使用磺酸化合物降解蛋白質的方法

專利名稱：使用磺酸化合物降解蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種降解蛋白質的方法，及一種用蛋白酶處理樣品中糖化蛋白并使用一種氧化還原反應確定糖化蛋白的量的方法。
背景技術：
常規地，為檢測樣品中的靶蛋白(包括肽)或者滅活影響測定的蛋白質的功能，在各種測定方法中已經應用了一種用蛋白酶降解蛋白質的方法。
例如，現在嘗試通過酶促方法測定在糖尿病等的診斷、治療中作為A重要指示劑的血細胞中的糖化蛋白，尤其是反映病人既往血糖水平的紅細胞中的糖化血紅蛋白。在這種情況下，也使用蛋白酶降解糖化蛋白的方法。在酶促方法中，使一種果糖基氨基酸氧化酶(后文稱作FAOD)作用于溶血樣品中糖化蛋白的糖化部分，由此產生過氧化氫。這種過氧化氫的量相應于糖化蛋白的量。然后，向已經用FAOD處理過的樣品中加入一種過氧化物酶(后文稱作POD)和一種通過氧化而生色的底物，以便以POD作為催化劑在過氧化氫和所述底物之間產生氧化還原反應。此時，由于底物被氧化時生色，因此可以通過產生的顏色確定過氧化氫的量。結果，可以確定樣品中糖化蛋白的量。
然而，作用于糖化部分的FAOD作用于糖化氨基酸和較短的糖化肽比作用于糖化蛋白和糖化肽更容易。因此，通過預先用蛋白酶降解糖化蛋白和糖化肽以便FAOD可更容易地作用于糖化的部分，可以改良測定的精確性。
然而，由于蛋白酶具有底物特異性并顯示出根據所處理的底物而具有不同的降解活性，因此存在這樣一個問題，即根據靶蛋白的種類，所述降解也許耗時很長而且不能迅速進行測定。另外，如在上述糖化蛋白的情況下那樣，靶蛋白被糖化時，由于其位阻等原因而有時難以降解。為此，例如當以上述方式測定所述糖化蛋白時，由于預先進行蛋白酶處理的原因導致測定方法總體上也耗時很長。因此，從在臨床試驗等領域可利用的角度出發，需要一種可以更迅速測定糖化蛋白的方法。

發明內容
因此，本發明的一個目的在于提供一種產生蛋白質降解產物的方法，通過這種方法蛋白質被迅速而有效地降解，本發明還提供了一種降解樣品中糖化蛋白及確定該糖化蛋白的量的方法。
為實現上述目的，本發明的產生蛋白質降解產物的方法包括在存在磺酸化合物的情況下用一種蛋白酶處理蛋白質。在本發明中，術語“蛋白質”也包括肽，術語“蛋白質降解產物”包括上述肽的降解產物。
以此方式在存在磺酸化合物的情況下進行蛋白酶處理使得可以迅速降解樣品中的蛋白質。
接下來，本發明的測定糖化蛋白的方法包括在存在磺酸化合物的情況下進行蛋白酶處理，其中通過用一種蛋白酶處理含有糖化蛋白的樣品以降解該糖化蛋白，使得通過降解獲得的糖化蛋白降解產物的糖化部分與FAOD彼此反應，并對這個氧化還原反應進行測定，從而確定糖化蛋白的量。附帶提及的是本發明中術語“糖化蛋白”還包括糖化的肽。
在不存在磺酸化合物的情況下進行的常規方法中，蛋白酶處理必需使用足夠的蛋白酶耗時例如大約6-40小時來降解糖化蛋白，以便使FAOD易于作用于糖化的部分。因此，上述酶促方法需要長時間才能測定糖化蛋白，因此不是非常實用。相反，根據本發明的測定方法，由于可以在短時期內降解糖化蛋白等，因此可以迅速地測定糖化蛋白等。例如，在與常規方法中除了加入磺酸化合物之外的相同條件下，本發明的測定方法可以將測定所需的時間縮短為在沒有磺酸化合物的情況下測定所需的時間的1/10至1/2000。因此，本發明的測定方法是一種更迅速及更精確的測定方法，其可用在如上述的各種臨床試驗中。
進行本發明的最佳模式在本發明的產生蛋白質降解產物的方法及測定糖化蛋白的方法中，所述磺酸化合物可以是例如由通式R-SO3X表示的一種化合物。在上述通式中，X是例如Na、K、Li、H等，R優選是一個疏水性基團，例如CH3(CH2)n-、CH3(CH2)n-C6H4、C6H5-、C6H5-N＝N-C6H4-、C6H5-CH＝CH-C6H4-等。例如在所述R中，n在1-20范圍內。在上述R中，H可以由一個酰基基團、硝基基團、亞硝基基團、苯基基團、烷基基團、烷基醚基團等取代。
