專利名稱：糞產(chǎn)堿桿菌青霉素g?；冈诖竽c桿菌中的高效表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青霉素G?；福绕涫羌S產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?AfPGA)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，以及在大腸桿菌中的組成型高表達(dá)。
背景技術(shù)：
青霉素G?；?penicillin G acylase，E.C.3.5.1.11，PGA)能催化青霉素G(PG)脫酰氧生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)和頭孢霉素G(重排酸)脫苯乙酸生成7-氨基脫乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)。6-APA和7-ADCA是半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵中間體。近50年P(guān)GA酶法已取代傳統(tǒng)的化學(xué)裂解工藝。目前世界上工業(yè)生產(chǎn)6-APA和7-ADCA的固定化青霉素G?；钢饕獊碜源竽c桿菌(Escherichia Coli，Ec)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium，Bm)。
早期(1950-1980)研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌PGA家族的成員分為革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌(Escherichia coli，Ec)，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌(Kluyvera citrophila，Kc)，雷氏普羅威登斯菌(Providencia rettgeri，Pr)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.，Ps)PGA和革蘭氏陽性菌，如巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium，Bm)，粘節(jié)桿菌(Arthrobacter viscosus，Av)PGA。革蘭氏陰性菌PGA家族的成員——糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis Af)PGA的基因直到1994年(美國專利5695978)才被克隆，同源性比較結(jié)果表明它處于PGA進(jìn)化過程的一個(gè)獨(dú)立分支。與其他來源的PGA比較，AfPGA的酶學(xué)性質(zhì)有如下特點(diǎn)1、AfPGA對底物具有更高親和力，對PG Km值比EcPGA和BmPGA低一個(gè)數(shù)量級。其kcat值也是所有PGA中最高的，表現(xiàn)出很高的活性(Svedas V，et al.Febs Letters，1997.417414-418)；2、AfPGA是其家族中唯一在一級結(jié)構(gòu)中具有鏈內(nèi)二硫鍵的成員，酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性顯著提高(Verhaert RMD，et al.Appliedand Environmental Microbiology，1997.633412-3418)；3、而EcPGA識別手性分子的能力較差，AfPGA對苯基取代的手性分子具有較高的選擇性(vanLangen LM，et al.Tetrahedron-Asymmetry，2000.114593-4600)；4、AfPGA在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性，雙水相中，催化抗生素母核氨基和苯乙酰胺縮合時(shí)，其催化效率比EcPGA高出一個(gè)數(shù)量級(van Langen LM，et al.Tetrahedron-Asymmetry，2000.114593-4600)。上述性質(zhì)預(yù)示著AfPGA在半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素工業(yè)中會(huì)有良好的應(yīng)用前景。
文獻(xiàn)報(bào)道胞內(nèi)形成的包涵體會(huì)抑制PGA的高表達(dá)，而包涵體的形成是由于表達(dá)載體為多高拷貝數(shù)和含有強(qiáng)啟動(dòng)子，導(dǎo)致蛋白過量表達(dá)。為了減少包涵體的形成，周志雄等嘗試共表達(dá)brp基因或degP基因(Lin WJ，et al.Journalof Chemical Technology and Biotechnology，2001.761030-10374，5 Lin YH，et al.Biotechnology Progress，2002.181458-146)，提高了EcPGA的表達(dá)量。另一方面，如果能適當(dāng)降低蛋白的表達(dá)量，保持蛋白合成流平衡暢通，胞內(nèi)包涵體會(huì)降低，從而提高活性酶的表達(dá)。為此，我們構(gòu)建了中拷貝數(shù)、強(qiáng)啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒psmlfpga，該質(zhì)粒為組成型，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，無需誘導(dǎo)即可表達(dá)AfPGA，從而可以簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有AfPGA基因和信號肽的組成型重組質(zhì)粒psmlfpga。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到特定大腸桿菌中成為能組成型高表達(dá)AfPGA的基因工程菌。
本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供上述基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。
