專利名稱：臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法
技術領域：
本發明屬生物技術方法，主要涉及一種造血干/祖細胞在體外擴增培養的新生物技術方法，尤其是能有效地提高造血干/祖細胞體外擴增倍數和保持其質量的方法。
背景技術：
已有的造血干/祖細胞體外擴增技術方法大致可歸為兩類第一類方法是在培養體系中外加不同組合的重組細胞生長因子，目的是利用細胞生長因子對造血干/祖細胞增殖和分化進行適當的調控。第二類是近幾年來發展起來的方法，即用骨髓基質細胞來模擬體內造血干/祖細胞生長和分化的環境，以促進其快速擴增和功能的激活。
目前上述兩類技術方法中，第一類技術方法能在一定程度上提高造血干/組細胞的擴增倍數。但如果組合中的細胞因子種類太少，就難以達到理想的擴增效果，而太多的話則會因為費用昂貴而難以在臨床移植中應用。同時，不管如何組合重組細胞因子，也難以模擬體內支持造血干/祖細胞生長和分化的環境，在一定程度上限制了造血干/祖細胞的體外擴增效率。第二類技術方法可以模擬體內造血干/祖細胞生長和分化環境，但是骨髓來源相對比較困難，并且骨髓間充質干細胞難以建系，所以難以滿足培養造血干/祖細胞大批量擴增培養所需的支持細胞需求。
臍血來源豐富，采集簡便，可以滿足大批量支持細胞的需求。同時，臍血間充質干細胞和造血干/祖細胞可以來自于同一份樣品，因此前者作為培養后者的支持細胞，具有最佳的相容性。目前未見有用臍血間充質干細胞建立滋養層支持造血干/祖細胞體外擴增技術的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，可開辟造血干/祖細胞體外擴增中新的支持細胞來源，為造血干/祖細胞擴增和分化提供新的微環境，提高其體外擴增效率。
本發明的目的通過以下方案實現從臍血中培養出臍血間充質干細胞，并作為培養體系中的支持細胞，在結合外源生長因子的培養體系中體外擴增造血干/祖細胞，達到進一步提高造血干/祖細胞體外擴增效率的目的。
本發明方法所述的臍血中培養出的臍血間充質干細胞，在培養體系中形成滋養層，體外支持造血干/祖細胞擴增。
本發明方法所述的外源生長因子主要包含SCF、G-CSF和MGDF(每種細胞因子濃度為100ng/mL)。
本發明方法所述的從臍血中分離造血干/祖細胞，種植到上述含有臍血間充質干細胞層的培養體系中，在5％CO2和37℃下培養14天。
本發明方法所述的從臍血中分離造血干/祖細胞，包含單個核細胞或純化CD34+細胞。
本發明的有益效果是采用臍血間充質干細胞共培養的技術有效地提高造血干/祖細胞體外擴增倍數，并保持了其擴增后的質量。在單個核細胞擴增培養中，用臍血間充質干細胞滋養層結合外源細胞因子的擴增體系比僅用外源細胞因子的擴增體系提高了2.09倍，CD34+擴增培養中，用臍血間充質干細胞滋養層結合外源細胞因子的擴增體系比僅用外源細胞因子的擴增體系提高了2.94倍，用臍血間充質干細胞滋養層結合外源細胞因子的擴增體系擴增出的細胞比僅用外源細胞因子的擴增體系擴增出的細胞具有更多的GEMM-CFC形成潛能。新擴增技術具有明顯的擴增優勢。
圖1為人臍血間充質干細胞的形態和堿性磷酸酶染色。
圖2為流式細胞儀檢測臍血間充質干細胞表面標記物的結果。
圖3兩種培養體系下臍帶血造血干/祖細胞的擴增動態。
圖4兩種培養體系中GEMM-CFC的擴增。
具體實施例方式
實施例一 本發明方法的一種具體步驟用IMDM培養液培養臍血間充質干細胞約7天，直至臍血間充質干細胞在培養瓶中鋪層。然后在培養體系中加入三種細胞生長因子SCF、G-CSF和MGDF(每種細胞因子濃度為100ng/mL)，建立新的造血干/祖細胞體外擴增培養體系。從臍血中分離造血干/祖細胞(單個核細胞或純化CD34+細胞)，種植到上述含有臍血間充質干細胞層的新培養體系中，在5％CO2和37℃下培養14天。