磺酸化合物的特殊實例包括例如十二烷基硫酸鈉(后文稱作SLS)、十二烷基苯磺酸鈉鹽(后文稱作SDBS)、十二烷基硫酸鋰(后文稱作LiLS)、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸鈉鹽(后文稱作ABSA)、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽(后文稱作ANDS)、4，4’-二疊氮茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽(后文稱作DADS)、N-環己基-2-氨基乙磺酸、N-環己基-3-氨基丙烷磺酸、N-環己基-2-羥基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)、紅菲繞啉磺酸等，所述磺酸化合物優選是SLS、SDBS、或LiLS。
由于這些磺酸化合物通常具有高度溶解性，因此即使當樣品中糖化蛋白的濃度很高時也易于處理。另外，從便宜的角度來看，所述磺酸化合物也是非常有用的。
另外，在本發明的產生方法和測定方法中，優選在存在磺酸化合物和硝基化合物這二者的情況下進行蛋白酶處理，因為這樣可以進一步促進糖化蛋白的降解。
上述硝基化合物非特殊限制性地是例如硝基苯化合物或二硝基苯化合物。這些化合物的苯環優選不僅具有硝基基團，而且還具有一個取代基如-NH2、-OH、-COOH、-SO3或-(CH2)nCH3(n＝2至9)。所述取代基也可例如是一個鹵素基團、醚基團或苯基基團。
硝基化合物的特異性實例包括例如2，4-二硝基苯酚(2，4-DNP)、2，5-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、對硝基苯酚(p-NP)、2，4-二硝基苯胺(2，4-DNA)、對硝基苯胺(p-NA)、亞硝酸鈉(NaNO2)、亞硝酸鉀(KNO2)、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽(后文稱作ANPS)、硝基苯等。當所述磺酸化合物和硝基化合物均如上述存在時，其組合沒有特別限制。
在本發明的產生方法和測定方法中，所述蛋白酶沒有特別的限制，例如可以是絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶等。更特異地，可優選使用胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草蛋白酶、彈性蛋白酶、氨基肽酶等。在被降解的糖化蛋白是糖化血紅蛋白的情況下，更優選使用選擇性降解糖化血紅蛋白的一種蛋白酶，例如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、衍生自豬胰腺的胰蛋白酶、金屬蛋白酶及衍生自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的蛋白酶。衍生自枯草芽孢桿菌的蛋白酶例如包括蛋白酶N(商品名，例如由Fluka Chemie AG生產)、蛋白酶N“AMANO”(商品名，由Amano Enzyme Inc.生產)等。金屬蛋白酶例如包括衍生自芽孢桿菌屬的金屬蛋白酶(EC 3.4.24.4)等。在這些蛋白酶之中，更優選金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，最優選金屬蛋白酶。通過使用如上述可選擇性進行降解的蛋白酶，可以選擇性制備一種特異的糖化蛋白的降解產物。
如上所述，本發明的產生蛋白質降解產物的方法，其特征在于在存在一種磺酸化合物的情況下用一種蛋白酶處理蛋白質。
加入的磺酸化合物的量沒有特別限制，但可根據例如所述蛋白酶的種類和加入量、樣品的種類、樣品中包含的蛋白質的量等而適當確定。
更特異地，就1μL的樣品而言，加入的磺酸化合物優選在0.01-1000μmol范圍，更優選在0.03-200μmol范圍，特別優選在0.05-40μmol范圍內。
在既加入磺酸化合物又加入硝基化合物的情況下，1μL的樣品中加入的磺酸化合物優選在0.005-20μmol范圍，加入的硝基化合物優選在0.005-25μmol范圍，前者更優選在0.02-4μmol范圍，后者更優選在0.01-5μmol范圍。
