用于細胞和組織培養的先進的滾瓶系統的制作方法

專利名稱：用于細胞和組織培養的先進的滾瓶系統的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及細胞培養，更具體地講，本發明涉及適合制備細胞產物的多腔室滾瓶。
背景技術：
的說明滾瓶通常被用于細胞生長和細胞產物的生產。細胞培養是在將滾瓶放入旋轉裝置，例如，由Synthecon，Inc.提供的RollerCell 40TM，或由Zinsser Analytic，Ltd.(UK)提供的R2P Roller Culture ApparatusTM中之后進行的。
一直需要提高細胞培養效率和產量。一般，培養物或產物生長條件，是根據細胞類型憑經驗優化的。存在決定操作參數的其他方法。然后，通常將反饋控制機制用于確保將條件保持在所述優化的參數內。某些反饋控制系統可能是復雜的，或者不能方便地適應滾瓶培養系統。例如，參見美國專利號4,839,292和6,323,022。
發明概述本發明提供了用于細胞培養的先進的滾瓶系統(ARBS)，它能有效地、連續地、和自動地用新培養基補充廢培養基。ARBS通過根據預定的條件改變排出廢培養基并且用新培養基補充所述廢培養基優化培養基。
所述ARBS系統包括多腔室的瓶子，其中，所述腔室是筒形的，并且彼此之間形成受控制的流體連通。在一種實施方案中，第一筒形腔室是用于容納新培養基的容器；第二筒形腔室是細胞或組織生長箱，而第三筒形腔室是用于容納廢培養基的容器。所述腔室之間的流體連通是通過轉移腔室實現的，而控制是通過閥操作實現的。第一和第二腔室之間的流體連通，可以控制在一旦滿足操作參數之后新培養基的添加。第二和第三腔室之間的流體連通允許在一旦達到了細胞產物的廢棄的或閾值濃度之后，可以將培養基從第二腔室取出。
所述流體連通是通過位于筒形腔室之間的端口中的一組控制閥控制或操縱的。所述控制閥的開啟和關閉，允許培養基通過轉移腔室從一個筒形腔室流向下一個筒形腔室。新培養基轉移腔室可以位于第一和第二筒形腔室之間，或包括一個或多個所述腔室的一部分。同樣，廢培養基腔室可以位于第二和第三筒形腔室之間或包括一個或多個所述腔室的一部分。
在一種實施方案中，所述滾瓶繞它的旋轉軸線順時針或逆時針旋轉，導致培養基在重力的作用下從一個腔室轉移到另一個腔室。
在ARBS旋轉時，新培養基轉移腔室從第一筒形腔室中挖起并且保持預定體積的新培養基。通過啟動閥，將所述保持的培養基釋放到第二個腔室中。在六點鐘的位置上，通過電磁閥打開允許培養基從第二筒形腔室流向廢培養基轉移腔室的控制閥，所述電磁閥是通過重力敏感型座席開關激活的。
在從它的最初的起始位置(十二點鐘位置)完成360度的旋轉之后，所述控制閥允許所述保持的培養基進入第二筒形腔室，并且，允許培養基從廢培養基轉移腔室流向第三筒形腔室的控制閥是通過電磁閥開啟的，該電磁閥是通過包含在調控器組件中的傳感器激活的。
可以選擇傳感器，以便可以測定與細胞或組織培養物或需要的產物形成相關的任何參數。在一種實施方案中，所述傳感器測定pH的改變。
在另一種實施方案中，所述傳感器測定氨離子濃度的改變。
在另一種實施方案中，所述調控器包括測定pH改變的傳感器和測定氨離子濃度的改變的傳感器。
所述調控器組件還包括第一和第二電磁閥，所述電磁閥可操作地連接在磁鐵上。重力敏感型座席開關激活第一電磁閥，由它啟動可操作地與它連接的磁鐵和位于廢培養基轉移腔室內部的相對的磁鐵之間的磁場。通過第一電磁閥和相對的磁鐵形成的磁場打開了所述控制閥，使得培養基能夠從第二筒形腔室流入廢培養基腔室。
當所述傳感器檢測到第二筒形腔室中培養基條件的改變，并且向第二電磁閥發送電信號時，第二電磁閥被激活。第二電磁閥啟動了與它連接的磁鐵和位于廢培養基轉移腔室和新培養基轉移腔室內的相對的磁鐵之間的磁場，以便開啟允許培養基從新培養基轉移腔室流向第二筒形腔室，以及允許培養基從廢培養基轉移腔室流向第三筒形腔室的閥。
本發明還提供了利用ARBS培養細胞的方法，其中，將生長培養基導入第一筒形腔室，并且將細胞或組織分別導入第二筒形腔室。通過沿順時針或逆時針方向旋轉ARBS，培養所述細胞或組織。
