專利名稱：來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及獲得膠束酪蛋白(micellar casein)的酸溶性蛋白質的方法，涉及該蛋白質的級分，涉及該蛋白質作為藥物的用途，還涉及該蛋白質在生產藥物或消費品中的用途。
背景糖尿病是世界上最普遍的疾病之一。糖尿病主要有兩種類型I型和II型。I型糖尿病患者的特征在于分泌胰島素的胰腺β細胞的自身免疫破壞。II型糖尿病患者占所有糖尿病患者的90-95％，他們的特征在于在外周組織(主要是肝臟和肌肉)中形成胰島素抗性，以及不恰當的胰島素分泌能力。
患II型糖尿病的人具有嚴重的長期并發癥的高度危險。這些并發癥基本上是心血管病，以及視網膜病，腎病和神經病。
當前對II型糖尿病的治療包括幾類藥物，它們能單獨或結合胰島素使用，這依賴于仍然產生的胰島素的量(如磺酰脲，噻唑烷二酮類化合物)。最終，當不再產生胰島素時，藥物治療將由單獨注射胰島素取代。
胰島素生物合成和胰島素原基因表達受胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的刺激，幾乎僅在內分泌腸細胞中表達。該促分泌激素的重要作用很好地概括在“″Glucagone-like peptide-1a major regulator of pancreatic b-cellfunction，R.Perfetti和P.Merkel，European Journal of Endocrinology(2000)，143，717-725”，此處引用該文獻作為參考。
已表明，例如，當靜脈內GLP-1施用后，II型糖尿病的胰島素分泌反應將恢復到正常患者狀態。
而且，GLP-1抑制胃能動性、胃酸分泌、胃排空和延緩酶分解及營養的吸收。這些影響幾乎在I型和II型糖尿病患者中都保存。
此外，證明GLP-1影響飽滿感并可能與降低食物的攝取有關。
因而認為GLP-1是治療糖尿病的理想選擇。
此外，無論何時釋放一分子的GLP-1，也將釋放一分子的胰高血糖素樣肽-2(GLP-2)。哺乳動物胰高血糖素原的轉錄物來源于一個mRNA。因而GLP-1和GLP-2在消化道中是共分泌的。
GLP-2抑制胃分泌和胃能動性。用GLP-2的長期治療對腸具有有益的營養效果，例如提高組織質量和粘膜厚度，降低腸細胞程序性細胞死亡速率等等。關于GLP-1合成、分泌和生物活性的綜述可以見Glucagon-LikePeptide 2，D.J.Drucker，The Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism，2001，86，1759-64。
在WO 01/37850(Societe des Produits Nestle)中第一次描述用體外細胞模型測量胰高血糖素原基因表達和GLP-1分泌。該細胞系稱為NCI-H716并例如以ATCC號CCL-250保存。因此，某些牛奶蛋白質水解產物促進GLP-1分泌。
WO 98/31239描述了在至少一種另外的蛋白質級分存在下選擇性水解酪蛋白的方法。該方法提到如此獲得的制品對糖尿病有益。
本發明的目的是刺激來自胰高血糖素原的激素的分泌的一種或幾種分子。
另一的目的是發現生物活性分子，例如，因為它們是在特定的食物原料中自然產生的，所以認為它們是營養安全的。
本發明的其他目的是預防或治療II型糖尿病，調節血清中葡萄糖濃度，治療或預防以傷害腸黏膜上皮和/或腸黏膜上皮功能異常為特征的腸紊亂，增加腸粘膜的厚度和表面積，和/或降低食欲和食物攝取。
本發明的另一目的是改善人和哺乳動物中GLP-1和GLP-2的遞送。
發明概述令人驚奇地，通常與膠束酪蛋白結合或與之緊密地交互作用的奶的蛋白質級分能刺激GLP-1的分泌。可以通過將完整或酶處理的酪蛋白暴露于酸性條件釋放該蛋白質級分。迄今為止還沒有表征包含在該級分中的一些蛋白質。
因此，第一方面，本發明提供了獲取膠束酪蛋白酸溶性蛋白質級分的方法，其包括以下步驟-分離膠束或酶處理的酪蛋白和乳清蛋白質，-酸化膠束酪蛋白或酶處理的酪蛋白到pH低于6，-從酪蛋白中分離酸溶性蛋白質，和-分離酸溶性蛋白質的不同級分。
第二方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的亞級分，其特征在于它可以通過疏水作用層析獲得，并且通過包含26.4-36體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
第三方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的亞級分，其特征在于該級分可以通過疏水作用層析獲得，并且通過包含43.2-46.4體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