蛋白酶處理的條件沒有特別限制，但優選例如根據所使用的酶的最佳條件而定。當蛋白酶是金屬蛋白酶時，溫度范圍是10℃-37℃，處理時間為30秒至60分鐘。優選溫度范圍是20℃-37℃，處理時間為30秒至10分鐘，更優選溫度范圍是25℃-37℃，處理時間為30秒至5分鐘。
接下來，如上所述，本發明的測定糖化蛋白的方法包括在存在磺酸化合物的情況下進行蛋白酶處理，其中通過用一種蛋白酶處理含有糖化蛋白的樣品以降解該糖化蛋白，使通過降解獲得的糖化蛋白的降解產物與一種果糖基氨基酸氧化酶彼此相互反應，并對這個氧化還原反應加以測定，從而確定糖化蛋白的量。
在本發明的測定方法中，加入的磺酸化合物的量沒有特別限制，但可根據例如所述蛋白酶的種類和加入量、樣品的種類、樣品中包含的蛋白質的量等而適當確定。
更特異地，就1μL的樣品而言，加入的磺酸化合物優選在0.01-1000μmol范圍，更優選在0.03-200μmol范圍，特別優選在0.05-40μmol范圍內。
在既加入磺酸化合物又加入硝基化合物的情況下，就1μL的樣品而言，加入的磺酸化合物優選在0.005-20μmol范圍，加入的硝基化合物優選在0.005-25μmol范圍，前者更優選在0.02-4μmol范圍，后者更優選在0.01-5μmol范圍。
在本發明的測定方法中，對樣品沒有特別限限制。除了血液樣品如全血、血漿、血清和血細胞之外，樣品還可以是例如生物學樣品如尿液、脊髓液和唾液，飲料如果汁，或食物如醬油和Worcestershire醬油。在上述樣品中，優選血液樣品如全血和血細胞。
在本發明的分析物中，被蛋白酶降解的糖化蛋白是例如糖化血紅蛋白、糖化白蛋白等，其中優選糖化血紅蛋白。由于血液中血紅蛋白的濃度高達大約60-200g/L及因此而難以降解，因此蛋白酶處理要花費幾個小時至幾天時間。本發明的測定方法使得可以在例如20秒至2小時內進行蛋白酶處理，可以快速測定糖化血紅蛋白。
另外，在本發明的測定方法中，優選在不僅存在磺酸化合物而且還存在硝基化合物的情況下進行蛋白酶處理，因為這樣可以進一步促進糖化蛋白的降解。
在本發明的測定方法中，優選所述氧化還原反應是通過確定所述糖化蛋白的糖化部分與FAOD反應而產生的過氧化氫的量而測定的。還優選所述過氧化氫的這個量是使用氧化酶如POD來還原所產生的過氧化氫，并氧化一種通過氧化可生色的底物(后文稱作生色底物)，及測定底物生色程度而確定。
所述生色底物沒有特別限制，但可以例如是下述生色底物。這些生色底物的吸光度通常位于400nm或更長處。另一方面，上述磺酸化合物和硝基化合物通常在400nm或更長處不具有吸光度，以便即使當使用這些生色底物時也不需要擔心在測定中產生誤差。
更具體地，所述生色底物可以是例如N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽(后文稱作DA-64)、Trinder’s試劑與4-氨基安替比林的組合、N，N，N’，N’N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷六鈉鹽(后文稱作TPM-PS)、N，N，N’，N’N”，N”-六(2-羥基-3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷六鈉鹽(后文稱作TPM-OS)、10-(羧甲基氨基羰基)3，7-二(二甲基氨基)酚噻嗪鈉鹽(后文稱作DA-67)、10-(甲基氨基羰基)3，7-二(二甲基氨基)酚噻嗪(后文稱作MCDP)、10-(羧基氨基甲基-4-苯氨基羰基)3，7-二(二甲基氨基)酚噻嗪鈉鹽(后文稱作MMX)等。在上述底物中，例如優選基于三氨基三苯甲烷的生色底物。
Trinder’s試劑可例如是苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺或萘胺衍生物。與Trinder’s試劑組合的化合物可不僅是上述4-氨基安替比林，也可以例如是氨基安替比林的衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(methyl benzothiazolinone hydrazone，MBTH)、磺酸化的甲基苯并噻唑啉酮腙(sulfonated methylbenzothiazolinone hydrazone，SMBTH)等。