在該方法中，新的生長培養基從第一筒形腔室自動流入第二筒形腔室，并且可以監測第二筒形腔室中的pH或細胞產物濃度。在通過所述傳感器測定到理想的pH或細胞產物濃度時，所述傳感器啟動所述電磁閥，由它開啟所述控制閥，導致廢培養基從第二筒形腔室流入第三筒形腔室，并且，新的生長培養基從第一筒形腔室流入第二筒形腔室。
所述方法還可以包括回收步驟，其中，細胞產物是從ARBS系統的第二或第三個腔室中回收的。
細胞產物包括完整的細胞，組織，細胞部分，細胞代謝的分泌的分子或產物。
附圖的簡要說明

圖1表示組裝之后的本發明的ARBS。在圖1中示出的該組裝系統的部件是本發明的機電實施方案的典型例子。
圖2表示ARBS上部的放大示意圖。
圖3表示所述ARBS下部的放大示意圖。在該示意圖中示出的系統的部件是本發明機電實施方案的典型例子。
發明說明如圖1所示的本發明的ARBS總體上以三個腔室為特征新培養基容器(1)，生長箱(2)，和廢培養基容器(3)。新培養基容器(1)和廢培養基容器(3)以及生長箱(2)之間的恒定的培養基流動，是借助彈簧加載的閥自動實現的，所述閥是在ARBS繞它的縱向軸線旋轉360度時開啟和關閉的。所述閥的開啟和關閉可以通過機電或生理化學操縱。
ARBS還以具有如圖2和3所示的兩部分組成的組件為特征，其中，帶螺紋的部件(15)擰入螺紋接納部件(16)。類似地，可以將帶螺紋的部件(15)從螺紋接納部件(16)擰出，以便拆開ARBS，并且暴露出生長箱(2)。具有普通技能的普通技術人員能夠采用其他組裝和拆卸裝置，包括，但不局限于鉤子，夾子，凸形/凹形突出類型的連接裝置，真空密封，或將一個部件固定在另一個部件上的其他方式。
生長箱(2)是主要的培養腔室，將細胞或組織植入其中，將新培養基從新培養基容器(1)導入其中；并且將廢培養基從它里面排入廢培養基容器(3)。
培養基各種類型的細胞培養基可以與ARBS組合使用，并且可以通過在線和目錄批發商(例如，GIBCO，Sigma，和CellTech，Inc.)方便地獲得，并且能夠以具有多種營養組合的各種體積購買；有或沒有添加劑(例如，氨基酸，維生素，電解質)或有或沒有添加劑，如抗生素和/或抗氧化劑。本領域技術人員可以根據要培養的細胞或組織的類型，確定哪一種類型的培養基最適合特定的細胞培養方案。
例如，Dulbecco改進的Eagle培養基(DMEM)是常用的培養基，這種培養基能夠以多種形式獲得，包括高葡萄糖制劑，低葡萄糖制劑，和含有L-谷氨酰胺和鹽酸吡哆辛的F-12制劑。DMEM適合支持和維持多種類型的哺乳動物細胞。最初開發DMEM是為了生長小鼠胚胎細胞，它是基礎培養基Eagle(BME)培養基的改進形式，不過，氨基酸和維生素的濃度提高了四倍。推薦將1.0g/L的低葡萄糖制劑用于保持高密度培養物，和細胞在瓊脂中的生長。4.5g/L的高葡萄糖制劑被廣泛用于貼壁依賴型細胞類型(例如，中國倉鼠卵巢細胞或人胚胎腎細胞)(Dulbecco，R等，(1959)Virology 8396-397，和Smith，JD等，(1960)Virology 12185，還可參見Moton，HJ(1970)In Vitro 689)。
還可以將以下類型的培養基用于通過ARBS培養細胞或組織，這些培養基是以舉例形式提供的，而不是用于限定目的的。
表1細胞培養基

在被設計用于高密度細胞培養的裝置中(例如，miniPERMTM，旋轉燒瓶，滾瓶，或發酵罐)中，細胞和組織經受顯著的剪切力。可以通過調控生物反應器的速度，即滾瓶的轉速控制剪切力，或通過向所述培養基中添加抗剪切的添加劑控制剪切力。一種這樣的添加劑是可以從VivaScience，AG購買的cellPROTECTTM。所述cellPROTECTTM添加劑能夠提高培養基的黏度，并且保護細胞免受在培養中所經受的剪切力/應力的損傷。將所述celIPROTECTTM添加劑添加到培養基中，使它的濃度為占最終體積的0.05％-大約0.1％。可以將諸如cellPROTECTTM的能提高黏度的添加劑或具有高黏度的培養基類型用于本發明，只要它們與ARBS相容，并且它們的黏度不會妨礙培養基通過腔室和容器之間的閥流動就行。