第四方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用作藥物或預防性或治療性治療人體或動物體。
第五方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于增強胰島素分泌和/或胰島素原基因的表達的消費品或藥物。
第六方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于預防或治療I型和/或II型糖尿病的消費品或藥物。
第七方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于增加GLP-1和/或GLP-2的分泌和/或調節血液中葡萄糖濃度的消費品或藥物。
另一方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于降低胃排空和酸分泌的消費品或藥物。
在另一方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于調節食欲，降低食物攝取和/或增加飽滿感的消費品或藥物。
另一方面，本發明提供了包含根據本發明的任一蛋白質級分或亞級分的消費品。
另一方面，本發明提供了來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備消費品或藥物，所述消費品或藥物用于治療以受傷或功能異常為特征的腸疾病和/或增加腸粘膜的厚度和/或表面積。
本發明的一個優點是它提供了能刺激GLP-1分泌的自然產生的有效成分。
本發明的另一個優點是所討論的蛋白質級分能容易地分離并以足夠量提供給任何食品。
本發明的另一優點是它提供了營養安全成分，其可以用于治療或預防I型和/或II型糖尿病、節段性回腸炎(Crohn’s disease)、短腸綜合征、調節血液中葡萄糖水平，和/或增加飽腹感及降低食物攝取。
在附圖中，
圖1比較牛奶的不同蛋白質級分體外刺激的GLP-1釋放。以0.5mG/ml(灰色條線)和5mg/ml(黑色條線)施用蛋白質，只是根據本發明的膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質除外，所述酸溶性蛋白質即使在低濃度下也顯示出對GLP-1釋放的最高影響(灰色條線)。用包含0.2％BSA，pH7.4的Krebs-Ringer平衡緩沖液(KRBB)制備奶提取物。對照僅由緩沖液(KRBB)和BSA(0.2％)組成。
圖2比較膠束酪蛋白酸溶性蛋白質的不同亞級分體外刺激的GLP-1釋放。不同的亞級分以相同濃度(30μg/ml)施用，發現特別地，亞級分5、7、8、10和11對GLP-1分泌顯示出明顯影響。將包含所有14種級分的最初混合物的全部以更高的濃度(5μg/ml)施用。
圖3顯示來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的14個級分的HI-HPLC(疏水相互作用高效液相層析)層析圖。水平軸闡明來自膠束酪蛋白的不同酸溶性蛋白質疏水性的增加，所述蛋白質分為所述14種不同亞級分。垂直軸指出從柱子上洗脫的蛋白質的量，其通過UV在214nm下檢測。
附圖的進一步詳細說明可以從實施例獲得。
發明詳述在該說明書上下文中，詞語“包含”是指“其中，包括”。不意在將其理解成“僅由...組成”。
在本發明的上下文中，術語消費品意在包括任何營養完全的或補充性可消費的產品。因此，該組合物可由人、寵物，如貓和狗，和/或其他動物消費。它可以是營養巴(bar)、小吃、營養配方，例如液態或粉末狀和可重構的配方、嬰兒或幼兒配方、冰淇淋、奶制品、糖制品、或它可以輔助物或藥物，其可以任選加入到另一食品中，如加入到上述食品中。它也可以是液態產品。
例如，如果食品是營養配方，它可以是確限配方或補充配方。確限配方通常由成人每天消耗1.8到2.2L的量，嬰兒每天0.6到1.4L。
如果配方作為補充使用，則每天的量為例如確限配方的約1/8到約1/2。
但是，根據本發明的消費品不限于任何產品。它可以是食品本身或是任意食品的成分或組分。
關于膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的方法，天然的或從乳清蛋白質來源的膠束酪蛋白，或從乳清蛋白質得到的酶處理的酪蛋白的分離可以用多種方法處理，如超速離心，或微量過濾。乳清蛋白質也可通過根據它們的疏水性選擇性除去特定乳清蛋白質而將其與酪蛋白分離。