在本發明中，優選FAOD是催化由下式(1)所示反應的FAOD。
(1)在式(1)中，R1代表一個羥基基團或者一個在糖化之前衍生自糖的殘基(即糖殘基)。所述糖殘基(R1)當所述糖在糖化之前是醛糖時是醛糖殘基，所述糖殘基(R1)當所述糖在糖化之前是酮糖時是酮糖殘基。例如當所述糖在糖化之前是葡萄糖時，其在糖化后通過Amadori重排而具有果糖結構。在這種情況下，所述糖殘基(R1)成為一個葡萄糖殘基(一個醛糖殘基)。這個糖殘基(R1)可以例如由-[CH(OH)]n-CH2OH表示，其中n是0-6之間的一個整數。
在式(1)中，R2沒有特別限制。然而，當例如所述底物是一種糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白時，在α-氨基基團被糖化的情況與除了α-氨基基團之外的一個氨基基團被糖化的情況之間存在不同之處。
在式(1)中，當α-氨基基團被糖化時，R2是由下式(2)表示的一個氨基酸殘基或肽殘基。
-CHR3-CO-R4(2)在式(2)中，R3代表一個氨基酸側鏈基團。R4代表一個羥基基團、氨基酸殘基或肽殘基，而且可以由下式(3)表示。在式(3)中，n是0或更大的整數，R3表示如上述的氨基酸側鏈基團。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (3)
在上式(1)中，當除了α-氨基基團之外的一個氨基基團被糖化時(即一個氨基酸側鏈基團被糖化)，R2可以由下式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)在上式(4)中，R5表示氨基酸側鏈基團中除了糖化的氨基基團之外的部分。例如當所述糖化的氨基酸是賴氨酸時，R5如下所示。
-CH2-CH2-CH2-CH2-再例如，當所述糖化的氨基酸是精氨酸時，R5如下所示。
-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-在上式(4)中，R6表示氫、一個氨基酸殘基或一個肽殘基，而且可以例如由下式(5)表示。在式(5)中，n是0或更大的一個整數，R3表示如上述的一個氨基酸側鏈基團。
-(CO-CHR3-NH)n-H (5)在上式(4)中，R7表示一個羥基基團、氨基酸殘基或肽殘基，而且可以例如由下式(6)表示。在式(6)中，n是0或更大的一個整數，R3表示如上述的一個氨基酸側鏈基團。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (6)在下文中通過具體的實施例對本發明的測定糖化蛋白的方法進行描述。應注意本發明非限于以下實施方案。
(第一個實施方案)本發明的測定糖化蛋白的方法將參考實施例加以描述，所述實施例中分析物是血細胞中的一種糖化蛋白。
首先，將全血進行溶血，或者以常規的方式如離心從全血中分離血細胞級分然后溶血，以制備溶血的樣品。產生溶血的方法沒有特殊限制，可例如是使用表面活性物質的方法、使用超聲波的方法、利用不同滲透壓的方法等。在這些方法中，優選使用表面活性物質的方法。
進行溶血的表面活性物質沒有特別限制，例如包括非離子表面活性物質如聚氧乙烯-p-t-辛基苯基醚(例如Triton系列表面活性物質)、聚氧乙烯山梨聚糖烷基酯(例如Tween系列表面活性物質)、聚氧乙烯烷基酯(例如Brij系列表面活性物質)等。特別例如是商品名為Triton X-100、商品名為Tween-20、商品名為Brij35等的表面活性物質。用表面活性物質進行處理的條件通常如下當被處理的溶液中血細胞的濃度為1-10vol％時，加入表面活性物質以使得其在溶液中的濃度在0.1-1wt％范圍內，在室溫攪拌大約5秒至1分鐘。
在利用滲透壓不同的情況下，可例如通過加入體積為全血的2-100倍的純水而進行溶血。
接下來，將溶血的樣品在存在磺酸化合物的情況下用蛋白酶處理，以降解糖化蛋白，由此制備糖化蛋白降解產物。用蛋白酶處理糖化蛋白的原因如上所述。考慮到在隨后的程序中所用的FAOD如前所述不太可能作用于蛋白質和長多肽鏈，因此將這些蛋白質和長多肽鏈降解以便FAOD可更易于作用于糖化蛋白。由于如上述在存在磺酸化合物的情況下蛋白酶處理可在短時間內降解糖化蛋白并具有高度降解效力，因此即使短時間的蛋白酶處理也可使得FAOD足夠地作用于糖化部分。為進一步促進降解，所述處理可以在如下文所述存在磺酸化合物和硝基化合物的情況下進行。