ARBS機電組件在圖1和3所示出的ARBS的一種實施方案中，恒定的培養基補充和排放是通過腔室之間的培養基流動實現的，所述流動是通過補充閥(11a)，排泄閥(13a)，和廢物轉移閥(13b)控制的。在本實施方案中，所述閥是通過可分離的調控器(12)以機電方式控制的，該調控器具有pH或氨離子傳感器或能夠檢測pH改變和氨離子濃度改變的傳感器。調控器(12)還包括上電磁閥(7b)，下電磁閥(7a)，位置傳感器和調控器磁鐵(8a)，(8b)，和(8c)，這些磁鐵可操作地與電磁閥(7a)和(7b)連接，如圖3所示。
pH傳感器在ARBS的一種實施方案中，調控器(12)可以包括pH傳感器或pH計，它能啟動上電磁閥(7b)和下電磁閥(7a)，如圖1和3所示。例如，如果調控器(12)包括pH傳感器或pH計的話，一次性pH探頭(未示出)可以位于生長箱(2)內部，它通過生長箱(2)的表面板上的孔(未示出)可操作地與調控器(12)連接(參見圖3)。所述一次性pH探頭可以與調控器(12)分離，以便當ARBS組件的其余部分是一次性的時候，調控器(12)可以再利用。
用于測定液體中的pH的裝置是眾所周知的。具有薄膜類型的電極的玻璃傳感器是常見的，并且能可靠地用作pH測量的標準(參見，例如，Ohkawa H，Tanpakushitsu Kakusan Koso[Japanese](1998)43(3)272-80；和Moore EW，Gastroenterology(1968)54(4)501-7)。還可將非玻璃pH傳感器用作調控器(12)的部件，并且通常是用溶劑聚合物薄膜制備的(如Pretsch等披露的，(1986)Anal.Chem.582285-2289，被收作本文參考)。在非玻璃傳感器的范疇內，是具有平面結構的傳感器，這種傳感器通常比玻璃傳感器小，并且生產和操作的成本要低的多。平板傳感器的例子披露于授予Benco的美國專利號5,554,272和授予Foos的5,702,575中，這些專利以它們的整體形式收作本文參考。包括平板傳感器的儀器可以通過商業渠道獲得。所述傳感器的平板方式通常包括應用在基質基礎上的相對薄層材料，使用厚膜或薄膜技術，例如，包括絲網印刷。用作基質的材料可以是通過PLD(脈沖激光沉積)沉積的Al2O3或Ta2O5，或通過PECVD(等離子強化的化學蒸汽沉積)和LPCVD(低壓化學蒸汽沉積)涂在硅場效應結構上的Si3N4。在操作中，這兩種類型的傳感器都具有高的pH靈敏度和長期穩定性。另外，可以將聚苯胺薄膜用作高靈敏度平板pH指示器(Takenaka，Y等，(1990)Chemical sensor 6(Supplement A)77-80，和Takenaka Y等，第81-84頁，和Shinohara，H等，Chemical sensor 6(SupplementA)85-88)。
例如，如果DMEM是選擇用于細胞或組織培養物的培養基的話，典型的pH最佳值為大約7.4-大約7.5。調控器(12)的pH傳感器優選進行調準，以便對低于大約7.4，優選低于大約7.2，更優選低于大約7.0，最優選低于大約6.8的pH改變作出響應。
所述ARBS還能夠支持直接從活的有機體，優選哺乳動物，更優選人類中取出的外植體的細胞培養(原代細胞)(例如，活組織檢查材料或吸出液)。所述細胞培養物由混合的細胞類型群體構成。用于培養原代細胞的最佳pH為大約7.0，并且，在調控器(12)中所包括的pH傳感器優選進行調準，以便檢測低于大約7.0的pH改變；優選低于大約6.9；最優選低于大約6.8，用于原代細胞培養。
本領域技術人員能夠校準pH計，并且確定所使用的特定細胞培養方法或細胞或組織類型所能承受的最佳pH范圍，因此，調控器(12)不局限于任何一種細胞培養方法或細胞或組織類型的應用。
氨離子傳感器調控器(12)還包括氨(NH3)離子傳感器，用于分析生長箱(2)中的生長條件。氨離子傳感器可以包括聚合物膜電極，它由存在于惰性基質中的各種離子交換材料組成，所述基質如多孔特氟龍，聚氯乙烯(PVC)，聚乙烯或硅橡膠。在形成所述膜之后，將它封閉在PVC管的末端。這種類型的電極包括鉀，鈣和硝酸鹽。
具有固態電極的氨離子傳感器，將相對不溶性的無機鹽用于膜中。固態電極是以均相或異相形式存在的。在這兩種類型中，由于離子交換過程，在所述膜表面上形成了電位。固態電極的例子包括銀/硫化物，氯化物和氟化物。