本發(fā)明從petapga(Zhou Z，et al.Acta Biochim Biophys Sin，2003.35416-422)擴(kuò)增出包括AfPGA基因及其信號肽的片段，擴(kuò)增片段與SmaI線性化的質(zhì)粒psu2718連接后得重組質(zhì)粒psufpga。用限制性內(nèi)切酶Hind III、NcoI切psufpga得包括AfPGA基因及其信號肽的片段，同時(shí)用Hind III、NcoI切psml104(Li Y，et al.Eur J Biochem，1999.262713-719)，兩片段連接后即得psmlfga。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒psmlfpga到大腸桿菌DH5α中，則得組成型、高表達(dá)基因工程菌株DH5α/psmlfpga。
本發(fā)明的組成型高表達(dá)AfPGA的基因工程菌DH5α/psmlfpga與已報(bào)道表達(dá)AfPGA的菌株比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、高表達(dá)Quax等(美國專利5695978)報(bào)道將AfPGA基因克隆到大腸桿菌和原宿主菌糞產(chǎn)堿桿菌中，在IPTG或苯乙酸的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量分別是原宿主菌的17和22倍。Deak等(Deak PM，et al.Biotechnology Letters，2003.25397-400)將AfPGA基因克隆到一高拷貝數(shù)、鼠李糖啟動(dòng)子、Ap抗性的載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)鼠李糖的誘導(dǎo)，在搖瓶和5L發(fā)酵罐中菌體密度分別達(dá)5g干重菌體/L和13.5g干重菌體/L；對應(yīng)的酶活為700U/L和4500U/L，折算成比酶活，其表達(dá)量并不高。周政等(Zhou Z，et al.Acta Biochim Biophys Sin，2003.35416-422)將AfPGA基因克隆到pet表達(dá)系統(tǒng)得petapga，該基因在大腸桿菌JM109/DE3中表達(dá)需IPTG誘導(dǎo)，其表達(dá)量為150U/L。同時(shí)他們還將AfPGA基因克隆到枯草芽孢桿菌中分泌表達(dá)，表達(dá)不需誘導(dǎo)，AfPGA可直接分泌到發(fā)酵液，其表達(dá)量可達(dá)700U/L。本發(fā)明中構(gòu)建了基因工程菌株DH5α/psmlfpga，在搖瓶培養(yǎng)下，菌體密度達(dá)2.5g干重菌體/L，對應(yīng)的酶活為3500U/L。這是目前報(bào)道的最高表達(dá)AfPGA的菌株。
2、不需要使用誘導(dǎo)劑目前，在大腸桿菌中表達(dá)AfPGA的菌株均需誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)。本發(fā)明工程菌株DH5α/psmlfpga無需誘導(dǎo)即可實(shí)現(xiàn)AfPGA基因的高表達(dá)。降低了成本，簡化了培養(yǎng)條件。
3、菌株DH5α/psmlfpga改善了AfPGA蛋白合成流菌株DH5α/psmlfpga中的重組質(zhì)粒為中拷貝、強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒，該菌株改善了AfPGA蛋白合成流，蛋白電泳顯示胞內(nèi)無蛋白前體的形成。
圖1為重組質(zhì)粒psmlfpga的構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的大腸桿菌DH5α基因工程菌株已于2003年10月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.1023。
實(shí)施例1、質(zhì)粒psmlfpga的構(gòu)建設(shè)計(jì)5’引物5’-GCATCCATGGTGAAAGGGCTGGTTCGT-3’，引入NcoI酶切識別位點(diǎn)，信號肽的原堿基序列ATGCAG......相應(yīng)地改為ATGGTG......，因而信號肽的第二個(gè)氨基酸由Gln變?yōu)閂al。該5’引物與3’引物5’-CCGGATCCCTAAGGCTGAGGCTGAATC-3’，通過PCR方法從載體petapga(Zhou Z，et al.Acta Biochim Biophys Sin，2003.35416-422)上擴(kuò)增得到的AfPGA基因克隆到經(jīng)SmaI線性化的質(zhì)粒psu2718(Martinez et al.Gene，1988.68159-162)，得到質(zhì)粒psufpga。psufpga以NcoI、Hind III消化，將獲得的AfPGA基因連接到NcoI、Hind III消化的載體psml104(Li Y，et al.ProteinExpr Purif，1998.12233-238)中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒psmlfpga。在重組質(zhì)粒psmlfpga中，AfPGA基因依靠trc啟動(dòng)子、自身表達(dá)元件以及rrnb轉(zhuǎn)錄終止子而表達(dá)，然后依靠其信號肽引導(dǎo)AfPGA分泌到周質(zhì)空間。該重組質(zhì)粒的復(fù)制子為p15a(中拷貝)，抗性為四環(huán)素(Tc)。構(gòu)建過程見圖1。
實(shí)施例2、基因工程菌株DH5α/psmlfpga的獲得將表達(dá)質(zhì)粒psmlfpga轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α{遺傳特征為supE44，△lacU169(Φ80 lacZ△M15)，hssdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1}中，得到轉(zhuǎn)化子DH5α/psmlfpga即為本發(fā)明的大腸桿菌DH5α基因工程菌株(菌株保藏號CGMCC No.1023；保藏日期2003年10月27日；保藏地中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)。