蛋白酶處理通常在一種緩沖液中進行。緩沖液的類型沒有特別限制，可例如是tris鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液、磷酸鹽緩沖液、ADA緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、甘氨酰胺緩沖液、CHES緩沖液等。其pH范圍優選為5-12，更優選為6-10，特別優選為7-9。
作為蛋白酶，例如蛋白酶K、枯草蛋白酶、胰蛋白酶、氨肽酶等可如上述使用。加入的蛋白酶的比率如下例如當被處理的溶液中血細胞濃度為0.1-10vol％時，加入蛋白酶以便其在溶液中的比率優選在0.1-100g/L范圍內，更優選在0.3-50g/L范圍內，特別優選在0.5-20g/L范圍內。
在被降解的糖化蛋白是糖化血紅蛋白的情況下，優選使用選擇性降解糖化血紅蛋白的蛋白酶，例如上述菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、衍生自豬胰腺的胰蛋白酶、金屬蛋白酶及衍生自枯草芽孢桿菌的蛋白酶。加入的蛋白酶比率如下例如當被處理的溶液中血細胞濃度為0.1-10vol％時，加入蛋白酶以便其在溶液中的比率優選在0.1-50g/L范圍內，更優選在0.3-30g/L范圍內，特別優選在1-20g/L范圍內。更具體地，當所述蛋白酶是金屬蛋白酶時，優選將其加入血細胞濃度為0.3-5vol％的溶液中，以便其在該溶液中的比率在0.1-30g/L范圍內，更優選在0.3-20g/L范圍，特別優選在1-10g/L范圍內。
加入的磺酸化合物的比率如下例如當用蛋白酶處理的溶液中血細胞濃度為1vol％時，加入所述磺酸化合物以便其在該溶液中的濃度優選在0.0001-100mmol/L范圍，更優選在0.0003-60mmol/L范圍，特別優選在0.001-30mmol/L范圍內。更具體地，當所述磺酸化合物是SLS及在用蛋白酶處理的溶液中血細胞濃度為1vol％時，優選加入所述磺酸化合物，以便其在該溶液中的濃度在0.1-100mmol/L范圍，更優選在0.2-60mmol/L范圍，特別優選在0.5-30mmol/L范圍。
盡管可以其本身的形式使用磺酸化合物，但為了操作的簡便性及處理效力，優選使用溶解于一種溶劑中的磺酸化合物溶液。這個溶液的濃度可以適當地依賴于所述磺酸化合物的種類等加以確定，例如在1-1000mmol/L范圍。作為溶劑，可以使用蒸餾水、生理鹽水、緩沖液等，所述緩沖液可以是例如上述列出的任何緩沖液。附帶提及的是上述磺酸化合物可以是一種化合物或者兩或多種化合物的組合。
在存在磺酸化合物的情況下進行蛋白酶處理的條件沒有特別限制，可例如下所示溫度范圍是10℃-37℃，處理時間為30秒至60分鐘。溫度優選在20℃-37℃，處理時間優選在30秒-10分鐘，更優選溫度在25℃-37℃，處理時間在30秒-5分鐘。
以這種方式在存在磺酸化合物的情況下對樣品進行蛋白酶處理可進一步促進樣品中糖化蛋白的降解，以便可以在短時間內及高降解效力地獲得糖化蛋白的降解產物。
另外，通過在不僅存在磺酸化合物而且還存在硝基化合物的情況下進行這種蛋白酶處理，可進一步促進蛋白酶的降解作用。
加入的硝基化合物的比率沒有特別限制，可以根據例如加入的磺酸化合物的量、蛋白酶的量而適當確定。當用蛋白酶處理的溶液中血細胞濃度為1vol％時，加入硝基化合物以便例如其在該溶液中的濃度優選在0.01-25mmol/L范圍，更優選在0.05-10mmol/L范圍。
接下來，用FAOD處理通過蛋白酶處理獲得的降解產物。這種FAOD處理催化上式(1)所示反應。
優選FAOD處理在與上述蛋白酶處理中相同的緩沖液中進行。FAOD處理的條件根據所用的FAOD的種類、作為分析物的糖化蛋白的種類和濃度等而適當確定。
更具體地，所述條件如下反應溶液中FAOD的濃度為50-50000U/L，反應溶液中血細胞的濃度為0.01-1vol％，反應溫度為15℃-37℃，反應時間為1-60分鐘，pH為6-9。另外，緩沖液的種類沒有特別限制，例如可以使用與在蛋白酶處理中相似的緩沖液。