具有氣體感測電極的氨離子傳感器可用于測量氨，二氧化碳，氧化氮和二氧化硫。這種電極具有氣體可滲透的膜，和內部緩沖溶液。所述緩沖溶液的pH根據氣體而改變。這種改變是通過在外殼內組合的pH傳感器檢測的。由于它的結構，氣體感測電極不需要外部參考電極。
在本實施方案中，將要培養細胞或組織植入生長箱(2)。可以將細胞和組織直接植入生長箱(2)，生長箱的內表面可選擇性地衍生化，或者可以通過用所述細胞或組織進行工作臺接種導入。為了方便將細胞或組織植入生長箱(2)，ARBS優選在帶螺紋的部件(15)和螺紋接納部件(16)的界面上分離(旋開)。
生長箱的衍生化的內表面生長箱(2)的內表面可選擇性地進行衍生化，以便有利于通過已知方法結合細胞。可以用氨基，活性鹵，羥基，或硫醇基，或取代的N-羥甲基乙酰胺衍生化，其中，所述取代基是活性鹵或擬鹵素。可以通過讓含水培養基中的蛋白或線性肽與具有活性鹵基，活化的羧基，例如酯等的官能化表面，在溫和條件下接觸足夠的時間，以便完成衍生化反應而結合蛋白或線性肽。任何殘余的未反應的官能團，都可以通過使用合適的小分子-封端劑封閉。例如，活性鹵基可以用脂族胺封閉，硫醇可以用馬來酰亞胺封閉等。在某些實施方案中，可能沒有必要封閉多余的活性基團，因為它們不會影響所述衍生過程中的隨后的步驟。
如果選擇免疫學細胞，例如，B-細胞培養的話，生長箱(2)的內表面可以用B-細胞識別的抗原衍生化(例如，CD20)或通過與可溶性抗原的專一性結合衍生化，其中，可以將所述抗原添加到所述細胞中，以便所述細胞具有表面免疫球蛋白，它能識別所述抗原，并且結合所述抗原，以便形成被內吞和加工的復合物。將會呈遞具有細胞MHC抗原的抗原片段。通過將T-細胞添加到由B-細胞限制的培養基中，能識別所述抗原片斷的T-細胞能分泌淋巴因子，導致所述B-細胞增殖。
利用ARBS的機電實施方案進行細胞培養在植入時，將ARBS放入滾動裝置中，在這里，它圍繞它的縱向軸線旋轉。由重力敏感型座席開關(未示出)檢測所述ARBS業已相對它的起始位置轉動了180度(以下稱之為六點鐘的位置)。例如，這種重力敏感型座席開關可以是水銀傾斜開關或均重桿開關。
水銀傾斜(或″翻倒″)開關是基于簡單的結構，除了移動的水銀之外，它沒有其他活動部件。從機械角度講，這種開關所經受的磨損很小，并且具有很長的預期使用壽命，平均使用次數為數千萬次(Durakool，DANA，由美國電子元件公司銷售)。
還可將非水銀型″翻倒開關″用作旋轉傳感器。一種此類非水銀開關可以從Comus獲得，并且具有0.360″×0.310″的外殼，并且適合在-37-100℃的溫度下工作(還可以從Durakool，DANA獲得)。
在六點鐘的位置上，如果調控器(12)檢測到生長箱(2)的培養基中pH的改變或氨離子濃度的改變，或這兩者的改變超過了預定的閾值，調控器(12)就發送電信號，激活下電磁閥(7a)。激活的下電磁閥(7a)接合調控器磁鐵(8a)，與相對的內部磁鐵(9a)形成磁場。內部磁鐵(9a)反過來又壓縮廢物轉移閥(13b)內的彈簧，從而打開該閥門。打開的廢物轉移閥(13b)使得培養基從生長箱(2)流入廢物轉移腔室(6)。
廢物轉移腔室(6)具有容納生長箱(2)中的所有培養基體積的容量，通常大約為15mL。在六點鐘的位置上，廢物轉移腔室(6)可以完全充滿，如果需要這樣的話，不過，優選充滿大約6％的容量，更優選大約7％的容量，最優選大約8％的容量。將廢培養基或新培養基從一個腔室轉移到另一個腔室所需要的時間，在一定程度上與這些腔室之間的孔的大小相關。所述電磁閥在“六點和十二點鐘”的位置上的整個30度范圍內一直是開啟的。保持這種開啟狀態的時間取決于該裝置的旋轉速度。
當ARBS完成一周的旋轉時(從它的起始位置旋轉360度；以下稱之為“十二點鐘”的位置)，新培養基轉移腔室(5)從新培養基容器(1)中挖起大約8mL，優選大約9mL，最優選大約10mL新培養基。
