專利名稱：可逆的、平行的和多任務的克隆方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種可逆的、平行的和/或多任務的克隆方法和試劑盒，它們改進了核酸構建體諸如載體或細胞染色體中的遺傳元件(優選多個)的克隆，也改進了在體內或者體外快速、高效地選擇正確整合了所述遺傳元件的構建體。
背景技術：
為了獲得含多個遺傳元件的復合分子構建體，選擇那些促成目的構建體含有的所述遺傳元件在正確位置、以正確方向組裝的遺傳事件(DNA片斷的插入和/或缺失和/或倒位)通常是一個耗時的過程。
尤其是，一個人必需面對可能在同一個反應管中選擇多個不同的遺傳事件(遺傳序列在核酸構建體中的插入、缺失、倒位)這一重要問題。
所以，分子生物學家通常應該在同一反應管中彼此分離地而不是同步地獲得遺傳事件(遺傳序列在核酸構建體中的插入、缺失、倒位)并且應該避免在所述的遺傳操作中犯任何錯誤(遺傳序列以錯誤的方向進行錯誤整合，等等，)。
發明目的本發明首要的目的涉及方法和工具，它們為上述問題提供了一種解決辦法，尤其是能夠讓分子生物學家插入和/或除去遺傳元件，或者謀求改變核苷酸序列中所述遺傳元件的表達方向(lectureorientation)(倒位)，無論在體內還是體外。
本發明另一個目的是提供允許在體內或者體外創建遺傳構建體(例如載體或者細胞的染色體)，通過多個遺傳元件的插入、缺失、和/或倒位進行組裝并進而選出正確整合(刪除或倒位)這些遺傳元件的所述遺傳構建體的方法和工具。
本發明更深遠的目的是為生物學家提供允許其平行操作本方法步驟以及在同一或不同反應管中同時進行多項作業(選擇多重遺傳事件)的工具。
本發明最后一個目的是提供使遺傳事件(插入和缺失和倒位)可逆的工具，這樣任何核酸構建體都可看作是一套可被重復利用的元件，即，可重復用于其它不同的核酸構建體的組裝的元件。
發明概述此后描述的方法和試劑盒中，本領域技術人員使用特定遺傳構建體，它是依照本發明進行克隆和選擇方法的工具。所述的工具為可整合入載體(質粒或病毒，包括噬菌體)或者細胞染色體基因組的遺傳構建體，其中所述載體或染色體基因組適于克隆并選擇各種遺傳元件的正確組裝。所有這些方法和系統允許一個或者多個外源遺傳元件(目的靶序列)整合到所述核酸構建體載體或者細胞染色體特定位點。外源遺傳(優選自體的)元件整合到本發明的核酸構建體可用本領域技術人員所熟知的技術來完成，諸如，但不限于經典的限制性酶切/連接、位點特異性重組、TOPO克隆和同源重組。遺傳元件的組裝可能涉及到核苷酸序列的插入、缺失和/或倒位。依據本發明的方法，選出正確插入的序列需使用特殊標記，這是一些核苷酸序列，所編碼的分子對細胞有毒性或者是此類毒性分子的抑制因子和/或能夠阻斷細胞表達的此類分子的毒性活性。所述分子優選為毒物和/或毒物抑制劑，優選選自(但不限于)下列毒物/解毒劑系統Ccdb/Ccda、Kid/Kis、Hok/Sok、Doc/Phd、RelE/RelB、PasA/PasB/PasC、MazE/MazF、ParE/ParD。
依據本發明的方法中，所述外源核苷酸元件有利地連(在其3’或者5’或者兩端)于一個或多個啟動子/操縱基因核苷酸序列，諸如，但不限于組成型啟動子，所述組成型啟動子使依照本發明整合于核苷酸構建體的靶核苷酸序列得以表達，只要他們依照合適的和所要求的表達方向放置。
依照本發明的方法，本領域技術人員使用恰當的、對一種或多種所述毒性分子具有抗性或者敏感的細胞株(原核的和/或真核的)以獲得和選擇重組體。細胞株的這些特性舉例說可能歸因于編碼毒物和/或解毒劑的基因的存在且整合進細胞的染色體或者存在于游離序列(諸如質粒)中。
可逆的克隆和選擇方法以及試劑盒本發明一個首要的方面涉及一種可逆的克隆方法和試劑盒，針對它們的幾個優選的特定例子詳述如下，參照圖2-5。