調節pH到低于6，優選低于5，更優選低于4.8，例如，4.6，進行膠束或酶處理的酪蛋白的酸化。任何酸都是適宜的，只要它是食品級，如HCl、乙酸等。
從膠束酪蛋白中分離酸溶性酪蛋白可再次通過任何合適的方法獲得，所述方法為例如超速離心、過濾、傾析以及其它方法。
分離酸溶性蛋白質不同的亞級分可根據疏水性質進行，如用疏水作用層析(HIC)、疏水相互作用液相層析(HI-HPLC)，以及基于相似原理的方法。其它方法也是適宜的，如可利用不同級分的大小或電荷性質分離。
根據本發明的酸溶性蛋白質的亞級分可根據表1給出的洗脫特征來定義。表1顯示在乙腈濃度為26.4-36體積％-范圍內洗脫的級分相應于表1下面定義的在緩沖液A和B組成的混合物中緩沖液B的33-45體積％范圍。
上面的緩沖液B和緩沖液A的濃度范圍足夠表征所洗脫的蛋白質級分(表1)。對于上面的洗脫范圍，聚苯乙烯-二乙烯基苯顆粒優選用作固定相。來自Amersham的產品目錄號為No.15 RPC TN 17-0727-02的產品優選用作固定相。
具體地，根據上面特征的洗脫pH通常為1.8-2.2范圍，優選約2。該pH主要由三氟乙酸(TFA)的量決定。
除了可能未知的物質以外，亞級分6、7和8可能包含PP8(蛋白胨)，級分8和9包含PP8和PP5(蛋白胨)，級分10包含乳鐵蛋白(lactoferrin)，級分11包含β-乳球蛋白。
從而，在根據本發明的優選方案中，根據本發明的亞級分是亞級分5、6、7、8、10和11，它們在表1中通過在特定緩沖液或乙腈濃度范圍洗脫來表征。特別可以重新測試亞級分5，因為懷疑具有某種細胞毒性性質。
進行本發明的一中可能的方法首先分離此處報導的特定奶蛋白質級分。這可用任何足夠方法完成并至少有一些步驟是合適的。
例如，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質可通過超速離心從奶或脫脂乳(或衍生物)中分離酪蛋白而獲得。因此，如脫脂乳在30,000到90,000或最高110,000g超速離心45-90分鐘。可以回收組成膠束酪蛋白的沉淀物(或不溶蛋白質)。
可以通過將膠束酪蛋白分散在CaCl22mM/NaCl 0.9％，并如上超離心洗滌該膠束酪蛋白。
來自酪蛋白的酸溶性蛋白質可通過酸化洗滌過的膠束酪蛋白獲得，如上述。例如，膠束酪蛋白(不溶性蛋白質)可分散在20mM pH4.6的乙酸鈉緩沖液中。由于酪蛋白的緩沖行為，通過乙酸(或其它合適的酸)加入可實現約4.6的pH。
該溶液于是離心(如9,000到15,000g，20-50分鐘)，收集上清液，其含有來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質。
另一種從膠束酪蛋白中獲得酸溶性蛋白質的方法可以來自Proteincomposition of micellar casein obtrained by cross-flow micro-filtration ofskimmed milk，R.Jost，R.Brandsma，S.Rizvi，International Dairy Journal9(1999)389-90。
因此，天然酪蛋白是通過微量過濾而不是超離心獲得。因此，通過純物理方法可以用孔徑范圍為0.1-0.2μm的微量過濾膜將奶的膠束相與它的血清相分離。
例如，加熱到50℃的脫脂乳經1P19-40 Tetra-laval 1.4μmMembralox設備過濾可減少它的細菌負荷。然后將它加熱到55℃并在配備有CarbosepM14(0.14μm孔徑)膜的Tech-Sep 1S 151微量過濾裝置上分離。該奶從而以濃縮模式工作分級分離成存留物和透過液(permeatestream)。當達到濃縮因數3(cf3)后，添加脫礦質水開始滲濾。6初始體積水(cf3/cf6)滲濾后獲得的存留物組成膠束酪蛋白。
可用鹽酸(或其它酸，如乙酸)酸化再稀釋的存留物到pH4.6，并通過離心分離凝乳得到膠束酪蛋白的酸溶性部分。結果，3-5％的總N可從凝乳中分離為膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質。
在這種情況下，可以獲得蛋白質級分，其包含乳鐵蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白H-和L-鏈、具有與β-乳球蛋白相似的電泳遷移率的蛋白質。而且，該級分可能包含蛋白胨組分5(β-酪蛋白1-105/1-107)和蛋白胨組分8fast。
膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的其它組分由本發明定義。
當然，上述方法僅作為從膠束酪蛋白中分離或純化酸溶性蛋白質的例子。技術人員可以很容易地設想出其它方法來獲得它們。
