專利名稱：蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物農藥的制造方法，尤其是一種用于制備微生物殺蟲劑——蘇云金芽孢桿菌培養方法。
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)簡稱B.T，是目前全世界產量最大的微生物殺蟲劑。它廣泛用于防治農業害蟲、森林和果樹害蟲、貯藏害蟲以及醫學昆蟲，并取得了顯著的經濟效益、社會效益和生態效益。特別是在急需發展無公害農產品的情況下，使用蘇云金芽孢桿菌可以大大減少化學農藥的殘留，杜絕因施用化學農藥而造成的人畜中毒現象。
現有技術中，一類是采用深層液體發酵技術培養蘇云金芽孢桿菌(如申請號為91105123.6的中國發明專利申請所公開的《一種植物用殺蟲菌的生產方法》等)，該類方法需要發酵罐、空氣過濾系統、板框壓濾機、濃縮罐等大型設備，工藝復雜、投資大、成本高、耗能大；另一類采用固體發酵技術，包括淺盤式、箱式和槽式發酵器培養蘇云金芽孢桿菌。此類傳統的固體發酵技術工藝簡單、投資少、但產量低。由于蘇云金芽孢桿菌屬好氧微生物，透氣性差將會抑制蘇云金芽孢桿菌的正常生長和代謝。因此，常常往培養基料(如麥麩、米糠、玉米粉、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等)中加入疏松劑(如谷殼、鋸末、玉米芯、高粱稈等富含粗纖維的物質)來改善其透氣性，但對蘇云金芽孢桿菌的發酵和后處理(制成不同的劑型的過程)造成以下不良后果①蘇云金芽孢桿菌生長增殖所需要的水分、空氣和營養物質來自于培養基料固體顆粒表面，疏松劑的加入，大大減少了單位體積內能被蘇云金芽孢桿菌所利用的有效表面積，使發酵效率降低；②蘇云金芽孢桿菌幾乎不分泌纖維素酶，添加的疏松劑不能被利用，既浪費了原料，又使蘇云金芽孢桿菌生長增殖變慢、生產周期延長、產品的毒力效價不高；③疏松劑在發酵物中很難分離和粉碎，造成終產品的性能(如細度、穩定性、懸浮率等)達不到相關質量標準，在蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑的生產中顯得更為突出。因此，上述現有培養蘇云金芽孢桿菌的方法有待于改進。
發明內容
本發明的目的是對上述采用固體發酵技術培養蘇云金芽孢桿菌的方法進行改進，提供一種可縮短發酵周期，降低生產能耗，增加設備生產能力和提高產品毒力效價的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法。
本發明的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法是按以下步驟進行①、對用于蘇云金芽孢桿菌固體培養的固體培養基原料進行機械粉碎，粉碎細度在200～400目；②、在粉碎后的固體培養基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養基原料總重量的60～80％；③、將濕化的固體培養基原料成型為顆粒，所成型顆粒的最大橫截面部位的直徑為2～10mm；④、將成型的顆粒在壓力0.1～0.15MPa、溫度121～135℃下滅菌30～45分鐘；⑤、使滅菌處理后的成型顆粒自然冷卻，當其溫度降至28～30℃時，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入該成型顆粒中進行發酵培養，發酵培養溫度為27～37℃、濕度為90～95％；當成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現40～60％游離時即終止培養。