隨后，將POD和生色底物加入在上述FAOD處理中產生的過氧化氫中，以使得底物生色，并測定生色程度。當POD作用于過氧化氫時，過氧化氫被還原及生色底物被氧化由此生色。由于底物通過氧化而生色程度與產生的過氧化氫的量相關，因此過氧化氫的量可以通過測定生色程度而確定。
所述生色底物可以是如上述那些底物，特別優選是N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-二(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽。
生色反應通常在緩沖液中進行。反應條件根據產生的過氧化氫的濃度等適當確定。所述條件通常如下反應溶液中POD的濃度為10-20000IU/L，生色底物濃度為0.001-1mmol/L，反應溫度為20℃-37℃，反應時間為1-5分鐘，pH為6-9。另外，所述緩沖液的種類沒有特別限制，例如可以使用與蛋白酶處理及FAOD處理中相同的緩沖液。
在生色反應中，例如當使用生色底物時，過氧化氫的量可以通過用分光光度計測定反應溶液中生色程度而確定。然后，使用過氧化氫的這個濃度和校準曲線等，可以確定樣品中糖化蛋白的量。
過氧化氫的量不僅可以通過上述使用POD等的酶促方法確定，也可以通過例如電方法確定。
通過采用本發明的這種測定方法，可以如上述快速進行測定。另外，當縮短蛋白酶處理時，常規的方法的測定精確性降低，而本發明的測定方法可以實現甚至在短時間內非常精確地進行測定。
實施例以下將描述一些實施例及比較例。
實施例1和比較例1在實施例1中，將糖化蛋白在存在一種磺酸化合物的情況下用蛋白酶處理，由此使用生色底物TPM-PS測定其降解產物的糖化程度。在此使用的樣品和試劑及方法如下所述。在下述第一種試劑中所述磺酸化合物是SLS(由Nacalai Tesque公司生產)。
(進行測定的樣品的制備)將凍干的血紅蛋白溶解于純水中，由此制備血紅蛋白濃度為50g/L及HbA1c濃度為6.5％的一種血紅蛋白溶液(HbA1c低)及血紅蛋白濃度為50g/L及HbA1c濃度為11.5％的一種血紅蛋白溶液(HbA1c高)。然后，將60μL每種血紅蛋白溶液與240μL純水混合以制備HbA1c濃度為6.5％的一種樣品(后文稱為“低樣品”)及HbA1c濃度為11.5％的一種樣品(后文稱為“高樣品”)。
(第一種試劑)磺酸化合物 6.4mM表面活性物質(聚氧乙烯(9)十二烷基醚)1.85g/LCHES-CHES·Na緩沖液(pH9.4) 40mMMOPS-MOPS·Na緩沖液(pH9.4) 15mM(第二種試劑)金屬蛋白酶(由ARKRAY公司生產) 2.0MU/LCaCl22.5mMNaCl 50mMMOPS-MOPS·Na緩沖液(pH6.5) 1.0mM(第三種試劑)FAOD(由ARKRAY公司生產) 18KU/LPOD(由Kikkomaan公司生產) 67KU/LTPM-PS(由DOJINDO LABORATORIES生產) 0.25mMTris-HCl緩沖液(pH7.0) 300mM(方法)針對低樣品和高樣品進行測定。首先，在向0.14μL進行測定的樣品中加入8.26μL第一種試劑之后，進一步混合入75.6μL第二種試劑并在37℃保持5分鐘。然后，將18.9μL第三種試劑混合入該混合物中，在37℃溫育以開始生色反應。用商品名為JCA-BM8(由JEOL公司生產)的儀器測定在加入第三種試劑后2.5分鐘反應溶液的吸光度。測定波長設定為571nm作為主波長，805nm為次波長。另一方面，在比較例中，與上述實施例1相似地測定吸光度，只是不加入第一種試劑中的磺酸化合物。當第一種試劑與第二種試劑混合進樣品中時，在1μL樣品中加入的磺酸化合物的量為0.378μmol。
表1

如表1所示，在實施例1中，高樣品的吸光度和低樣品的吸光度分別高于比較例的吸光度。這是由于在存在磺酸化合物的情況下通過蛋白酶處理，促進糖化血紅蛋白的降解，以便FAOD可更易于作用于糖化部分。換而言之，根據實施例1，加速降解使得與比較例相比FAOD更易于作用于糖化部分，由此改良了測定的精確性。