例如，膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質經酶處理后(如，粗制凝乳酶)可能保留至少部分附著到酪蛋白。在該情況下，用酶處理奶，隨之回收由凝結的酪蛋白形成的凝乳，可以獲得膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質。通過如上述酸化可以將膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質至少部分地從凝乳中分離。
該方法可代替用離心或超過濾分離膠束酪蛋白，只要膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質主要保持與切割的酪蛋白質級分結合。
酸化奶或脫脂乳也可能回收膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質。根據本發明的蛋白質必須從酸性乳清中分離，后者還包含在酸性乳清中包含的其它可溶性奶組分(主要是α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白)。這可以通過適合選擇性除去上述乳清級分的任何合適的分離技術，如HICl或離子交換層析進行。
本發明基于令人驚奇地認識到膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質包含適合促進GLP-1和(與之結合的)GLP-2釋放的生物活性成分。
然而，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的進一步分級分離及篩選顯示膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的某些亞級分是優選的。
進一步分離更有效的亞級分可通過如疏水作用層析(HIC)，或通過疏水相互作用高效液相層析(HI-HPLC)，反相高效液相層析等實現，所有這些方法都基于相同的分離原理。
HIC的原理為技術人員已知的。通常地，樣品裝入包含能滯留該樣品的疏水材料的平衡柱(固定相)。疏水材料可以是，如，大孔交聯的聚苯乙烯，例如商品化的Amberlite Xad 16(XAD 16來自Rohm和Hass)。Amersham的15 RPC TN 17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯)或等同物也可使用。
在根據本發明的蛋白質級分裝載到柱子上之前，應該用緩沖液平衡柱子。裝載級分后，緩沖液或緩沖液混合物(移動相)可以流過柱子，其中緩沖液混合物改變并且可以具有根據疏水性從柱子洗脫的蛋白質亞級分，這些亞級分具有不同的性質。
根據該方法分離乳清蛋白質描述于″Simultaneous separation andquantitation of the major bovine whey proteins including proteose peptoneand caseinomacropeptide by reversed-phase high performance liquidchromatography on polystyrene-divinylbenzene″，D.F.Elgar等人，Journal of Chromatography A 878(2000)183-196。
從柱子上洗脫的蛋白質亞級分可用實現它們從固定相上洗脫的緩沖液混合物的組成或乙腈含量來精確描述。
例如，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質可以加到裝填聚苯乙烯-二乙烯基苯珠(15 RPC TN 17-0727-02，Amersham)的柱子上，緩沖液A可定義為水中的0.1體積％三氟乙酸(TFA)，緩沖液B可定義為水中的80體積％乙腈和0.85體積％TFA。
然后，緩沖液A和B的混合和傳輸可由特定系統，如FPLC(快速蛋白質液相層析)UNICORN工作站(Pharmacia，Amersham)控制，并流過柱子。
洗脫的蛋白質亞級分可由上述緩沖液A和B的混合比例的洗脫范圍來限定。利用特定的緩沖液組成，蛋白質亞級分的洗脫時間或間隔可簡單地由本發明的蛋白質級分在洗脫時的存在的乙腈的相對量來描述。然而，值得注意的是，洗脫順序是依賴pH值的。
下表1通過緩沖液B的體積百分比范圍或乙腈的范圍定義了根據發明的膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的14種酸溶性蛋白質亞級分，在所述乙腈范圍內洗脫根據本發明的優選實施方案的亞級分。