本發明的方法中所用的元件為特殊的細胞以及整合于載體或者細胞的染色體中的遺傳元件，所述遺傳元件包含-啟動子/激活子序列11，位于編碼兩個不同毒性分子(例如毒物1和毒物2)的第一和第二核苷酸序列(1，2)的上游(圖2，左)，或者-第一啟動子/激活子序列11，位于編碼毒性分子(例如毒物1)的第一核苷酸序列1的上游，以及位于與第一啟動子/激活子序列11表達方向相反的第二啟動子/激活子序列12，位于編碼第二毒性分子的解毒劑2’的第二核苷酸序列的上游(圖3，左)，或者-啟動子/激活子序列11，位于分別編碼第一毒性分子(例如毒物1)以及不同于所述第一毒性分子的第二毒性分子(例如毒物2)的解毒劑的第一和第二核苷酸序列(1，2’)的上游(圖4，左)。
-這里的術語“編碼毒性分子或者毒性分子的解毒劑的核苷酸序列”也囊括了含有編碼幾個相同毒性分子的多個編碼部分的序列。
外源靶核苷酸序列(A)“插入”編碼毒性分子成分的核苷酸序列(1)或者“取代其”可使得-編碼第一毒性分子的核苷酸序列1失活，且編碼第二毒性分子的序列2激活或者保持活化(圖2)；或者-編碼第一毒性分子的第一核苷酸序列1失活，且編碼第二毒性分子的解毒劑的核苷酸序列2失活(圖3)；或者-編碼第一毒性分子的第一核苷酸序列1失活(圖4)。
插入的外源遺傳元件(靶序列)可能是調控序列或目的基因(可能連接一個或多個啟動子/操縱基因序列)。
遺傳事件(插入)的選出可以在對第一毒性分子(圖.2&3&4)敏感且可能抗第二毒性分子(圖.2)的細胞株中進行。
但是，所述遺傳事件(插入或者置換)是可逆的，即可以用第一步中重組和插入后缺失掉的元件置換已插入的元件(靶序列)。這一靶序列的可逆缺失反應可以在對毒性分子1具有抗性并對毒性分子2(圖2，3，4)敏感以及可能產生毒性分子2(圖3&4)的株系中選擇。
此可逆克隆和選擇方法同樣適用于獲得插入的遺傳元件的倒位。下面詳述一具體例子，參照圖5。的確，通過本發明的方法(優選按照圖4的插入步驟)或者直接將靶序列插入到兩個不同的解毒劑序列之間(1’，2’)可以將目的序列的方向逆轉。連接啟動子/操縱基因(在3’或者5’末端)的所述遺傳元件(靶序列)最初整合于分別編碼兩個不同毒性分子1和2的兩種不同解毒劑的兩個核苷酸序列(1’，2’)中間。所述編碼兩種不同解毒劑的兩個核苷酸序列(1’，2’)位于相反的表達方向(以相反背離(opposite divergent)的表達方向位于靶核苷酸序列的上游和下游)。此構建體允許選擇重組事件，所述重組事件使得目的靶核苷酸序列及其關聯的啟動子要么與編碼第一毒性分子的解毒劑的核苷酸序列1’的方向相同(在既對毒物1敏感又產生毒物1的株系中進行選擇)，要么與編碼第二毒性分子的解毒劑的核苷酸序列2’的方向相同(在既對毒物2敏感又產生毒物2的株系中進行選擇)。(參見WO 02/066657，此處引用作為參考)平行的和/或多任務的克隆和選擇上述可逆克隆和選擇方法和元件(核酸構建體或者載體與特定細胞株)也可用于下述平行和/或多任務的克隆和選擇方法。(詳述于隨后參照
圖1的實施例中)。
多個外源遺傳元件(不同的靶序列)在載體或者細胞染色體上的組裝(體外或者體內)以及正確組裝的選擇是用含有一個或者多個(相同或者不同)毒性分子和/或其解毒劑的編碼序列的多個核酸構建體來獲得的。根據核酸構建體的類型以及選擇標記(編碼毒性分子和/或毒性分子的解毒劑)的類型，本領域技術人員能夠選出所述多個遺傳元件恰當的插入、缺失和/或倒位事件。
所述克隆和選擇方法或許需要有可能在同一反應管或單一細胞里進行(順次地)的多個步驟。
所述方法可與蛋白質體外合成(使用體外轉錄和翻譯試劑盒)的步驟和手段相結合。
本發明的另一方面涉及算法、計算機程序以及數據庫(包括可能存儲于計算機可讀介質上的編碼及手段)，它們可幫助進行本發明的方法中的一步或多步操作。所述的算法、數據庫以及程序編碼手段用來定義(但不限于)下列的正確組合-恰當的標記(編碼毒性分子和/或所述毒性分子的解毒劑)；-用于選擇恰當的遺傳事件的合適的細胞株；-恰當的起始前(pre-starting)核酸構建體；-將被插入、缺失和/或倒位的恰當的遺傳元件(靶核苷酸序列和/或他們的操縱基因/啟動子序列)；-分子構建體組裝/生產所必須的反應混合物(包括但不限于重組混合物、緩沖劑、培養基、酶…)。