另外，在實施例1中，高樣品與低樣品的吸光度之間的差異高于比較例中的這種差異。高樣品與低樣品的血紅蛋白濃度相同，但高樣品中HbA1c濃度高于低樣品中HbA1c濃度。換而言之，由于血紅蛋白的較高的糖化量，因此與HbA1c成比例，高樣品理論上吸光度高于低樣品吸光度。然而，在比較例中，由于蛋白酶處理是在沒有磺酸化合物的情況下進行的，因此糖化血紅蛋白難以降解。因此，盡管高樣品和低樣品具有不同的HbA1c濃度，但其吸光度的差異只有7.1mAbs。另一方面，在蛋白酶處理是在存在磺酸化合物的情況下進行的實施例中，高樣品和低樣品之間的吸光度的差異比比較例中的這種差異要高出2-3倍。就上述同樣原因而言，還顯示出實施例1的方法改良了測定的敏感性和精確性。
實施例2在實施例2中，糖化血紅蛋白在存在磺酸化合物的情況下用蛋白酶處理，由此使用生色底物DA-64測定其降解產物的糖化程度。在此所用的樣品和試劑及方法如下所述。
(第一種試劑)磺酸化合物(SLS由Nacalai Tesque公司生產)6.4mM表面活性物質(聚氧乙烯(9)十二烷基醚) 1.85g/LCHES-CHES·Na緩沖液(pH9.4) 40mMMOPS-MOPS·Na緩沖液(pH9.4) 15mM(第二種試劑)硝基化合物0.9mM或1.8mM金屬蛋白酶(由ARKRAY公司生產) 2.0MU/LCaCl22.5MmNaCl 50mMMOPS-MOPS·Na緩沖液(pH6.5) 1.0mM作為硝基化合物，單獨地使用2，4-DNA(由Wako Pure ChemicalIndustries Ltd.生產)，p-NA(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生產)，p-NP(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生產)，NaNO2(由NacalaiTesque公司生產)和2，4-DNH(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生產)。在加入兩種硝基化合物的情況下，總濃度為1.8mM(每種化合物濃度為0.9mM)。
(第三種試劑)FAOD(由ARKRAY公司生產) 18KU/LPOD(由Kikkoman公司生產) 67KU/LDA-64(由Wako Pure Chemical Industries Ltd.生產) 70μMTris-HCl緩沖液(pH7.0)300mM
(方法)對在上述實施例1中制備的低樣品和高樣品進行測定。在將8.26μL第一種試劑加入0.14μL測定樣品中之后，將75.6μL第二種試劑進一步混合入其中，在37℃保持5分鐘。然后，將18.9μL第三種試劑混合入該混合物中，在37℃溫育以進行生色反應。在5分鐘之后用商品名為JCA-BM8(由JEOL.Ltd.生產)的儀器測定吸光度。測定波長設定為751nm作為主波長，805nm作為次波長。另一方面，在比較例2中，與上述實施例相似地測定吸光度，不同之處為不加入第一種試劑中的磺酸化合物和第二種試劑中的硝基化合物。結果示于下表2。在表2中，“高-低(mAbs)”是通過從高樣品中減去低樣品中的吸光度而獲得的數值。
表2

如表2所示，與實施例相似，在實施例2中高樣品的吸光度和低樣品的吸光度分別高于比較例中吸光度。另外，高樣品中吸光度和低樣品中吸光度的差異高于比較例2中這種差異。這些結果示出，與實施例1相似，在存在磺酸化合物和硝基化合物的情況下，促進了糖化血紅蛋白的降解，由此改良了測定的敏感性和精確度。
工業實用性如上所述，根據本發明的測定方法，通過在存在磺酸化合物的情況下進行蛋白酶處理，可以在短時間內降解蛋白質等，由此可以快速測定糖化蛋白等。這使得可以實現仍舊具有較高精確性的測定，并由此本發明的測定方法可用于如上述各種臨床醫學測試中。
權利要求
1.一種產生蛋白質降解產物的方法，包括在存在磺酸化合物的情況下用蛋白酶處理蛋白質。
2.權利要求1的方法，其中將所述蛋白質在存在所述磺酸化合物并存在硝基化合物的情況下用所述蛋白酶進行處理。