表1通過疏水作用層析定義的來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的亞級分
緩沖液A水TFA 0.1％緩沖液B乙腈/水/TFA(80％/19.15％/0.85％；v/v)柱子Source 15 RPC Amersham(基質聚苯乙烯/二乙烯基苯)，柱體積(CV＝100ml)梯度從20％B緩沖液開始，1柱體積(CV)后注射樣品，然后以15CV將梯度增加到高達75％B，然后用2CV達到100％B緩沖液。
如果希望，亞級分可通過蒸發、超濾或透析以除去有機溶劑進行濃縮，然后干燥，例如通過真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、烘烤干燥或任何其它適合的干燥方法干燥。
亞級分5、6、7、8、9、10和11在促進GLP-1體外釋放中特別有效并構成了本發明的優選實施方案。亞級分5、7、8和11構成了更優選的實施方案。
已經表明亞級分5對體外模型的細胞有毒性作用，因此可證明該級分在人或動物上的適用性較小。
膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質包含提高體外模型中GLP-1分泌的生物活性成分。
因此，級分或所選亞級分可用于調節依賴或由GLP-1、GLP-2或胰島素控制的過程。實例是預防或治療I或II型糖尿病，調節血糖濃度，抑制胃能動性和分泌，減少液體和固體的胃排空速率，減小小腸轉運，抑制平滑肌活動，降低膳食引起的葡萄糖偏離，延緩腸中營養物的酶分解和吸收，降低食欲，減少食物攝取，等等。
例如，該級分可用于降低人或動物的總體消化和吸收活性。
蛋白質級分可添加到消費品或藥物中。消費品的實例為營養配方、嬰兒配方或臨床配方。其它的實例是飲料，如耐儲存的、冷凍的或即時可飲的飲料。該級分可添加到其它食品，如巧克力、營養巴、谷類、奶制品、冰淇淋、冷凍食品、寵物食品、咖啡、膠囊劑、片劑等。
下面的實施例僅用于闡明并且決不能解釋為限制本發明的主題。除非另外指出，百分比和部分是按重量計算的。
實施例1從膠束酪蛋白中分離酸溶性蛋白質牛奶從當地市場獲得(瑞士，toni lait，2000-02-01)。
通過1000-4500g的離心從全脂奶提取乳酪。通過用固定角轉子SorvallGS3將加速度增加到13,600g(30分鐘內9000轉/分鐘)提高該步的選擇性。從2200ml全脂奶開始，在頂層回收90g乳酪。
然后，將250μl CaCl2200mM添加到250ml脫脂乳中達到2mM終濃度。將奶在固定角轉子45TI(Beckman L8-60M超速離心機；32,000轉/分鐘，對應于管中間100,000g)中超速離心(6管含42.1g脫脂乳)1小時從不溶的膠束酪蛋白分離乳清。
膠束酪蛋白(24g)分散于220ml CaCl22mM/NaCl 0.9％中并如上超速離心。將22g洗滌的經回收膠束酪蛋白分散在CaCl22mM/NaCl 0.9％中并將體積調節到250ml。將其等分試樣，標上不溶蛋白質(膠束酪蛋白)并冷凍。
從190g全脂奶開始，將所洗滌的不溶性蛋白質沉淀物(17g)分散在40ml乙酸鈉緩沖液20mM pH4.6中。
由于酪蛋白的緩沖行為，添加乙酸將pH(6.5)調節到4.6，通過添加醋酸鹽緩沖液將體積調整到最初奶體積的一半(90ml)。溶液經離心(12,000g，30分鐘)并將上清液(77g)標上來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質。
對于下面的實施例3，將樣品浸于液氮中冷凍，并在-20℃保存。
實施例2不同的牛奶級分促進的GLP-1釋放材料和方法MH(肉水解產物)和EAH(蛋白蛋白水解產物)購于Sigma，基質膠(matrigel)購于BD bioscience。CGMP根據WO 9853702中描述獲得。
獲得脫脂乳、甜乳清、酸性乳清、酸性酪蛋白、可溶性蛋白質、不溶性蛋白質的分級分離步驟從常規奶方法(見Alais C.1984 science du lait，Principe des Techniques Laiti ères，4 è me é dition，SEPAIC，Paris，29-35，159-178)改編。在更高的加速率下離心并洗滌不溶級分以增加選擇性和分離效率。
酸性酪蛋白是酸處理脫脂乳后從沉淀物收集的酪蛋白。可溶性蛋白質是以100,000g超速離心脫脂乳1h(見實施例1)后在水溶液中回收的蛋白質，不溶性蛋白質(膠束酪蛋白)是之后在沉淀中回收的部分。
來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質從實施例1獲得，基本上是通過酸化和離心上面段落的所得酸性酪蛋白獲得。
