEKDEL的載體的構建該實施例的載體構建過程如下所示，該基因構建物即為在果實或胚乳或其它組織如葉片中表達的融合基因(hLFSEKDEL)的載體。其中在果實中特異表達的調控序列來源于番茄果實特異表達啟動子PG、在胚乳中特異表達的調控序列來源于玉米醇溶蛋白啟動子19Z、在植物其它組織中高效表達的啟動子來源于花椰菜病毒的35S啟動子CaMV35S，編碼序列來源于人乳鐵蛋白cDNA基因序列。
含融合蛋白hLFSEKDEL的載體的構建過程1)融合基因hLFSEKDEL的序列根據hLF的編碼序列設計并合成如下引物hLFFPCGGATCCATGAAACTTGTCTTCCTCG(SEQ ID NO.1)hLFRPTTTGAGCTC GGACTTCCTGAGGAATTCACAG(SEQ ID NO.2)其中hLFFP引物序列有BamHI酶切位點(下畫橫線)、hLFRP有SacI酶切位點(下畫橫線)和SEKDEL編碼序列的互補序列(加框序列)。
以人血細胞總RNA為模板，采用如上所述的引物通過RT-PCR獲得hLFSEKDEL融合基因全長序列(SEQ ID NO.3)，該融合基因全長長度為2189bp，編碼717個氨基酸殘基，分子量為79,073道爾頓，等電點(pI)為8.43。
2)酶切將含有克隆出的序列的質粒載體用BamHI及SacI雙酶切，切下融合基因hLFSEKDEL。
3)連接將切下的基因連入已經用BamHI及SacI酶切好的經過改造的含有植物果實、種子特異啟動子的基因質粒pCAMBIA2300植物表達載體大片段中，用藍白斑篩選檢測轉化的大腸桿菌陽性克隆。
實施例2獲得含融合基因hLFSEKDEL的農桿菌及轉基因水稻和番茄植株的獲得該實施例的轉化過程如下所述，該步驟的結果是獲得帶有目的基因的轉基因水稻和番茄植株。
1.含目的基因(融合基因hLFSEKDEL)表達載體的農桿菌菌株的獲得在成功地構建了含hLFSEKDEL融合基因的植物表達載體p2300-hLF-SEKDEL的基礎上，通過凍融法將p2300-hLF-SEKDEL導入農桿菌(如EHA105或LBA4404)中，利用農桿菌介導法技術轉化模式植物水稻或番茄。
2.轉基因水稻植株的獲得1)愈傷組織的誘導與繼代在無菌器皿中，將去殼的水稻(如品種1826)種子成熟胚或幼胚經過以下洗滌75％酒精浸1-2分鐘，再用無菌水洗2次后，25％的次氯酸鈉浸30分鐘(期間要搖動幾次，或放在搖床上搖動)，用無菌水洗4-5次，將種子移到無菌濾紙上，吸干水分，接到MS2(MS0+2，4-D 2ppm)上，每皿25粒，然后在25℃暗培養。3-4周后，將水稻長出的黃色愈傷轉到新鮮的MS2上繼續培養，以后每2周繼代一次。經2-4次繼代后即可選擇嫩黃、顆粒狀的胚性愈傷準備與菌共培養。
2)菌的活化取用甘油保存于-20℃的農桿菌50-100μl于2ml的LB液體培養基中(酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl10g；PH7.0；總體積1升。需要高壓滅菌)，并加入相應的抗生素[如利福平20-50ppm；鏈霉素50-100ppm；卡那霉素50ppm；壯觀霉素50-100ppm；氯霉素20-50ppm]，在搖床上以250rpm左右、25℃搖菌24-36小時至OD600＝1.0。再取新搖菌100-200μl于30ml的LB液體培養基中，并加入相應的抗生素(濃度、條件同上)，經12小時左右，菌液達到OD600＝0.8-1.0時，即可用來轉化。
3)共培養菌液在無菌的50ml的離心管中以5000rpm×5min離心，去上清，再用30ml的MSCO(MS2+乙酰丁香酮AS 100μmol/l)液體培養基重懸。將預先挑好的愈傷浸在菌液中15-30分鐘后，再用無菌濾紙或吸水紙吸去多余的菌液(無須進一步吸干)，置于MSCO固體培養基(可覆蓋一層無菌濾紙)上，25℃暗培養2-3天。
4)洗菌與篩選共培養的愈傷先用無菌水沖洗3次，再浸于含頭孢霉素(250mg/l)的MSCO液體培養基中20-30分鐘，將愈傷組織用無菌濾紙或吸水紙吸干后，接種于選擇培養基S1(MS2+卡那霉素50ppm+Cef(頭孢霉素)250ppm)上篩選2-3周。然后挑選新長出的愈傷接種于新鮮的選擇培養基S1上篩選2-3周。
5)植株再生與生根將經過2次選擇得到的抗性愈傷接種到預分化培養基上暗培養10天左右，再轉到分化培養基上進行光照培養。約1-2個月，將2cm左右高的幼苗轉到生根培養基(1/2MS0+卡那霉素50ppm+NAA 0.2ppm+植物凝膠phytagel 2.5g/l+蔗糖15g/l)上生根。當苗長至10cm高且根系發達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養。
3.利用葉盤法轉化番茄1)番茄種子滅菌后播于1/2MS培養基上，約10天左右長出子葉；2)取用甘油保存于-20℃的農桿菌50-100μl于2ml的LB液體培養基中(酵母粉5g；蛋白胨10g；NaCl 10g；PH7.0；總體積1升。需要高壓滅菌)，并加入相應的抗生素[如利福平20-50ppm；鏈霉素50-100ppm；卡那霉素50ppm；壯觀霉素50-10ppm；氯霉素20-50ppm]，在搖床上以250rpm左右、25℃搖菌24-36小時至OD600＝1.0。再取新搖菌100-200μl于30ml的LB液體培養基中，并加入相應的抗生素(濃度、條件同上)，經12小時左右，菌液達到OD600＝0.8-1.0時，即可用來轉化。