在上述步驟①中，所采用的固體培養基原料可以是現有固體發酵培養方法中的常規原料，如麥麩、米糠、玉米粉、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等。同時，固體培養基原料中的各個組份均按原有工藝要求的比例進行配制。也就是說，如何確定固體培養基的原料及其各組份的比例，均不是本發明方法所要解決的問題。在本發明方法的步驟①中，只需直接對按現有的固體培養方法(即按現有的原料配方)準備的常規原料實施粉碎，使之達到一定的細度即可。對固體培養基原料的機械粉碎可以采用普通的超微粉碎機械進行。在步驟②中，固體培養基原料中所加水量以能夠使固體培養基料濕化，使之具有擠壓成型的塑性，且成型后得到的顆粒不變形、不粘連、表面光滑為準。在必要時，還可以將其它微量成分，如酵母粉、硫酸鎂、磷酸氫鈉、硫酸亞鐵、硫酸鋅、碳酸鈣等溶解于水中，再加入已攪拌均勻的固體培養基原料中。在步驟③中，可以采用現有的擠壓成型設備實現造粒，所制得的成型顆粒可以是圓柱狀、圓球狀、橢球狀或類似橢球形狀的顆粒。當成型顆粒為圓柱狀時，其最大橫截面為圓柱的圓形橫斷面，而非圓柱的長度；當成型顆粒為圓球狀時，其最大橫截面的直徑即為圓球的球徑；當成型顆粒為橢球狀或類似橢球的形狀時，其最大橫截面直徑為橢球的短軸長度，而非橢球的長軸長度。所制顆粒的表面應光滑圓潤、無毛刺、不開裂。就步驟④來說，采用的是現有固體發酵技術培養蘇云金芽孢桿菌的常規滅菌方法。在步驟⑤中，當檢測到成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現40～60％游離時即終止培養，而不考慮發酵培養的全程時間。這是因為，當采用不同的固體培養基原料或菌種時，其發酵培養的全程時間有可能發生較大的差異。另外，接入該成型顆粒中的菌種液可以是由蘇云金芽孢桿菌斜面制得的菌種液，也可以是由三級種子罐制得的菌種液，所應用的蘇云金芽孢桿菌的培養條件實際上與現有技術中的固體發酵培養條件相同。在培養結束后，可以按現有工藝要求對培養所得產物進行后處理，進而制成水懸浮劑、可濕性粉劑等成品。
本發明的有益效果是①、采用固體造粒培養技術，在培養條件下顆粒與顆粒之間形成孔隙，可以保留充足的氧氣及順暢的通風，保證了蘇云金芽孢桿菌在固體培養過程中對營養和透氣性的需求。有效地避免疏松劑給發酵和后處理帶來不良后果。尤其適宜于蘇云金芽孢桿菌固體發酵的大規模工業化生產。②、傳統的固體發酵在接種后要立即進行拌料，極易染菌。采用固體造粒培養技術之后，由于顆粒的光滑表面以及孔隙作用，可以省去接種后拌料這一操作，即只在由成型顆粒堆積成的培養基料料表面噴灑菌種液，菌種液便能自然地沉降在各個成型顆粒上，并能均勻分布，減小了蘇云金芽孢桿菌生產過程中雜菌感染的機率和勞動強度。③、采用固體造粒培養技術之后，使蘇云金芽孢桿菌只在顆粒表面生長成厚厚的菌苔，而顆粒內部則不形成。在后處理工序中，表面的菌苔易與顆粒分離，不僅使有效成分的收得率提高，而且也容易制得極高毒力效價的蘇云金芽孢桿菌產品。④、固體造粒培養技術可以同現有的任何一種蘇云金芽孢桿菌固體發酵裝置相結合，在提高產品毒力效價的同時，還可以縮短發酵周期，降低能耗，增加設備的生產能力。
在本發明中，為了讓成型顆粒具有較為光滑的表面，并在成型顆粒之間形成足夠的孔隙，可以讓步驟③所制得的成型顆粒為表面具有弧形表面的顆粒。
本發明的內容結合以下實施例作更進一步的說明，但本發明的內容不僅限于實施例中所涉及的內容。
具體實施例方式
本實施例中的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法按以下步驟進行(以下所涉及的各重量份的單位為公斤)①、對用于蘇云金芽孢桿菌固體培養的固體培養基原料進行機械粉碎，粉碎細度為300目。在本實施例中，采用了現有的固體培養基原料配方，被粉碎的固體培養基原料為麥麩、豆餅粉和玉米粉，三者的重量份比例為82.2比2比2。粉碎后按上述比例進行混合。
②、在粉碎后的固體培養基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養基原料總重量的70％。在本實施例中，在向固體培養基原料中加水時，將重量份分別為1.5、0.03、0.3的微量成分酵母粉、硫酸鎂和碳酸鈣加水攪拌，將生石灰(重量份1.25)單獨加水成石灰水溶液后與酵母粉等制成的溶液混合，再加入上述被粉碎的固體培養基原料中。另外，將重量份為4.5的魚粉加水煮沸35分鐘，與重量份為2的葡萄糖混合后，制成營養液單獨滅菌待用。
