專利名稱：人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達的制作方法
胸腺肽主要由胸腺上皮細胞分泌，是一種細胞免疫增強劑，具有促進淋巴細胞成熟和增強人體免疫功能，起著對機體抗感染的保護性作用。
年老、體弱及免疫功能低下者應用胸腺肽可增加機體免疫功能。胸腺肽在臨床主要用于原發(fā)性和繼發(fā)性免疫缺陷癥，如各種肝炎、肝硬化、暴發(fā)性肝衰竭、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕、類風濕關節(jié)炎等，及各種惡性腫瘤前期及化療、放療的輔助用藥。另外，胸腺肽作為一種免疫增強劑，對非典型性肺炎可能有預防和治療作用。
目前臨床應用的胸腺肽有多種劑型如胸腺肽片劑、顆粒劑和注射針劑等。我國臨床應用的胸腺肽主要是由小牛胸腺和豬胸腺提取精制而成的多肽類激素。
α1-胸腺肽(α1-thymosin)是Goldstein等1977年首次在胸腺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)。在體內(nèi)它是由111個氨基酸組成的前體α1-胸腺肽原(prothymosin)經(jīng)酶解加工產(chǎn)生的。成熟的α1-胸腺肽由28個氨基酸組成，其序列為Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Glu-Lys-lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn成熟的α1-胸腺肽分子量為3108道爾頓，等電點為4.2。α1-胸腺肽除了存在于胸腺細胞，T-淋巴細胞以及胸腺組織外，在肝、腎、心、肺、脾等器官也有分布。α1-胸腺肽作為一種廣譜免疫調節(jié)劑，臨床結果已顯示其對乙型肝炎和丙型肝炎有顯著療效，對腫瘤和愛滋病也有一定療效。此外，α1-胸腺肽還可用作疫苗輔助藥劑，以增強免疫機能衰弱的患者對疫苗(如流感疫苗及乙肝疫苗)的應答能力。
α1-胸腺肽早在1977年就被發(fā)現(xiàn)，其專利保護期已過。目前進口的α1-胸腺肽采用化學合成方法制備。目前國家醫(yī)藥管理局有批文的國產(chǎn)的-胸腺肽都是從?；蜇i中提取，其成本較高，原料來源的數(shù)量和質量受限制，產(chǎn)品純度低、每批量的效價多不一致。
本發(fā)明采用基因工程方法生產(chǎn)人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達的技術。該技術將α1-胸腺肽基因在大腸桿菌中高效表達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析，純化。因其在生物體內(nèi)自然合成，可以保持蛋白質原有的天然狀態(tài)的空間構象，與化學合成α1-胸腺肽相比效價極高；另外經(jīng)親和層析純化，樣品純度高。用基因工程方法制備人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達的工藝流程如
圖1所示。
本產(chǎn)品的特點(1)保證產(chǎn)品的質量的一致性，不受原料來源的限制。
特別是為加強對防治“非典”藥品的監(jiān)督管理，國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品安全監(jiān)管司于2003年4月29日下發(fā)了《關于開展胸腺肽制劑生產(chǎn)企業(yè)專項檢查的緊急通知》(國食藥監(jiān)安〔2003〕30號)。其中第一點為加強胸腺肽制劑起始原料(健康豬或小牛胸腺)來源的監(jiān)督管理。胸腺肽制劑起始原料來源的質量直接影響最終成品的質量。各胸腺肽制劑生產(chǎn)企業(yè)必須明確所采購的起始原料的質量標準，嚴格按質量標準購入，且進貨單位應保持相對固定；各胸腺肽制劑生產(chǎn)企業(yè)應加強對起始原料進貨單位的質量體系進行評估，確保起始原料的質量穩(wěn)定可靠。
而重組人α1-胸腺肽可以保證產(chǎn)品的質量的一致性，不受原料來源的限制。
(2)純化方便，成本低，理論上菌種可以無限期保存。
(3)避免了化學合成的副產(chǎn)物毒性的憂慮。
(4)由于是生物體內(nèi)產(chǎn)品，在保證該蛋白的天然構像和活性方面更具優(yōu)勢。