3)室溫下4000g離心10min；4)棄上清，菌體用1/2MS液體培養基懸浮，加入子葉浸泡10分鐘；5)在無菌濾紙上吸干菌液；將子葉放在MS培養基上，共培養兩天；6)將葉片轉到含Kan的愈傷和分化培養基(MS+ZT 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培養，7-15天可見抗性愈傷組織的形成和植株再生；7)待芽長大后約1-2厘米的時將幼芽移植在生根培養基中(1/2 MS)上進行生根培養，2-7天左右生根；8)根系發達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養基，在珍珠巖中馴化一周，用1％的MS澆灌，移入土中。
實施例3 融合基因hLFSEKDEL在轉基因水稻和番茄中的檢測本實驗用于檢測轉基因植株中的融合基因。
1.樣品處理非轉基因的水稻和番茄，及轉基因的水稻和番茄，按常規操作取葉片，-20℃保存備用。
2.檢測方法1)基因組DNA的快速抽提將保存的葉片按照改良的CTAB法進行總DNA的抽提；2)酶切及電泳取基因組總DNA約10微克采用限制性內切酶BamHI和SacI進行酶切，酶切產物在1％的瓊脂糖凝膠，1-2V/cm，電泳12小時以上；3)變性及中和加入變性液(1.5M NaCl、0.5M NaOH)使膠變性45分鐘(輕搖)，加入中和液(1.5M NaCl、0.5M Tris-HCl(pH8.0))輕搖中和45分鐘。
4)轉膜將尼龍膜均勻鋪在膠上，上面鋪3MM Waterman吸水紙三張，再鋪紙塔(5-10厘米)壓上重物18小時；用5×SSC沖洗膜以除去膜表面的凝膠碎片，在室溫下涼干，80℃固定2小時。
5)探針制備用BamHI和SacI酶切質粒，回收含融合基因hLFSEDKEL的片段，采用隨機引物標記試劑盒標記探針。
6)預雜交及雜交轉運膜在預雜交液(5×SSPE，5×Denhardt’s Solution，0.1％SDS，100ug/ml nonhomologus Salman Sperm blocking DNA，50％Formamide)中42℃預雜交4小時。將探針加入到預雜交液中42℃中雜交16小時。
7)洗膜壓片洗片采用Washing Solution(1×SSC，0.1％SDS)65℃洗滌1小時，重復此步驟后，將洗滌后的雜交膜用保鮮膜固定，暗室中放入X光片，-70℃保存兩天。暗室中取出X光片，顯影5分鐘，定影15分鐘，檢查光片上顯示的結果。
實施例4 融合基因hLFSEKDEL在轉基因水稻和番茄植株中的表達檢測本實驗用于轉基因植株中的人乳鐵蛋白的表達檢測。
1.蛋白的提取取50mg轉基因水稻去殼種子或番茄成熟果實，加入100ul PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)緩沖液，于1.5ml離心管中研磨；13000，4℃離心10分鐘；取上清，備用。
2.蛋白質的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白質樣品，加入1ml Bradford試劑，混勻后，分光光度計測OD595值。
3.SDS-PAGE分離蛋白質SDS-PAGE的制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)1)加樣前，將樣品(包括提取的植物蛋白樣品(30ug/樣品)和市售的人乳鐵蛋白50ng)置于含50mmol/L DTT的加樣緩沖液(2×加樣緩沖液甘油2.4g，1M Tris-HCl pH6.81ml；溴酚蘭0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分鐘；2)室溫，100V電壓下電泳，直到指示劑(溴酚蘭)前沿達到凝膠底部。
4.蛋白質向硝酸纖維膜上轉移1)轉移之前，用轉移緩沖液(39mmol甘氨酸，48mmol Tris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝膠和硝酸纖維膜30分鐘；2)室溫下用半干式電轉儀轉移1小時，凝膠兩側各墊3層Whatman濾紙；5.硝酸纖維膜上蛋白質的檢測1)將硝酸纖維膜浸在封閉液中，37℃緩慢搖動、封閉60分鐘(封閉液取5g脫脂奶粉溶于100ml 1×PBS(含0.5g疊氮鈉))；
2)將濾膜浸泡在洗滌緩沖液中，37℃洗滌兩次，每次15分鐘；3)加入第一抗體(抗人乳鐵蛋白的抗體)，37℃溫育30分鐘；同步驟b)，洗滌三次；4)加入第二抗體(親和素-堿性磷酸酶復合物)，37℃溫育30分鐘；5)同步驟2)，洗滌兩次；6)加入底物顯色觀察到人乳鐵蛋白的蛋白特異條帶；7)通過比較植物樣品中的人乳鐵蛋白的特異條帶同市售的人乳鐵蛋白的特異條帶的強弱，計算出人乳鐵蛋白在轉基因水稻種子和番茄果實中的表達量。在本研究中，我們獲得了在轉基因水稻種子和番茄果實中人乳鐵蛋白表達量占總可溶性蛋白的0.5％的轉基因水稻和番茄。這些所培育出的表達人乳鐵蛋白的轉基因水稻和番茄可以作為具特殊營養價值的食品加以利用。
在本發明所提及到的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了上述所講授的內容以后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