在十二點鐘的位置上，上電磁閥(7b)被來自調控器(12)的電信號激活，并且與調控器磁鐵(8b)和(8c)接合。調控器磁鐵(8c)與相對的內部磁鐵(9c)形成了磁場，迫使排泄閥(13a)打開，并且在六點鐘的位置上將進入廢物轉移腔室(6)的廢培養基排泄到廢培養基容器(3)中。與此同時，上電磁閥(7b)還啟動了調控器磁鐵(8b)，與相對的內部磁鐵(9b)形成磁場。內部磁鐵(9b)下壓彈簧(10)，它是通過由活塞部件(11c)沿ARBS′的水平軸線方向推壓臂(11b)完成的，從而打開補充閥(11a)。打開的補充閥(11a)使得從新培養基轉移腔室(5)中挖起的培養基能進入生長箱(2)。
細胞和組織培養物需要通氣，以便能適當地生長。在ARBS旋轉時，通過與生長室(2)連接的通氣管(4)用環境空氣，優選是消毒的對生長箱(2)通氣。如圖1和2所示，通氣管(4)延伸穿過新培養基容器(1)，并且突出通過螺紋頂部(17)，在這里，它通過通氣的蓋子(18)與環境空氣接觸。
ARBS優選完成一周的旋轉，以便在調控器(12)進行下一次讀數之前平衡。
ARBS組件的其他部件包括管帽(14a)，它能夠在不拆卸所述系統和管帽(14b)的前提下更換新培養基容器(1)中的新培養基或添加添加劑，營養物，生長因子等，可以在不拆卸該系統的前提下從廢培養基容器(3)中排出廢培養基。在ARBS使用期間，可以用合適的帶螺紋的頂部(未示出)封閉管帽(14a)和(14b)。
通過管帽(14b)從廢培養基容器(3)中排出的培養基可以扔掉或保存。在使用ARBS培養細胞的某些方法中，保存廢培養基，以便開發在細胞生長和代謝期間分泌的需要的細胞產物。在本文中，術語“細胞產物”表示包括完整的細胞或組織或其中的任何亞結構(例如，細胞器或細胞膜)，分泌的離子，分泌的化合物，分泌的分子，抗體或其他免疫球蛋白，抗原，蛋白，細胞因子，激素，有機化合物，藥用化合物，或其他感興趣的生物分子。細胞產物還包括由調控器(12)內所包含的傳感器檢測的物質(例如，離子)，所述物質的檢測啟動了培養基在ARBS的腔室之間的流動。所述細胞產物可以從在廢培養基容器(3)中收集的廢培養基中收獲。
可以對生長箱(2)的內表面進行衍生化，以便促進細胞結合。另外，還可將顆粒或支架用于細胞或組織結合。所述顆粒，例如，小球或支架可以是衍生化的。所述支架的優選形狀是筒形模塊樣部件，可將它方便地插入或取出生長箱(2)。能夠方便地插入和取出生長箱(2)的其他形狀也包括在本發明的范圍內，例如，碟形支架。開孔泡沫的支架是特別理想的，因為這種結構允許利用各種已知的細胞回收技術和材料方便地漂洗和分離細胞。
用于漂洗和從所述支架上分離細胞的一種合適的機制使用含有諸如胰蛋白酶的蛋白水解酶的溶液。用于分離細胞的其他合適的機制包括超聲波或攪拌，只要施加在所述細胞上的力不會誘導裂解就行。不過，如果所述細胞被最終用于提取分析(例如，分離細胞內細胞產物，代謝物或細胞膜表面分子或部分)的話，抑制裂解就變得不那么重要了。技術人員能夠理解的是，本領域已知的任何方法都可用于漂洗或從所述支架上分離培養的細胞，以便適合所述培養細胞的最終用途。
ARBS生理化學組件在另一種實施方案中，可以通過用pH水凝膠取代調控器(12)組裝ARBS，這使得整個ARBS成為一次性的。
在ARBS的所述生理化學實施方案中，pH水凝膠根據pH的改變擴張和收縮，對補充閥(11a)，排泄閥(13a)，和廢物轉移閥(13b)施加力，導致它們打開和關閉。
這里所使用的pH水凝膠是聚合材料，它能夠在水和其他溶劑中膨脹，吸收聚合物網絡中的流體，而又不會溶解。親水性水凝膠在平衡狀態下具有大的含水量和良好的相容性。pH-敏感型水凝膠一直是最廣泛地研究的親水性水凝膠。pH-敏感型水凝膠是交聯的，以便通過若干種類型的交聯力，如共價鍵，氫鍵，或疏水性相互作用形成穩定的凝膠。
所定義的酸性水凝膠是離子化的，因此，能在高pH條件下膨脹，而在低pH下不帶電荷，并且不膨脹。堿性水凝膠的膨脹表現對于pH具有相反的依賴性，這使得它適合應用于ARBS。所述pH敏感性是由酸性和堿性側基導致的，如羧酸，磺酸，伯胺，和季胺鹽。例如，羧酸基團在高pH下是帶電荷的，而在低pH下是不帶電荷的，而對于伯胺基團和季胺鹽來說，情況正好相反。特定側基的過渡pH是通過所述側基的pKa值確定的。因此，通過選擇具有合適pKa值的側基，可以構建親水性水凝膠，它可以根據任何水平的pH刺激可恢復地離子化，導致凝膠的性能改變。所述pH范圍取決于所選擇的特定細胞類型或所需要的細胞產物。所述水凝膠是根據需要的目標pH范圍選擇的，優選在所述目標pH范圍內具有快速的膨脹/去膨脹過渡。所述水凝膠和閥的位置是關鍵的，并且需要外部磁鐵以便結合在輥筒架上，需要用它起到位置傳感器的作用。