③、將濕化的固體培養基原料成型為顆粒。在本實施例中，利用擠出成型設備，把混合均勻的固體培養基料擠壓成圓柱狀顆粒，其顆粒的最大橫截面部位的直徑(即圓柱的橫截面直徑)為4mm，顆粒長度在3cm。上述成型顆粒為表面具有弧形表面的顆粒。
④、將成型的顆粒(即顆粒狀培養基料)移入高溫滅菌鍋進行滅菌。滅菌壓力為0.1MPa，溫度在121℃，滅菌40分鐘，待培養基料的溫度降至58℃，壓力為0時移入培養室內。
⑤、使滅菌處理后的成型顆粒自然冷卻，當其溫度降至29℃時，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入該成型顆粒中進行發酵培養，發酵培養溫度為27～37℃、濕度為90～95％；當成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現40～60％游離時即終止培養。具體過程是當由成型顆粒堆積而成的培養基料的溫度降至29℃時，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液(菌株編號HBNK-1)與一半量的營養液混合，噴入培養基料的表面(無需攪拌培養基料，菌種液便能在顆粒間的孔隙中自然沉降，并能均勻分布在顆粒上)。培養的前1～12小時，蘇云金芽孢桿菌的營養體處于對數期。培養至11～12小時，營養體處于對數峰期。此時將余下的另一半量的營養液噴入培養基料表面，補充營養源。這一時期的溫度控制在28～30℃。培養時間在13～25小時，此時蘇云金芽孢桿菌的營養體處在穩定期，這一時期的溫度控制在30～32℃。26小時以后，蘇云金芽孢桿菌的營養體處在芽孢及伴孢晶體游離階段，此時的溫度控制在34～36℃，以促進其老熟。培養時間至32～34小時，有50％的芽孢及伴孢晶體游離，故終止培養。整個發酵過程控制濕度在90～95％。此時在顆粒表面形成厚厚的一層蘇云金芽孢桿菌的菌苔(如果將培養基料直接干燥、粉碎后，測定其毒力效價在14000～16000IU/mg)。
在本實施例中，上述培養結束后，按現有工藝要求對培養所得產物進行了后處理，其處理方法是A、將培養結束的固體培養基料倒入攪拌罐中加入1.8倍的無菌水，機械攪拌30分鐘，生長在培養基料表面的蘇云金芽孢桿菌菌苔，通過表面光滑的顆粒之間的相互磨擦，被洗入水中成為蘇云金芽孢桿菌的菌液，而培養基料在短時間內不會溶散開，極易實現蘇云金芽孢桿菌與固體培養基料的分離。
B、將攪拌后的混合液通過2mm的振動篩進行自然沉降，顆粒狀的培養基料被濾出，濾出液粗濾后通過離心機進行細濾，濾液再通過200目濾布后，裝入盛放第一次菌液的貯罐。將濾渣再加入無菌水，再重復洗滌一次。得到的菌液裝入第二次菌液的貯罐。經過3次復洗，有效成份的收得率在93％。
C、將上一批次生產的第一次菌液作為水洗液，加入到下一批次的培養基料中，重復上述操作進行洗滌。即可獲得高毒力效價的蘇云金芽孢桿菌的菌液。
D、將分級獲得的菌液直接制備2000IU/μl(合格品)、4000IU/μl(一級品)、8000IU/μl(優級品)的水懸浮劑產品。
E、將獲得的高毒力效價的菌液經過濃縮、干燥，可以制備出40000IU/mg(合格品)、50000IU/mg(一級品)的蘇云金芽孢桿菌原粉。也可以將發酵結束后的固體培養基料直接干燥、粉碎后制備8000IU/mg(合格品)、16000IU/mg(一級品)的可濕性粉劑產品。
為了進一步說明本發明方法的技術效果，以下特給出采用現有固體發酵方法培養蘇云金芽孢桿菌的例子，即對照例對照例的原料配方同本發明以上實施例的配方。
其生產過程為第一步將原料(魚粉、葡萄糖除外)按比例進行混合，加入總水量的70～80％混合均勻。魚粉加水煮沸30-40分鐘，與葡萄糖混合后制成營養液單獨滅菌待用。
第二步把配制好的固體培養基料移入高溫滅菌鍋進行滅菌。滅菌壓力為0.1MPa，溫度在121℃，滅菌40分鐘，待培養基料的溫度降至58℃，壓力為0時移入培養室內。