本發明涉及的序列及記號分列如下1.SEQ ID NO.1的信息(1)序列特征(A)長度26bp(B)類型寡核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性
(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.1CGGATCCATGAAACTTGTCTTCCTCG2.SEQ ID NO.2的信息(1)序列特征(A)長度49bp(B)類型寡核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(2)分子類型寡核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.2TTTGAGCTCTTATAGCTCGTCTTTCTCGGACTTCCTGAGGAATTCACAG3.SEQ ID NO.3的信息(1)序列特征(A)長度2189bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述SEQ ID NO.31 tcct gctgttcctc ggggccctcg gactgtgtct
61 ggctggccgt aggagaagga gtgttcagtg gtgcgccgta tcccaacccg aggccacaaa121 atgcttccaa tggcaaagga atatgagaaa agtgcgtggc cctcctgtca gctgcataaa181 gagagactcc cccatccagt gtatccaggc cattgcggaa aacagggccg atgctgtgac241 ccttgatggt ggtttcatat acgaggcagg cctggccccc tacaaactgc gacctgtagc301 ggcggaagtc tacgggaccg aaagacagcc acgaactcac tattatgccg tggctgtggt361 gaagaagggc ggcagctttc agctgaacga actgcaaggt ctgaagtcct gccacacagg421 ccttcgcagg accgctggat ggaatgtccc tacagggaca cttcgtccat tcttgaattg481 gacgggtcca cctgagccca ttgaggcagc tgtggccagg ttcttctcag ccagctgtgt541 tcccggtgca gataaaggac agttccccaa cctgtgtcgc ctgtgtgcgg ggacagggga601 aaacaaatgt gccttctcct cccaggaacc gtacttcagc tactctggtg ccttcaagtg661 tctgagagac ggggctggag acgtggcttt tatcagagag agcacagtgt ttgaggacct721 gtcagacgag gctgaaaggg acgagtatga gttactctgc ccagacaaca ctcggaagcc781 agtggacaag ttcaaagact gccatctggc ccgggtccct tctcatgccg ttgtggcacg841 aagtgtgaat ggcaaggagg atgccatctg gaatcttctc cgccaggcac aggaaaagtt901 tggaaaggac aagtcaccga aattccagct ctttggctcc cctagtgggc agaaagatct961 gctgttcaag gactctgcca ttgggttttc gagggtgccc ccgaggatag attctgggct1021 gtaccttggc tccggctact tcactgccat ccagaacttg aggaaaagtg aggaggaagt1081 ggctgcccgg cgtgcgcggg tcgtgtggtg tgcggtgggc gagcaggagc tgcgcaagtg1141 taaccagtgg agtggcttga gcgaaggcag cgtgacctgc tcctcggcct ccaccacaga1201 ggactgcatc gccctggtgc tgaaaggaga agctgatgcc atgagtttgg atggaggata1261 tgtgtacact gcatgcaaat gtggtttggt gcctgtcctg gcagagaact acaaatccca1321 acaaagcagt gaccctgatc ctaactgtgt ggatagacct gtggaaggat atcttgctgt1381 ggcggtggtt aggagatcag acactagcct tacctggaac tctgtgaaag gcaagaagtc