實施例二 臍血間充質干細胞形態學及其免疫組化特性從臍血分離到的間充質干細胞培養14天以后，可觀測到一些纖維狀似的細胞，隨后它們形成克隆，并逐漸擴張。在30天后，一種纖維狀細胞占據了整個培養瓶的表面(參見圖1a)。
其中圖1a為培養30天的臍血間充質干細胞，圖1b為臍血間充質干細胞的堿性磷酸酶染色(×100)。
用流式細胞儀分別檢測了臍血間充質干細胞的CD13、CD14、CD29、CD166四種抗原，發現CD14(單核細胞的標志性抗原)呈陰性，而CD13(髓系細胞、單核細胞表達的抗原)、CD166(內皮細胞、骨髓細胞、單核細胞表達的抗原)以及CD29(骨髓成纖維細胞的標志性抗原)呈陽性。貼壁細胞中每種抗原的表達率分別是CD13為51.8％、CD166為35.6％、CD29為16.5％、CD14為3.8％。檢測的數據用Veresion3.1軟件分析的結果(參見圖2)。用成纖維細胞的標志堿性磷酸酶染色，發現培養的細胞(參見圖1b)都呈陽性，即胞漿呈灰色，內有很多黑色顆粒，甚至有的細胞黑色顆粒連成片。
實施例三 臍血造血干/祖細胞的體外擴增效果1.有核細胞的擴增從臍血分離單個核細胞，并進一步分選出CD34+細胞，然后按本擴增技術體系進行體外擴增。分別在第7、9和14天對單個核細胞和CD34+細胞擴增的細胞進行取樣，并計細胞總數，由此計算擴增倍數。結果參見圖1。
參見圖3的擴增結果，其中(a)單個核細胞培養的有核細胞的擴增，(b)CD34+細胞培養的有核細胞擴增。在臍血間充質干細胞滋養層并結合外源細胞因子的共擴增培養體系中，有核細胞擴增的速度明顯大于非共擴增培養體系(P＜0.01)單個核細胞擴增培養中，共擴增培養體系比非共擴增培養體系提高了2.1倍；CD34+擴增培養體系中，共擴增培養體系比非共擴增培養體系提高了3.0倍(見表1)。通過對比可以看出，臍血間充質干細胞滋養層對CD34+細胞擴增的支持作用要大于對單個核細胞擴增的支持作用，同時也說明CD34+細胞具有非常高的擴增潛力。
表1 兩種培養體系下臍血造血干/祖細胞的擴增(x±s)起始細胞×10擴增細胞×104提高倍數A組62.5±0.5 602.5±8.4 2.09±0.2單個核 62.5±0.5 1257.5±13.
細胞B組0CD34+A組7.4±0.798.8±7.02.94±0.1細胞B組7.4±0.7290.5±25.32.造血干/祖細胞總集落擴增分析用臍血間充質干細胞做滋養層并結合外源細胞因子的共擴增培養體系中，單個核細胞培養和CD34+細胞培養的GEMM-CFC擴增效率都比僅用外源細胞因子的非共擴增培養體系要高(P＜0.05)(見圖4)。
單個核細胞和CD34+細胞培養中的起始GEMM-CFC分別是57±4.7×104和23±2.1×104。經過14d的擴增后，用臍血間充質干細胞做滋養層并結合外源細胞因子的共擴增培養體系(B組)中，單個核細胞擴增后的GEMM-CFC是2086±295.3×104(擴增36.6±4.2倍) CD34+細胞擴增后的GEMM-CFC是1807±155.9×104(擴增78.8±3.3倍)。在僅用細胞因子的非共擴增培養體系(A組)中，單個核細胞擴增后的GEMM-CFC是1046±141.6×104(擴增15.2±2.3倍)；CD34+細胞擴增后的GEMM-CFC是508±33.6×104(擴增22.2±1.1倍)。所以，共擴增培養體系與非共擴增培養體系比較，在單個核細胞擴增后的GEMM-CFC相對提高擴增效率2.0±0.1倍；CD34+細胞擴增后的GEMM-CFC相對提高擴增效率3.5±0.1倍。