優選的pH-敏感型水凝膠源于多種聚合化合物，如聚(烷基丙烯酸酯)，聚(丙烯異丁烯酸酯)，聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)(HEMA)，聚(2-羥丙基異丁烯酸酯)(HPMA)，聚(丙烯酰胺)，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)(PVA)，聚環氧乙烷(PEO)，聚(乙醚尿烷)，和聚電解質。上面所列舉的用于合成均聚物的單體還能夠以各種組合形式使用，以便形成共聚物。由所述聚合物形成的pH-敏感型水凝膠在分別添加酸和堿時能夠可恢復地收縮和擴張。業已證實，在突然改變聚(甲基異丁烯酸酯-共-N，N-二甲基氨基乙基異丁烯酸酯)水凝膠的pH之后，對pH改變的反應可以是快速的和可恢復的。具有本領域普通技能的人員了解如何組合幾種聚合物，以便形成復合pH敏感型水凝膠。
pH-敏感型水凝膠的膨脹和構建改變的平衡度受若干種因素的影響，如離子單體的電荷，可離子化基團的pKa，可離子化側基在所述網絡中的濃度，pH，離子強度，培養基的介電常數，交聯密度，聚合物主鏈的親水性和疏水性。上述因素在Helle B等的文獻中進行了討論，pH-sensitive hydrogel；Characteristics and Potential in DrugDelivery in Properties，Preparation，and Application(Eds.Harland等)1992。
所述離子單體的電荷影響pH-敏感型水凝膠的構像改變。酸性水凝膠在低pH下是不帶電荷的，但是，在高pH下會離子化。因此，當提高含有酸性側基的水凝膠中的pH時，膨脹的平衡度會提高。水凝膠的膨脹對pH的依賴性相反。基于異丁烯酸，硫氧基乙基異丁烯酸酯，HEMA，或HPMA的水凝膠業已被普遍用于獲得酸性，堿性，和兩性凝膠。業已研究了受離子基團類型影響的膨脹(Chen，LL等，(1998)Pharm.Dev.Technol 3(2)241-9)。
所述凝膠中的可離子化的側基的pKa值影響pH膨脹曲線(Chen，同上)。堿性可離子化基團的pKa值的降低會使所述曲線向低pH值方向偏移。業已證實，這種膨脹反應對接近水凝膠的可離子化基團的pKa值的pH值時最敏感(Eichenbaum GM等，(1998)Macromolecules 31(15)5084-93)。所述水凝膠中可離子化的單體的濃度對于凝膠的膨脹和pH敏感性來說是重要的。與中性共同單體相比，這種影響取決于可離子化單體的相對親水性。pH敏感型聚合物主鏈的疏水性和親水性影響膨脹。業已證實，提高所述聚合物主鏈的疏水性，能減弱共聚物聚(n-烷基異丁烯酸酯-共-N，N-二甲基氨基乙基異丁烯酸酯)和共聚物苯乙烯和4-乙烯基吡啶(VP)的pH敏感性。緩沖液組成和離子強度影響pH-敏感型水凝膠的膨脹。抗衡離子能屏蔽聚合物主鏈上的電荷。所述凝膠內和外的離子濃度將會是相等的，并且凝膠內的滲透壓會隨著凝膠外的離子濃度的提高而降低。含有多價離子的緩沖液能夠中和凝膠內的一些電荷。交聯密度對于pH敏感型膨脹來說是重要的。提高了的交聯密度會限制膨脹的平衡度。如果所述凝膠是通過pH改變離子化的話，這種作用更明顯。所述水凝膠的網絡特性主要受合成變量的影響，特別是化學組成和交聯密度(Chen，同上，還可參見Mandal TK等，(2000)Pharm.Dev.Technol.5(4)555-60)。