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MKLVFLVLLF LGALGLCLAG RRRRSVQWCA VSQPEATKCF QWQRNMRKVRGPPVSCIKRD SPIQCIQAIA ENRADAVTLD GGFIYEAGLA PYKLRPVAAEVYGTERQPRT HYYAVAVVKK GGSFQLNELQ GLKSCHTGLR RTAGWNVPTGTLRPFLNWTG PPEPIEAAVA RFFSASCVPG ADKGQFPNLC RLCAGTGENKCAFSSQEPYF SYSGAFKCLR DGAGDVAFIR ESTVFEDLSD EAERDEYELLCPDNTRKPVD KFKDCHLARV PSHAVVARSV NGKEDAIWNL LRQAQEKFGKDKSPKFQLFG SPSGQKDLLF KDSAIGFSRV PPRIDSGLYL GSGYFTAIQNLRKSEEEVAA RRARVVWCAV GEQELRKCNQ WSGLSEGSVT CSSASTTEDCIALVLKGEAD AMSLDGGYVY TACKCGLVPV LAENYKSQQS SDPDPNCVDRPVEGYLAVAV VRRSDTSLTW NSVKGKKSCH TAVDRTAGWN IPMGLLFNQTGSCKFDEYFS QSCAPGSDPR SNLCALCIGD EQGENKCVPN SNERYYGYTGAFRCLAENAG DVAFVKDVTV LQNTDGNNNE AWAKDLKLAD FALLCLDGKRKPVTEARSCH LAMAPNHAVV SRMDKVERLK QVLLHQQAKF GRNGSDCPDKFCLFQSETKN LLFNDNTECL ARLHGKTTYE KYLGPQYVAG ITNLKKCSTSPLLEACEFLR KSEKDEL5.SEQ ID NO.5的信息(1)序列特征(A)長度18bp(B)類型寡核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(2)分子類型寡核苷酸
(3)序列描述SEQ ID NO.5TCCGAGAAAGACGAGCTA(4)序列SEKDEL所對應的編碼序列及其所組成的序列(表1)
權利要求
1.一種在植物種子、果實或其它組織中高效表達融合基因的載體，其特征在于該載體以5’至3’依次包含以下元件胚乳特異表達啟動子或果實特異表達啟動子或組成型表達啟動子、人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列和植物內質網滯留信號肽序列組成的融合基因(hLFSEKDEL)、終止子序列。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于在啟動子側翼序列和人乳鐵蛋白全長編碼cDNA序列之間有一接頭序列；植物內質網滯留信號肽的編碼序列與終止子序列之間還有一接頭序列。
3.一種如權利要求1所述的融合基因，其特征在于融合基因hLFSEKDEL具有SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列，以及由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
4.根據權利要求3所述的融合基因，其特征在于其中的植物內質網滯留信號肽編碼序列具有SEQ ID NO.5序列及其它相應的編碼的核苷酸序列。
5.根據權利要求3所述的融合基因，其特征在于構建該融合基因的編碼序列所采用的引物，分別具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.一種通過在植物中表達權利要求1所述的融合基因從而實現提高植物營養品質的方法，其特征在于，它包括步驟(1)將所述的含融合基因hLFSEKDEL的載體利用農桿菌介導法轉化植物，獲得基因組中整合有融合基因hLFSEKDEL的愈傷組織；(2)將步驟(1)中所獲得的愈傷組織進行分化培養，篩選出表達該融合基因的轉基因植株及其后代，包括植物種子、果實及其它組織如葉；(3)所獲得的轉基因植物因其種子、果實及其它組織中含有表達的人乳鐵蛋白而具有附加的營養價值，可以直接食用或加工成其它營養食品或作為其它食品的添加原料使用。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物為高等植物。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述植物為番茄和水稻。
全文摘要
本發明為人乳鐵蛋白(hLF)全長cDNA編碼序列以及植物內質網滯留信號肽(SEKDEL)序列組成的融合基因hLFSEKDEL。其中涉及包含所說該融合基因構建的利用胚乳特異表達啟動子或果實特異表達啟動子或組成型表達啟動子啟動表達的植物高效表達載體。還涉及被所說的表達載體轉化的植物細胞，以及由所說的轉化細胞產生的表達人乳鐵蛋白的轉基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。本發明還提供了在樣品中檢測人乳鐵蛋白核酸序列和多肽的方法。
文檔編號C12N15/12GK1544641SQ20031010884
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月25日 優先權日2003年11月25日
發明者張健, 劉曉軍, 李柱剛, 孫小芬, 龐永珍, 張 健 申請人:復旦大學