該算法、計算機程序和數據庫也能夠控制本發明方法中的一個或者多個步驟，可能進行自動化操作。
本發明的另一個方面涉及試劑盒(克隆和/或選擇試劑盒)，包括用于施行本發明的方法的恰當的成分，尤其是上述計算機程序、核酸構建體、細胞株和/或克隆和選擇技術中用到的常見產品和培養基。
本發明的另一個方面涉及自動機，其可執行本發明方法以及使用上述試劑盒。所述試劑盒(克隆和選擇試劑盒，結合足夠的培養基、細胞和體外轉錄和翻譯試劑盒中的培養基)和自動機也可能包含其他要素，諸如緩沖溶液、移液元件(pipeting element)、基因擴增用引物、細胞培養基以及記錄結果和保存數據的手段。
隨后的實施例中將參照附圖對本發明進行詳細的描述，作為本發明多方面的非限制性示例。
附圖簡述圖1為實施本發明方法通過平行多遺傳事件而獲得的復合遺傳構建體的例圖。
圖2到5是本發明中可逆克隆和選擇方法和試劑盒的例圖。
發明詳述此項發明利用(i)同時和(ii)平行事件(各種重組和選擇事件以幾乎同樣的頻率出現)可制造復合遺傳構建體。本發明的“多任務”性質定義如下比如，本發明允許進行遺傳元件A和C的插入、遺傳元件E和F的缺失以及遺傳元件B和D的倒位，一些或者所有事件(圖.1)在體外(即，在同一試管中)或者體內(即，同一生物體中)同時進行。上述事件的最終產物是包含遺傳元件A、B、C和D且方向一致的復合構建體。利用針對每一事件的不同選擇標記(例如此處的毒物和解毒劑基因)達成對幾個遺傳事件(例如，此處為插入、缺失、倒位、重組)的同時選擇。實心黑色箭頭代表啟動子。
質粒1在對毒物1具有抗性的株系中擴增。質粒2在對毒物6和9具有抗性的株系中擴增。質粒3在下面某一株系中進行選擇-對毒物1和6敏感(用于選擇遺傳元件A和C的插入)，-對毒物3和5敏感(用于選擇遺傳元件B和D的倒位)，-對毒物7和8敏感(用于選擇遺傳元件E和F的缺失)，-對毒物9敏感(用于選擇發生在源于質粒1的構建體和源于質粒2的構建體之間的重組事件)，-以及產生毒物3、毒物5、毒物7和毒物8。
每一個“重組”事件的實現可以通過諸如，但不限于，經典的限制性酶切/連接、位點特異性重組或者同源重組這些技術來完成。每一個遺傳事件(插入、缺失、倒位等)的特異性由重組事件的特異性保證。例如，使用不同的鄰接于插入位點和插入片段的DNA序列(這些DNA序列可由本領域操作所述重組事件的技術人員選出)可以實現插入的特異性(插入(靶核苷酸序列)的位置和方向)。這些側翼序列構成不同的位點特異性重組元件(位點特異性重組的情況下)或構成不同的同源元件(同源重組的情況下)。利用針對每一事件的不同選擇標記達成對幾個遺傳事件(例如，插入、缺失和倒位)的同時選擇。由于每一個遺傳事件很少自然發生，選出所有事件同時存在的狀況需要使用非常高效的選擇標記(例如，但不限于，解毒劑/毒物基因)。
本發明中平行克隆的性質定義如下可以用上述多任務方法產生于同一反應混合物(即，在同一試管)的N個不同的遺傳構建體可以進行預先設計，使它們的組裝(此處指源于質粒1的構建體和源于質粒2的構建體二者的組裝)也能通過重組事件得以發生。換句話說，N-1遺傳構建體可看作供體，而1構建體可看作受體。例如，通過使用針對n-1個重組事件的n-1個選擇標記，N個構建體可以得以組合(圖1)。
而且，本發明允許將多任務/平行克隆方法得到的產物用作新反應的原材料(building block)。確實，本發明產出的構建體是原材料的獨特組合，這些原材料可被重新用于新的(不同)構建體；即本方法是可逆的并且是可擴展的，示于圖2至4。