優選的pH-敏感型水凝膠閥門，包括用各種類型的異丁烯酸酯合成的共聚物，所述異丁烯酸酯是通過自由基溶液聚合，由單體形成的。所述共聚物是堅韌的柔性聚合物，而不是柔軟的凝膠。它們是高度生物相容性的；并且它們是惰性的和不會降解的，并且在用于諸如ARBS的滾瓶時是理想的，它會恒定接受由于培養基在腔室之間運動所產生的剪切應力。例如，N，N-二乙基-氨基乙基異丁烯酸酯(DEAMA)和2-羥丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)的共聚物凝膠的膨脹，會隨著培養基pH的降低而加強。Ishihara K.等業已證實了這一點(1984)Poly J.16625-631。相反，HEMA均聚物的含水量不取決于培養基的pH。因此，由于導入了DEAMA部分，含水量隨著HPMA共聚物水凝膠的pH而改變。當培養基的pH降低時，所述DEAMA部分被認為是質子化的，它能提高DEAMA部分和水凝膠的親水性。DEAMA和HPMA共聚物水凝膠的含水量可以根據pH的改變而恢復。
上面所引用的所有文獻都被收作本文參考，無論是否專門指出了要被收作了本文參考。
在業已對本發明進行全面說明之后，本領域技術人員可以理解的是，本發明可以在不超出本發明的構思和范圍，并且在不進行過多實驗的情況下，可以在等同參數，濃度，和條件的較寬的范圍內實施本發明。
盡管業已結合本發明的具體實施方案對本發明進行了說明，應當理解的是，可以對本發明做進一步的改進。本申請意為包括遵循本發明原理的任何改變，用途，或改良，并且包括本發明所屬領域的公知的或通常的實踐的偏離本文說明的方案，并且可應用于所述實質性特征。
權利要求
1.一種具有至少三個筒形腔室的多腔室滾瓶系統，包括適合用作細胞生長培養基腔室的第一筒形腔室，它具有至少四個口，其中，兩個口位于外側壁上，一個提供了空氣源的入口，另一個提供了第一筒形腔室的總入口，并且，其中的另外兩個口位于內側壁上，其中，第一和第二筒形腔室是貼在一起的，一個口通過與所述外側壁上提供了空氣進入的口連接的導管提供了第二筒形腔室的空氣源的入口，而另一個口通過控制閥提供與第二筒形腔室的受控制的流體連通；適合細胞或組織生長的第二筒形腔室具有至少三個口，兩個口位于與第一筒形腔室貼在一起的側壁上，一個口與位于第一筒形腔室的內側壁上的構成空氣入口的口共同延伸，而另一個口與第一筒形腔室的提供受控的流體連通的口對齊，而第三個口通過控制閥提供了與第三筒形腔室的受控制的流體連通；適合接納廢培養基并且具有至少兩個口的第三筒形腔室，一個口位于與第二筒形腔室貼在一起的外側壁上，并且提供了通向第三筒形腔室的總的入口，而第二個口與第二筒形腔室的第三個口對齊，提供了與第二筒形腔室的受控制的流體連通；以及控制裝置，用于順序啟動所述閥，以便產生從每一個相應的腔室到位于所述腔室的預定旋轉位置上的其他腔室的受控制的流體流動；其中，第一、第二和第三筒形腔室是相互連接在一起的，以便允許所述筒形腔室作為一個單一的組件繞旋轉軸線旋轉，并且，其中，所述流體連通的控制允許將生長培養基從第一筒形腔室導入第二筒形腔室，并且將廢培養基從第二筒形腔室中排出，使它從第二筒形腔室進入第三筒形腔室。
2.如權利要求1的滾瓶系統，其中，提供了第一筒形腔室與第二筒形腔室的受控制的流體連通的所述口包括控制流體通過所述口流動的閥，和位于第一筒形腔室中的新培養基轉移腔室，其中，所述新培養基轉移腔室的兩個壁是第一筒形腔室的弧形壁和所述內壁的一部分，并且，在所述滾瓶從六點鐘的位置轉動到十二點鐘的位置期間，新培養基轉移腔室從第一筒形腔室鏟起并且保持生長培養基，其中，所述閥在六點鐘的位置上是關閉的，并且在十二點鐘的位置啟動，以便將培養基釋放到第二筒形腔室中。
3.如權利要求1的滾瓶系統，其中，所述提供與第三筒形腔室的受控制的流體連通的口包括控制流體從所述口流入第三筒形腔室的第一個閥，以及位于第三筒形腔室中的廢培養基轉移腔室，它接收當第二個閥根據存在于第二筒形腔室中的傳感器而被啟動時從第二筒形腔室中流出的廢培養基，其中，所述廢培養基轉移腔室的兩個壁是第三筒形腔室的弧形壁和所述內壁的一部分，并且，所述腔室在所述滾瓶從六點鐘的位置旋轉到十二點鐘位置的旋轉期間，其中，在六點鐘的位置第一個閥是閉合的，而第二個閥是開啟的，開啟了的第二個閥允許廢培養基流入所述廢培養基轉移腔室，而第一個閥在十二點鐘的位置上是開啟的，以便將培養基釋放到第三筒形腔室中。
4.如權利要求1的滾瓶系統，其中，所述第一和第二筒形腔室是通過結合凸形結合部件和凹形結合部件相互連接在一起的，其中，每一個部件環繞提供通向第二筒形腔室的空氣入口的口和導管。
5.如權利要求1的滾瓶系統，其中，所述控制裝置包括重力傳感器開關，第一和第二電磁閥，其中，第一電磁閥可操作地與第一和第二磁鐵連接，第二電磁閥可操作地與第三磁鐵連接。