根據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年的報告，全球有20億人口曾經(jīng)感染過乙型肝炎病毒，其中有3.5億患者轉化為慢性乙型肝炎。1997年全球感染丙型肝炎病毒的人口達1.7億，其中約有20％的患者將會發(fā)展成肝硬化或肝癌。α1-胸腺肽自1998年正式上市以來，其銷售額突飛猛進。
根據(jù)α1-胸腺肽對乙型和丙型肝炎的臨床療效，可預期α1-胸腺肽在中國應有較好的市場。中國乙型肝炎的發(fā)病率高，估計約有6千萬人患有慢性肝炎。若每年有1％的患者需接受臨床治療，且其中有20％的患者使用α1-胸腺肽，則每年需要α1-胸腺肽的量約為10千克(60萬人×20％×1.6毫克×2次/周×26周＝9.984千克)，此外，α1-胸腺肽用于治療丙型肝炎以及作為廣譜免疫增強劑(如作免疫佐劑)也有一定市場。估計每年國內(nèi)所需α1-胸腺肽的用量應達12千克。
以下是具體方法的詳細描述1 材料表達質粒pGEX-4T-1， Pharmacia公司；菌種BL21(F-，ompT，RB-，mB-)， Pharmacia公司；谷胱甘肽Sepharose 4B親和柱，Pharmacia公司；Sephacryl-S100，Pharmacia公司；限制性內(nèi)切酶Biolab公司；T4連接酶MBI公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，Sigma公司；凝血酶(thrombin)， Sigma公司；
β-巰基乙醇，Sigma公司；PCR引物 上海生工生物有限公司。
DNA Thermal Cycler 480PCR儀，PE公司；BIOSTATB發(fā)酵系統(tǒng)，B.Braun Biotech Inc.；121B氨基酸自動分析儀， Beckman公司。
2 表達載體的構建(1)基因重組操作和PCR擴增.
α1-胸腺肽原的序列為CcccactggctgctctgaaaagccatctttgcattgttcctcatccgcctccttgctcgccgcagccgcctccgccgcgcgcctcctccgccgccgcggactccggcagctttatcgccagagtccctgaactctcgctttctttttaatcccctgcatcggatcaccggcgtgccccaccatgtcagacgcagccgtagacaccagctccgaaatcaccaccaaggacttaaaggagaagaaggaagttgtggaagaggcagaaaatggaagagacgcccctgctaacgggaatgctaatgaggaaaatggggagcaggaggctgacaatgaggtagacgaagaagaggaagaaggtggggaggaagaggaggaggaagaagaaggtgatggtgaggaggagggtggagatgaagatgaggaagctgagtcagctacgggcaagcgggcagctgaagatgatgaggatgacgatgtcgataccaagaagcagaagaccgacgaggatgactagacagcaaaaaaggaaaagttaaactaaaaaaaaaaaggccgccgtgacctattcaccctccacttcccgtctcagaatctaaacgtggtcaccttcgagtagagaggcccgcccgcccaccgtgggcagtgccacccgcagatgacacgcgctctccaccacccaacccaaaccatgagaatttgcaacaggggaggaaaaaagaaccaaaacttccaaggccctgctttttttcttaaaagtactttaaaaaggaaatttgtttghThymosin-pGEX-4T-1質粒的具體構建過程見圖2。步驟為(a)設計引物xxt1和xxt2，序列如下。通過xxt1和xxt2從人總cDNA中通過PCR方法克隆到人α1-胸腺肽的cDNA序列，同時在此序列兩端引Thrombin切割位點和BamHI切割位點。
xxt15’-CG GGATCC GACGCAGCCGTAGACACC-3’xxt25’-CG GGATCC CCGATTTTCTGCCTCTTCCAC-3’(b)用BamHI切割載體pZeroT，與含有Thrombin切割位點的人胸腺肽片段連接。得到含有多基因片段的非定向連接?？赡芎?個，2個，3個，4個，5個或更多個人胸腺肽基因片段。