圖2中，要插入的DNA片斷編碼目的靶序列和位于其3’末端的啟動子序列。在對毒物1敏感但對毒物2具有抗性的株系中缺失掉編碼毒物1的核苷酸序列1從而選出含有適當插入物的核酸構建體。插入最初除去的DNA片斷(即，5’端帶啟動子的編碼毒物1的核苷酸序列1)可以完成靶序列(DNA片斷A)缺失以重復利用原材料。這一逆轉事件在對毒物2敏感但對毒物1具有抗性的株系中選擇。質粒1具有在對毒物1抗性的株系中擴增。質粒2在對毒物2具有抗性的株系中擴增。
圖3中，靶序列(DNA片斷A)的插入可通過在對毒物1敏感的株系中缺失編碼毒物1的核苷酸序列1而選出。插入最初除去的DNA片斷(即，5’端帶兩個反方向啟動子的毒物1)可以完成DNA片斷A缺失，以重復利用原材料。這一逆轉事件在允許毒物2進行條件性表達、對毒物2敏感并對毒物1具有抗性的株系中選出。質粒1在對毒物1具有抗性的株系中擴增。質粒2在其活性不受質粒2存在與否的影響的任一株系中擴增。
圖4中，質粒1編碼了構成操縱子的毒物1和解毒劑2。靶序列(DNA片斷A)的插入可以通過在對毒物1敏感的株系中缺失編碼毒物1的核苷酸序列而選出。插入最初除去的DNA片斷(即，5’端帶啟動子的編碼毒物1的核苷酸序列)可以完成靶序列(DNA片斷A)缺失，以重復利用原材料。這一逆轉事件可以通過在允許毒物2進行條件性表達、對毒物2敏感并對毒物1具有抗性的株系中激活編碼解毒劑2的核苷酸序列而選出。質粒1在對毒物1具有抗性的株系中擴增。質粒2在其活性不受質粒2存在與否的影響的任一株系中擴增。
圖5中，靶序列(DNA片斷A)含有允許產生解毒劑的啟動子。DNA片斷A的倒位可用允許毒物2進行條件性表達但又對其敏感的株系選出。逆轉事件在允許毒物1進行條件性表達但又對其敏感的株系中選出。
換句話說，通過本發明制得的構建體不是終端產品(dead-endproduct)(即，只用于生產它們所要達到的目的)；它們可被再循環。這就強調了本發明軟件成分的重要性，因為它不僅創建一個原料數據庫，而且使創建業已完成、儲存(虛擬的存于計算機，真實物質存于冷凍或其他裝置)備用的產品的數據庫均成為可能。由于軟件能夠追蹤每一原料和產品的特征，所以它也能鑒定出哪些元件對未來新的多任務/平行/可逆的方法是(i)必需的以及(ii)彼此兼容的。
權利要求
1.適用于至少一個靶核苷酸序列(A)的插入/缺失和倒位的遺傳構建體(10)，包含-啟動子/激活子序列(11)，位于編碼兩種不同毒性分子的第一和第二核苷酸序列(1，2)的上游，或者-位于編碼毒性分子的第一核苷酸序列(1)的上游的第一啟動子/激活子序列(11)，和位于相反方向的第二啟動子/激活子序列(12)，其中所述第二啟動子/激活子序列(12)位于編碼不同于所述第一毒性分子的第二毒性分子的解毒劑(2’)的第二核苷酸序列的上游，或者-啟動子/激活子序列(11)，位于分別編碼第一毒性分子和不同于所述第一毒性分子的第二毒性分子的解毒劑的第一和第二核苷酸序列(1，2’)的上游。
2.適用于至少一個靶核苷酸序列(A)倒位的依照權利要求1的遺傳構建體(10)，包含-第一啟動子/激活子序列(11)，位于編碼毒性分子的第一核苷酸序列(1)和編碼不同于所述第一毒性分子的第二毒性分子的解毒劑的第二核苷酸序列(2′)的上游，和-位于第一啟動子/激活子序列(II°表達方向的相反方向，優選在第二啟動子/激活子序列(12)的控制下，編碼所述第一毒性分子的解毒劑的第三核苷酸序列(1′)。
3.依照權利要求1或2的核酸構建體，其中編碼毒性分子或者毒性分子的解毒劑的每個核苷酸序列(1，2，1’，2’)是編碼作為毒性分子或者所述毒性分子的解毒劑的融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白由編碼核苷酸序列構成，包括幾個獨特的克隆位點以及編碼針對細胞的毒性分子或毒性分子的解毒劑的核苷酸序列。
4.依照前面任一權利要求的核酸構建體(10)，進一步包括位于編碼毒性分子的核苷酸序列(1，2)和/或編碼毒性分子的解毒劑的核苷酸序列(1’，2’)的上游和下游的重組位點。