6.如權利要求1的滾瓶系統，還包括至少三個磁鐵；至少兩個磁鐵位于與第二筒形腔室貼在一起的第三筒形腔室的內壁上；并且至少一個磁鐵位于與第二筒形腔室貼在一起的第一筒形腔室的內壁上，所述至少三個磁鐵是作為與可操作地與第一和第二電磁閥的磁鐵相對的磁鐵定位的。
7.如權利要求1的滾瓶系統，其中，第一和第二電磁閥中的一個或兩個是開啟的，并且，其中，一個或多個可操作地連接的磁鐵與一個或多個相對的磁鐵構成了磁場，由一個或多個相對的磁鐵打開一個或多個控制閥。
8.如權利要求7的滾瓶系統，其中，所述第一電磁閥是通過傳感器啟動的。
9.如權利要求8的滾瓶系統，其中，所述傳感器監測pH的改變。
10.如權利要求8的滾瓶系統，其中，所述傳感器監測細胞產物濃度的改變。
11.如權利要求10的滾瓶系統，其中，所述細胞產物是氨離子。
12.如權利要求7的滾瓶系統，其中，所述第二電磁閥是由重力敏感型座席開關啟動的。
13.如權利要求12的滾瓶系統，其中，所述重力敏感型座席開關選自水銀傾斜開關或均重桿開關。
14.如權利要求7的滾瓶系統，其中，所述啟動的第二電磁閥打開了所述控制閥，由它啟動生長培養基從第二筒形腔室向所述廢培養基轉移腔室中的轉移。
15.如權利要求1的滾瓶系統，其中，所述控制裝置位于第二腔室的外側，以便所述控制閥能夠直接以位置依賴形式啟動。
16.如權利要求1的滾瓶系統，其中，所述閥包括生理化學響應型水凝膠。
17.一種用于細胞和組織培養的方法，包括以下步驟A)將生長培養基導入如權利要求1的滾瓶系統的第一筒形腔室，并且將細胞或組織導入第二筒形腔室，B)通過使所述滾瓶繞它的縱向軸線旋轉培養所述細胞或組織，C)使新的生長培養基從第一筒形腔室流入第二筒形腔室，D)監測第二筒形腔室中的細胞或組織培養物參數，并且在測定到預定的閾值細胞或組織培養參數時，使得廢培養基從第二筒形腔室流入第三筒形腔室。
18.如權利要求17的方法，其中，步驟C)包括在旋轉期間將生長培養基通過開口從第一筒形腔室導入第一轉移腔室，其中，所述新培養基轉移腔室包括壁，和提供了與第二筒形腔室的受控制的流體連通的所述口，并且，其中，當所述滾瓶處在六點鐘的位置時，所述閥是閉合的，導致所述新培養基轉移腔室容納并且保留培養基，而在十二點鐘的位置上啟動，以便將保留的培養基釋放到第二筒形腔室中。
19.如權利要求17的方法，其中，步驟D)包括在滾瓶旋轉期間根據所述傳感器的信號通過由第一個閥控制的開口將廢培養基從包括閾值信號傳感器的第二筒形腔室導入廢培養基腔室中，其中，所述廢培養基轉移腔室包括壁，控制所述開口以提供與第三筒形腔室和所述口的受控制的流體連通的第二個閥，并且，其中，當所述滾瓶處在六點鐘的位置上時，第二個閥是閉合的，導致第二轉移腔室容納并且保留培養基，只有在滿足細胞或組織培養物參數值閾值時，所述第一個閥才啟動到六點鐘的位置的開放狀態，使得用廢培養基充滿所述廢培養基轉移腔室，并且所述第二個閥在十二點鐘的位置上開啟，以便將廢培養基釋放到第三筒形腔室中。
20.如權利要求17的方法，其中，所述細胞或組織結合在表面上。
21.如權利要求17的方法，其中，所述細胞或組織結合在衍生化的表面上。
22.如權利要求17的方法，其中，所述細胞或組織結合在可除去的表面上。
23.如權利要求17的方法，其中，所述細胞或組織結合在可除去的衍生化的表面上。
24.如權利要求17的方法，還包括以下步驟E)從所述滾瓶系統中回收細胞產物。
25.如權利要求24的方法，其中，所述回收步驟包括從第二和/或第三筒形腔室中取出細胞產物。
26.如權利要求17的方法，其中，所述細胞或組織培養物參數是pH或氨離子濃度。
全文摘要
本發明提供了用于細胞培養的先進的滾瓶系統，它能夠有效地、連續地、和自動地用新培養基補充廢培養基。所述滾瓶系統通過根據預定的條件變化排出廢培養基并且用新培養基補充所述廢培養基，對培養基進行優化。
文檔編號C12M3/04GK1675351SQ03819053
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月4日 優先權日2002年8月8日
發明者N·F·小羅賓斯 申請人:貝克頓·迪金森公司