將NCI-H716人腸細胞系(ATCC號CCL-251)在37℃培養在含5％CO2的濕潤培養箱中。為了增殖，細胞懸浮生長在添加了10％FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培養基(Life Technologies Inc)中。對于分泌研究，將細胞接種在基質膠涂布的平板上，并在添加了10％FBS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM(低葡萄糖)(Life Technologies Inc)中孵育2天。
在實驗前兩天，細胞以一百萬個細胞/每孔接種在12孔板中。在實驗當天，細胞用HBSS(Hank′s Balanced Salt Solution；Life Technologies Inc)洗滌一次，并在不同蛋白質溶液存在下37℃孵育2小時。將受試蛋白質溶于含0.2％BSA(級分V；Sigma)的pH 7.4的1ml KRBB中(Krebs-Ringer平衡緩沖液)中。在培養期結束時，用10μl PMSF 200mM回收上清液并在-80℃立即冷凍。
以兩種濃度每ml培養基中0.5mg蛋白質和5mg蛋白質加入蛋白質溶液。
結果圖1顯示不同濃度(0.5和5mg/ml)的不同奶蛋白質級分對體外GLP-1釋放的影響。根據實施例1獲得的來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質即使在低濃度(0.5mg/ml)下也對GLP-1釋放具有最高影響。
總之，通過根據實施例1的方法獲得的來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質包含生物活性成分。這些因子可用于人或動物體的疾病預防或治療。GLP-1的釋放提示這些成分在預防和治療如糖尿病和肥胖癥中的有用性和工業應用性。
實施例3來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的亞分級分離如下進行疏水相互作用液相層析用。用100ml Source 15 RPC TN17-0727-02(聚苯乙烯-二乙烯基苯)填充的HR16×50柱連接由UNICORN工作站(Amersham Pharmacia Biotech)控制的FPLC系統。將15ml HCl酸溶性級分(見實施例1)在37℃水浴中解凍20分鐘，通過渦旋混合并在5415Eppendorf離心機中以13000轉/分鐘離心1分鐘。在0.45μm Millipore濾器(306/GSWP04700.GS)上過濾后，注射10ml該制備物。
層析條件為A緩沖液水中的0.1％TFA(在0.45μm Millipore系統上過濾的2000ml miliQ水，加入2ml TFA(Sigma 91699，100ml)；B緩沖液乙腈80％，TFA 0.85％(在0.45μm Millipore系統上過濾的400ml miliQ水，加入1600ml乙腈，并在超聲浴中脫氣15分鐘，最后加入1.7ml TFA)。
柱子用20％B緩沖液平衡。一個柱體積(CV)后，將樣品注入，B緩沖液在15個CV內增加到75％并在2.5CV內增加到100％。最后，梯度在0.4個CV內降低到20％。流速固定在3ml/分鐘。
用塑料管收集96個18ml級分。級分保存在-20℃。經HPLC分析后，通過HPLC圖的相似性將96個收集管合并成14個級分并蒸發濃縮后凍干用于隨后檢測。
記錄215nm處的紫外吸收，對應的HIC圖在圖3中給出。
用本說明書的表1中描述的它們從柱子上洗脫的時刻和對應的乙腈濃度(疏水性)表征來自膠束酪蛋白的14個酸溶性蛋白質亞級分。
實施例4實施例3的亞級分促進的GLP-1釋放根據實施例2中給出的實驗設計篩選實施例3中獲得的亞級分的GLP-1釋放促進能力。所有亞級分在30μg/ml的培養基中檢測，只有包括所有亞級分的“總級分”在500μg/ml的培養基中檢測。
在本實驗中提到，所檢測的疏水層析庫的濃度為比實施例2中來自膠束酪蛋白的最初酸溶性蛋白質的1/16-1/17(30μg/ml相比500μg/ml)。
結果在圖2中顯示。在體外幾乎所有級分都引起GLP-1釋放增加。用亞級分5、7、8、以及9、10、和11在非常低的蛋白質濃度(30μg蛋白質/ml培養基)發現非常強的增加。
然而，發現亞級分5對細胞系有毒性作用。
總之，亞級分7、8、9、10和11包含生物活性分子或成分。這些可作為藥物，其特別用于治療II型糖尿病，也可能治療I型糖尿病或肥胖癥。在人體或動物體內GLP-1的多種其它效果解釋了如權利要求中給出的亞級分的其他應用。