5.依照前面任一權利要求的核酸構建體(10)，其中編碼毒性分子以及毒性分子解毒劑的序列(1，2，1’，2’)是毒物/解毒劑序列，優選選自下列毒物/解毒劑系統CcdB/CcdA、Kid/Kis、Hok/Sok、Doc/Phd、RelE/RelB、PasA/PasB/PasC、MazE/MazF、ParE/ParD。
6.克隆載體，包含至少一個前面權利要求1至5中任何一項的核酸構建體(10)。
7.權利要求6的載體，進一步包含復制起點和選擇標記，優選抗生素抗性選擇標記。
8.被前面權利要求1至5中任何一項的核酸構建體或者前面權利要求6至7中任何一項的載體轉化或者含有整合于其染色體基因組上的至少一個依照前面權利要求1至5中任何一項的核酸構建體的細胞。
9.權利要求8的細胞，選自原核細胞、植物細胞、動物細胞(包括人細胞)和真菌細胞(包括酵母細胞)。
10.克隆和選擇試劑盒，包括一個或者多個依照前面權利要求1至5中任何一項的核酸構建體，一個或多個權利要求6或7的載體以及將被所述構建體或者載體轉化的細胞，所述細胞對一種或者多種所述毒性分子具有抗性或者敏感，表達一種或者多種所述毒性分子或者所述毒性分子的解毒劑。
11.一種把靶核苷酸序列(A)插入以及可能缺失和/或倒位于核酸構建體中的方法，包括以下步驟，優選用自動機操作-通過鑒定外顯子-內含子結構以及與表達基因數據庫進行比較而分析所述基因組序列，從而有可能從基因組數據庫中選擇所述靶核苷酸序列，-可能給出適合所述靶基因序列基因擴增和克隆的引物序列，-可能選出數據庫中存在的所述核酸構建體元件以及待被所述核酸構建體轉化的細胞，-可能給出適用于所述靶核苷酸序列整合的核酸構建體的設計也有可能把已經獲得的實際核酸構建體的設計存入目標存儲數據庫，-提供(可能來自所述設計)依照前面權利要求1至5中任何一項的核酸構建體，該核酸構建體可能整合于權利要求6或7的載體上或權利要求8或9的細胞中，并且通過失活編碼毒性分子的核苷酸序列而使所述靶核苷酸序列插入所述核酸構建體，以及-在對所述毒性分子敏感的細胞中選擇已經整合了所述靶核苷酸序列的核酸構建體。
12.權利要求11中的方法，進一步包括用靶序列插入后被刪去的元件替換所述靶序列，或通過整合具有倒位的表達方向的靶序列而替換所述靶序列。
13.權利要求11或12的方法，其中靶序列的整合、替換或者倒位用經典的限制性酶切/連接、位點特異性重組、TOPO克隆和同源重組來完成。
14.前面權利要求11至13中任何一項的方法，包括幾個靶核苷酸序列(A，B，C，D，E，F)插入/缺失和/或倒位到多個核酸構建體，以及優選在單個細胞或單個反應管中同時選擇已經正確整合、缺失或倒位了所述靶序列的構建體。
15.計算機程序，包括用于執行依照前面權利要求11至14中任何一項的步驟的程序編碼手段。
16.計算機程序產品，包括在計算機可讀介質上的程序編碼手段，當所述程序在計算機上運行時所述程序編碼手段能夠執行依照前面權利要求11至13中任何一項的方法步驟。
17.用于執行權利要求11-13中任一項的方法并且連于計算機數據庫的自動機，所述自動機包含依照權利要求1至5的核酸構建體或者依照權利要求6至7的載體或者依照權利要求8至9的細胞或者依照權利要求10的試劑盒組分，還可能包含權利要求15或16的計算機程序。
全文摘要
本發明涉及一種可逆的、平行的和/或多任務的克隆方法和試劑盒，它們改進了核酸構建體諸如載體或細胞染色體中的遺傳元件(優選多個)的克隆，也改進了在體內或者體外快速、高效地選擇正確整合了所述遺傳元件的所述構建體。
文檔編號C12N15/66GK1703509SQ03823305
公開日2005年11月30日 申請日期2003年9月3日 優先權日2002年9月3日
發明者C·茲皮爾, M·C·米林科維奇, P·加班特 申請人:布魯塞爾自由大學