本發明涉及的部分參考文獻1、韓軍 徐激斌等，胎兒骨髓基質細胞與外源性細胞因子的協同造血支持作用，第二軍醫大學學報，2001，22(5)439-4422、張毅 毛寧等，臍帶血中長期培養啟動細胞在轉染FL和/或TPO基因骨髓基質細胞層上的生長，中國實驗血液學雜志，2001，9(2)97-1003、楊吉成 王曉東等，骨髓基質細胞的造血支持作用等生物學特性的研究，細胞與分子免疫學雜志，2001，17(1)41-454、蘇瑞軍 黃紹良，含人胚胎骨髓基質細胞層體系對臍血造血干/祖細胞的擴增效果，中華兒科雜志，1999，37(7)429-4335、吳瑞瓊 楊治華，骨髓基質細胞對人造血CD^+34細胞體外擴增及基因轉導的作用，中國輸血雜志，1999，12(2)73-756、侯麗君 遠藤一靖，人骨髓基質細胞株培養上清對造血干細胞增殖作用的研究，中國醫科大學學報，1995，24(5)477-4797、梁輝 應大明，長期培養起始細胞在不同的基質細胞層上的培養，中華血液學雜志，1995，16(5)241-2438、趙柯，沈柏鈞，侯懷水等，條件培養液對臍血CD34+細胞擴增效應的實驗研究，河北醫科大學學報，2002，23(1)7-10.
9、徐黎，裴雪濤，王立生，吳祖澤，利用IL-3/GM-CSF融合蛋白(PIXY-321)擴增臍血造血細胞方法，中國應用生理學雜志，1996，12(3)233-23510、孫海英，徐開林，嵇月紅等，FL與SCF、IL-3、GM-CSF及EPO協同調控臍血造血干/祖細胞的體外擴增，現代診斷與治療，2001，12(6)345-347.
11、韓軍，王健民，居小平，徐激斌，周虹，閔碧荷，胎兒骨髓基質細胞與外源性細胞因子的協同造血支持作用，第二軍醫大學學報，2001，22(5)439-44212、楊吉成，盛偉華，李麗娥，童寧征，王紅衛，郭春，王曉東，骨髓基質細胞的造血支持作用等生物學特性的研究，細胞與分子免疫學雜志，2001，17(1)41-4513、姜蓉，鄭敏，王亞平，吳宏，王莎莉，戴勤，幾種組織培養上清液對造血祖細胞體外增殖分化的比較，重慶醫科大學學報，2001，26(1)29-3114、郭子寬，唐佩弦，劉曉丹，楊靖清，李秀森，陳小三，毛寧，人骨髓間充質干細胞支持體外造血，中國實驗血液學雜志，2000，8(2)93-9615、王紅衛，繆競誠，張瀾生，楊吉成，盛偉華，李麗娥，IL-3體外造血支持效應的初步研究，中國免疫學雜志，2000，16(6)291-29216、胡延紅，唐軍民，唐巖標，骨髓基質細胞層對紅系造血祖細胞擴增的影響，解剖科學進展，1999，5(4)37217、蘇瑞軍，黃紹良，周敦華，李樹濃，梁曉燕，含人胚胎骨髓基質細胞層體系對臍血造血干/祖細胞的擴增效果，中華兒科雜志，1999，37(7)429-43318、吳瑞瓊，楊治華，石遠凱，董志偉，骨髓基質細胞對人造血CD+34細胞體外擴增及基因轉導的作用，中國輸血雜志，1999，12(2)73-7519、秦鳳華，張忠森，謝蜀生，骨髓基質細胞系QXMSC1體外促進造血及其作用機理的研究，實驗血液學雜志，1997，5(4)367-37120、孫新，黃紹良，劉俊范，胎兒骨髓基質細胞培養上清對造血祖細胞集落生長的影響，實驗血液學雜志，1997，5(2)212-21321、侯麗君，仇琳，遠藤一靖，金田京子，古山和道，人骨髓基質細胞株培養上清對造血干細胞增殖作用的研究，中國醫科大學學報，1995，24(5)477-47922、侯麗君，人骨髓基質細胞株培養上清對造血干細胞增殖作用的研究，沈陽醫學雜志，1994，14(3)3-423、吳萌，孫正義，王翠芳，張欽，人臍血中分離骨髓間充質干細胞成骨誘導前后的生物學特性，中國臨床康復，2003，172414-241724、侯玲玲，曹華，魏國榮，白慈賢，張涌，吳祖澤，裴雪濤，人臍血間充質干細胞體外擴增和向神經元樣細胞定向誘導分化的研究，中華血液學雜志，2002，23(8)415-41925 Rosler E，Brandt J，Chut J，et al.Cocultivation of umbilical cord blood cells withendothelial cells leads to extensive amplification of competent CD34+CD38-cells[J].Exp Hematol，2000，28841-852.