實施例5包含來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的營養配方根據推薦值(315KJ/dl)，用根據實施例1的膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質完成了按干物質重量百分比計包含14％蛋白質、62％糖、18％脂肪和3.2％礦物質和維生素的營養配方。
以生理有效量加入酸溶性蛋白質。在完整的、確限營養配方中(預計消費為每天2升)將最終濃度調節為0.1-0.5mg/ml配方。在作為其它營養物補充的配方中(預計消費為每天2升)中，調節濃度到1-5mg/ml配方。根據情況和個人需要使用更高的劑量。
實施例6包含來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質亞級分的營養配方實施例5的配方富含在實施例3中獲得的亞級分7和8的蛋白質，而不是實施例1所得到的蛋白質。
對于完整配方(見實施例5)，將營養配方中亞級分干物質的量調節到5-25μg/ml液態配方，對于2dl的日劑量調節到50-250μg/ml(補充品)。
還制備了包含亞級分的高劑量配方(對于上述2dl補充物濃縮10倍)。根據本發明的蛋白質濃度在2dl中為0.5-2.5mg/ml。
權利要求
1.得到膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質級分的方法，其包括步驟分離膠束酪蛋白或酶處理的酪蛋白和乳清蛋白質，酸化膠束酪蛋白或酶處理的酪蛋白到低于6的pH，從酪蛋白分離酸溶性蛋白質，和分離酸溶性蛋白質的不同亞級分。
2.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的亞級分，其特征在于它可以通過疏水作用層析獲得并且通過包含26.4到36體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
3.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的亞級分，其特征在于該級分可以通過疏水作用層析獲得并且通過包含43.2到46.4體積％乙腈的流動相從疏水固定相洗脫該級分。
4.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用作藥物或預防性或治療性治療人體或動物體。
5.根據權利要求2-4的酸溶性蛋白質，其中該酸溶性蛋白質包含選自根據權利要求2、權利要求3的蛋白質、 蛋白胨5、 蛋白胨8、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白和其混合物的蛋白質。
6.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于增強胰島素分泌和/或胰島素原基因表達的消費品或藥物。
7.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于預防或治療I型和/或II型糖尿病的消費品或藥物。
8.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于增加GLP-1和/或GLP-2分泌和/或調節血液中葡萄糖濃度的消費品或藥物。
9.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于降低胃排空和酸分泌的消費品或藥物。
10.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備用于調節食欲，降低食物攝取和/或增加飽滿感的消費品或藥物。
11.來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質的用途，用于制備消費品或藥物，所述消費品或藥物用于治療以受傷或功能異常為特征的腸疾病和/或用于增加腸粘膜的厚度和/或表面積。
12.消費品，其包含根據權利要求2-5任一項的任一種蛋白質級分或亞級分。
全文摘要
本發明涉及通過酸化膠束酪蛋白并將沉淀的酪蛋白即酸溶性蛋白質從膠束酪蛋白中分離可以獲得的奶級分。發現奶級分，特別是其某些亞級分具生物活性并且在體外促進GLP－1釋放。基于這些結果，來自膠束酪蛋白的酸溶性蛋白質可用于治療和預防II型糖尿病、肥胖癥并可進一步添加到針對處理胃腸道的其它目的的配方中。
文檔編號A23J3/32GK1860131SQ03827177
公開日2006年11月8日 申請日期2003年8月30日 優先權日2003年8月30日
發明者S·格萊姆里希, L·博韋托, C·梅斯 申請人:雀巢技術公司