第三步當培養基料的溫度降至29℃時，把蘇云金芽孢桿菌的種子液(菌株編號HBNK-1)與營養液混合，接入已滅菌的固體培養基料中，拌和均勻，并且每隔6小時翻料一次。1～17小時，蘇云金芽孢桿菌的營養體處于對數期，這一時期的溫度控制在28～30℃。培養時間在18～32小時，蘇云金芽孢桿菌的營養體處在穩定期，這一時期的溫度控制在30～32℃。33～50小時，此時期的溫度控制在32～34℃。整個發酵過程控制濕度在90～95％。當有50％的芽孢及伴孢晶體游離，便終止培養，此時發酵周期在50小時左右。而且培養基料的表面肉眼看不出厚厚的菌苔。將培養基料直接干燥、粉碎后，測定其毒力效價在8000～10000IU/mg。
現將本發明實施例(固體造粒培養)和對照例(常規固體培養)發酵的基本情況進行比較，列表如下固體造粒培養與常規固體培養基本情況對照表
從以上對照表可以看出，與現有同類方法相比較，采用本發明的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法的發酵周期大為縮短，產品的毒力效價和有效成份的收得率顯著提高，可生產的品種增多，勞動強度減小，生產成本降低，生產能耗也較小，從而具有極高的應用價值。
權利要求
1.一種蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法，其特征是按以下步驟進行①、對用于蘇云金芽孢桿菌固體培養的固體培養基原料進行機械粉碎，粉碎細度在200～400目；②、在粉碎后的固體培養基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養基原料總重量的60～80％；③、將濕化的固體培養基原料成型為顆粒，所成型顆粒的最大橫截面部位的直徑為2～10mm；④、將成型的顆粒在壓力0.1～0.15MPa、溫度121～135℃下滅菌30～45分鐘；⑤、使滅菌處理后的成型顆粒自然冷卻，當其溫度降至28～30℃時，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入該成型顆粒中進行發酵培養，發酵培養溫度為27～37℃、濕度為90～95％；當成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現40～60％游離時即終止培養。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是在步驟③中，所制得的成型顆粒為表面具有弧形表面的顆粒。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征是在步驟⑤中，通過向由成型顆粒堆積成的培養基料表面噴灑菌種液，完成將蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入成型顆粒中的操作。
全文摘要
一種蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法，其特征是按以下步驟進行①對固體培養基原料進行機械粉碎，粉碎細度在200～400目；②在粉碎后的固體培養基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養基原料總重量的60～80％；③將濕化的固體培養基原料成型為顆粒，所成型顆粒的最大橫截面部位的直徑為2～10mm；④將成型的顆粒滅菌；⑤把菌種液接入成型顆粒中進行發酵培養。采用本發明的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養方法的發酵周期大為縮短，產品的有效成分的收得率顯著提高，可生產的品種增多，勞動強度減小，生產成本降低，生產能耗也較小，發酵產物的毒力效價達到14000～16000 IU/mg。
文檔編號C12N1/20GK1554743SQ200310104078
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月22日 優先權日2003年12月22日
發明者胡佩, 閻玉鵬, 胡 佩 申請人:胡佩, 閻玉鵬, 胡 佩