3.權利要求1的方法，其中所述磺酸化合物是選自如下一組的至少一種化合物十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉鹽、十二烷基硫酸鋰、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸鈉鹽、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽、4，4’-二疊氮茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽、N-環己基-2-氨基乙磺酸、N-環己基-3-氨基丙烷磺酸、N-環己基-2-羥基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)和紅菲繞啉磺酸。
4.權利要求2的方法，其中硝基化合物是選自如下一組的至少一種化合物2，4-二硝基苯酚、2，5-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、對硝基苯酚、2，4-二硝基苯胺、對硝基苯胺、亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽和硝基苯。
5.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶是金屬蛋白酶。
6.權利要求1的方法，其中所述蛋白質是糖化蛋白。
7.一種測定糖化蛋白的方法，其中通過用蛋白酶處理含有糖化蛋白的樣品以降解所述糖化蛋白，使通過降解獲得的糖化蛋白降解產物的糖化部分與一種果糖基氨基酸氧化酶彼此反應，并對該氧化還原反應進行測定，從而確定所述糖化蛋白的量，所述方法包括在存在磺酸化合物的情況下進行所述蛋白酶處理。
8.權利要求7的方法，其中所述蛋白酶處理是在存在所述磺酸化合物并存在硝基化合物的情況下進行。
9.權利要求7的方法，其中所述磺酸化合物是選自如下一組的至少一種化合物十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉鹽、十二烷基硫酸鋰、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸鈉鹽、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽、4，4’-二疊氮茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽、N-環己基-2-氨基乙磺酸、N-環己基-3-氨基丙烷磺酸、N-環己基-2-羥基-3-氨基丙烷磺酸、哌嗪-1，4-二(2-乙磺酸)和紅菲繞啉磺酸。
10.權利要求7的方法，其中所述硝基化合物是選自如下一組的至少一種化合物2，4-二硝基苯酚、2，5-二硝基苯酚、2，6-二硝基苯酚、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、對硝基苯酚、2，4-二硝基苯胺、對硝基苯胺、亞硝酸鈉、亞硝酸鉀、4-氨基-4’-硝基茋-2，2’-二磺酸二鈉鹽和硝基苯。
11.權利要求7的方法，其中所述蛋白酶是金屬蛋白酶。
12.權利要求7的方法，其中所述氧化還原反應是通過確定由糖化蛋白降解產物的糖化部分與果糖基氨基酸氧化酶反應產生的過氧化氫的量而測定的。
13.權利要求12的方法，其中過氧化氫的量是通過使用一種氧化酶還原所產生的過氧化氫并氧化通過氧化而生色的底物，及測定底物生色程度而確定的。
14.權利要求13的方法，其中所述生色程度是通過測定在用于檢測該底物的波長處的吸光度而測定的。
全文摘要
本發明涉及一種使用氧化還原反應分析樣品中糖化蛋白的方法，其中可以獲得高度可靠的測定值。將一種含有糖化蛋白的樣品在存在磺酸化合物的情況下用蛋白酶進行處理，由此降解糖化蛋白。將所得的糖化蛋白降解產物的糖化部分與果糖基氨基酸氧化酶反應，測定這個氧化還原反應，從而確定糖化蛋白的量。可以使用十二烷基硫酸鈉作為該磺酸化合物。
文檔編號C12Q1/37GK1668760SQ0381702
公開日2005年9月14日 申請日期2003年4月28日 優先權日2002年7月17日
發明者米原聰, 石丸香, 平井香 申請人:愛科來株式會社