(c)用酶切割這些質粒，由于頭頭相接和尾尾相接的序列含有特定的酶切位點，它們都被切斷，只流下頭尾相連的序列。得到含有多基因片段的定向連接。頭頭相接序列含有Acc III的酶切位點，TCCGGA。尾尾相接的序列含有Eco52 I的酶切位點，CGGCCG。
(d)把質粒轉化到E.coli BL21中擴增。
(e)提取質粒。
(f)通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定分離含有5個人胸腺肽基因的質粒。
(g)通過PCR引入在含有5個人胸腺肽基因的目的片段兩端引入EcoRI和Not I酶切位點。
(g)EcoR I和Not I酶切，與同酶切后的pGEX-4T-1質粒連接得到hThymosin-pGEX-4T-1質粒。
3 發(fā)酵，誘導表達及分離純化將表達載體轉入E.coli BL21，挑單一陽性克隆接種入2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；再以1∶100擴大培養(yǎng)，當菌長至對數(shù)生長期時，以此為種子1∶10上發(fā)酵罐.保持合適的溶氧和pH值，當通氣量和轉速達到最大，菌發(fā)酵至對數(shù)生長期時，加入IPTG(200μmol/L)誘導表達融合蛋白；4h后下罐離心。將收獲的菌體懸浮于冰預冷的PBS，冰浴中超聲波破碎細胞，而后加入Triton X-100(1％)，柔和攪拌約30min后離心。上清液上Glutathione Sepharose 4B親和柱，20倍柱床體積的PBS洗滌后，加凝血酶酶切液(1.5mg/mL凝血酶，0.05mol/LTris-Hcl，pH8.0)25℃原位酶切16h。下柱液上10mmol/L NH4HCO4預平衡的Sephacryl-S100柱，紫外280nm吸收檢測，收集蛋白峰，凍干。
4 氨基酸組成分析蛋白質樣品用鹽酸水解，而后上氨基酸自動分析儀分析。
5 質譜法測定分子量蛋白樣品溶于0.1％(體積比)的TFA中，上質譜儀測定。
6 蛋白質含量測定蛋白樣品加入到一定體積的DC Protein Assay(BIO-RAD)試劑中，室溫反應，60min內(nèi)測定700nm處光吸收，以牛血清清蛋白(BSA)作標準曲線，計算蛋白含量。
在表達中，本發(fā)明采用了發(fā)酵的方法，由于比搖瓶有更好的條件控制，使重組蛋白的得率約為搖瓶的8倍多。這為重組人α1-胸腺肽大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)打下了基礎。
權利要求
1.本發(fā)明涉及一種采用基因工程方法生產(chǎn)人α1-胸腺肽基因多拷貝定向克隆及高效表達的方法。該技術將α1-胸腺肽基因在大腸桿菌中高效表達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析，純化。因其在生物體內(nèi)自然合成，可以保持蛋白質原有的天然狀態(tài)的空間構象，與化學合成α1-胸腺肽相比效價極高；另外經(jīng)親和層析純化，樣品純度高。
2.根據(jù)權利要求1所述，該方法包括以下步驟(1)表達載體的構建(2)生產(chǎn)菌種(3)種子培養(yǎng)(4)發(fā)酵，誘導表達(5)收集并破碎菌體，取上清液(6)GST親和層析(7)凝血酶切割(8)凝膠過濾層析(9)凍干
全文摘要
本發(fā)明采用基因工程方法高效生產(chǎn)重組人α1－胸腺肽的技術。該技術將α1－胸腺肽基因在大腸桿菌中多拷貝插入并高效表達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和層析一步純化得到天然純品。因其在生物體內(nèi)自然合成，可以保持蛋白質原有的天然狀態(tài)的空間構象，與化學合成α1－胸腺肽相比本產(chǎn)品效價提高顯著；另外經(jīng)親和層析純化，樣品純度高。本產(chǎn)品的特點(1)保證產(chǎn)品的質量的一致性，不受原料來源差異性的限制。(2)純化方便，成本低，理論上菌種可以無限期保存。(3)避免了化學合成中副產(chǎn)物毒性的憂慮。(4)由于是生物體內(nèi)產(chǎn)品，在保證該蛋白的天然構象和活性方面更具優(yōu)勢。
文檔編號C12N15/12GK1528903SQ200310100199
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權日2003年10月17日
發(fā)明者任宏偉, 徐明旭, 韓鐵鋼 申請人:任宏偉, 徐明旭, 韓鐵鋼