26 Lweis LD，Graca AP，Du JB，et al Umbilical cord blood cells capable of engraftingin primary，secondary，and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivoculture in a noncontact system[J].Blood，2001，973441-3449.
27 Wang JF，Harrintong J，McNiece.Effects of bone marrow-derived mesenchymalstem cell layer on expansion and differentiation of hematopoietic stem cell fromcord blood[J].Journal of Zhejiang University(Science Edition)，2003，3065-70.
28 Hauser SP，Waldron JA，Upuda KB，et al.Morphological characterizsaition ofstromal cell type in hematopoietically active long-term murine bone marrowculture[J].J Histochemi，1995，43371-382.
29 Huang S，Terstappen LW.Formation of hematopoietic microenviroment andhematopoietic stem cells from single human bone marrow stem cells[J].Nature，1993，360745-752.
30 Cardoso AA，Li ML，Batard P，et al.Release from quiescence of CD34+CD38-human umbilical cord blood cells reveals their potentiality to engraft adults[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，908707-8711.
31 Vilmer E，Sterkers G，Rahimy C，et al.HLA-mismatched cord-bloodtransplantation in a patient with advanced leukemia[J].Transplantation，1992，531155-1157.
32 Hows JM，Bradley BA，Marsh JC，et al.Growth of human umbilical-cord blood inlongterm haemopoietic cultures[J].Lancet，1992，34073-74.
33 Strobel ES，Gay RE，Greenberg PL.Characterization of the in vitro stromalmicroenvironment of human bone marrow[J].Int.J.Cell Cloningt，1986，4341-356.
34 Ye ZQ，Burkholder JK，Qiu P，et al.Establishment of an adherent cell feeder layerfrom human umbilical cord blood for support of long-term hematopoieticprogenitor cell growth[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，9112140-12144.
35 Gutierrez-Rodriguez M，Reyes-Maldonado E，Mayani H.Characterization of theadherent cells developed in Dexter-type long-term cultures from human umbilicalcord blood[J].Stem Cells，2000，1846-52.
權利要求
1.臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，其特征是從臍血中培養出的臍血間充質干細胞，并作為培養體系中的支持細胞，在結合外源生長因子的培養體系中體外擴增造血干/祖細胞。
2.根據權利要求1所述的臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，其特征是用臍血中培養出的臍血間充質干細胞形成培養體系的滋養層。
3.根據權利要求1所述的臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，其特征是外源生長因子主要包含SCF、G-CSF和MGDF。
4.根據權利要求1和2所述的臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，其特征是從臍血中分離造血干/祖細胞，種植到上述含有臍血間充質干細胞層的新培養體系中，在5％CO2和37℃下培養14天。
5.根據權利要求4所述的臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，其特征是從臍血中分離造血干/祖細胞包含單個核細胞或純化CD34+細胞。
全文摘要
本發明提供一種臍血間充質干細胞支持造血干/祖細胞體外擴增方法，是從臍血中培養出臍血間充質干細胞，并作為培養體系中的支持細胞，在結合外源生長因子的培養體系中體外擴增造血干/祖細胞，達到進一步提高造血干/祖細胞體外擴增效率的目的。采用臍血間充質干細胞共培養的方法有效地提高造血干/祖細胞體外擴增倍數，并保持了其擴增后的質量，擴增出的細胞具有更多的GEMM－CFC形成潛能。本發明的擴增方法具有明顯的擴增優勢。
文檔編號C12N5/08GK1539964SQ20031010825
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月28日 優先權日2003年10月28日
發明者王金福 申請人:浙江大學, 杭州大力神醫療器械有限公司