上述轉(zhuǎn)化方法為取1μl psmlfpga質(zhì)粒加入100μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20分鐘，42℃水浴90秒，冰浴3分鐘，加入LB培養(yǎng)基(蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％)900μl，37℃水浴1小時(shí)，取50μl涂布含Tc的LB平板(LB培養(yǎng)基蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，平板加1.5％瓊脂，Tc 30μg/ml)。
實(shí)施實(shí)例3、菌株DH5α/psmlfpga在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下表達(dá)AfPGA及酶活測定從含Tc的LB平板(LB培養(yǎng)基蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl1％，平板上加1.5％瓊脂)上接DH5α/psmlfpga單菌落在LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，250rpm過夜培養(yǎng)。以1∶100接種量接種裝液量為50ml的250ml搖瓶，pH 6.0-8.0，25-37℃，250rpm培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)基如下蛋白胨7-12g； 酵母膏3-6g；糊精/淀粉 20-40g；Na2HPO4·12H2O0.5-2.5g；(NH4)2SO40.5-1.5g； NH4Cl0.1-1.3g；MgSO40.3-1.0g； 微量元素溶液 10ml，定容至1000ml。
其中，微量元素溶液組成如下(g/L)MnSO4·H2O0.05-0.09g/L；CoCl2·6H2O 0.02-0.06g/L；ZnCl20.1-0.3g/L； CuSO4·5H2O 0.05-0.15g/L；H3BO40.03-0.07g/L；FeSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；CaCl21-2g/L。
取10μl發(fā)酵液，加入500μl磷酸緩沖液(50mM，pH7.5)里，37℃溫浴。再加入1ml 37℃預(yù)熱的1ml 0.9mg/ml 6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)溶液。反應(yīng)4分鐘，取出加入1ml 95％乙醇終止反應(yīng)。空白對照則不加酶液。反應(yīng)結(jié)束時(shí)，發(fā)應(yīng)液以6000×g室溫離心2分鐘，于405nm測定吸光度。
酶活力定義為1分鐘水解1μmol的6-硝基-3-氨基-苯甲酸所需青霉素酰化酶的量為1單位。
酶活力計(jì)算公式為酶活力(U/L)＝7000×A405上述培養(yǎng)條件下，經(jīng)分別測定以糊精和淀粉作為主要碳源的搖瓶中的菌株DH5α/psmlfpga所表達(dá)的AfPGA酶的酶活，結(jié)果如表1所示。
表1
可見，本發(fā)明的基因工程菌株DH5α/psmlfpga在上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件下表達(dá)的AfPGA的酶活可達(dá)到2000-3500U/L。
權(quán)利要求
1.含有糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G酰化酶基因，即AfPGA基因，及其信號肽的重組表達(dá)質(zhì)粒psmlfpga，其特征在于，所述表達(dá)質(zhì)粒由trc啟動(dòng)子、AfPGA基因及其信號肽、四環(huán)素抗性基因和p15a復(fù)制子連接而成。
2.一種高效表達(dá)AfPGA的大腸桿菌基因工程菌株CGMCC No.1023，其特征在于該菌株轉(zhuǎn)化有重組表達(dá)質(zhì)粒psmlfpga。
3.一種高效表達(dá)AfPGA的大腸桿菌基因工程菌株CGMCC No.1023的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方如下蛋白胨 7-12g；酵母膏 3-6g；糊精/淀粉 20-40g； Na2HPO4·12H2O 0.5-2.5g；(NH4)2SO40.5-1.5g； NH4Cl 0.1-1.3g；MgSO40.3-1.0g； 微量元素溶液10ml；定容至1000ml，pH6.0～8.0；其中，微量元素溶液組成如下(g/L)MnSO4·H2O0.05-0.09g/L； CoCl2·6H2O 0.02-0.06g/L；ZnCl20.1-0.3g/L； CuSO4·5H2O 0.05-0.15g/L；H3BO40.03-0.07g/L； FeSO4·7H2O 0.1-0.3g/L；CaCl21-2g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種糞產(chǎn)堿桿菌青霉素G?；?AfPGA)高效表達(dá)質(zhì)粒psmlfpga的構(gòu)建方法；利用該方法得到的質(zhì)粒psmlfpga轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主DH5α，得到大腸桿菌基因工程菌株CGMCC No.1023，其不需誘導(dǎo)便能高效表達(dá)AfPGA；本發(fā)明還公開了一種用于上述大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，其采用糊精或淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基主要碳源，可以大大提高重組蛋白的生產(chǎn)率；經(jīng)搖瓶發(fā)酵，青霉素G?；冈贒H5α/psmlfpga中的表達(dá)水平可達(dá)3500U/L。
文檔編號C12N15/63GK1544635SQ20031010879
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者袁中一, 楊志建, 蔡謹(jǐn) 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院