專利名稱：突變的蛋白質及其在制造藥物和治療患構象病的人或動物中的應用的制作方法
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背景技術：
雖然蛋白質折疊的中心范例(Anfinsen，C.B.(1973)Principles That GovernFolding of Protein Chains.Science，181，223-230)，蛋白質的氨基酸序列編碼其獨特的三維結構得到了充分證實，但由于最近發展的“朊病毒”的概念使其共性受到了質疑。如首先由Griffith(Griffith，J.S.(1967)Self-replication and scrapie.Nature，215，1043-1044)以通用術語所提出的，引發中樞神經系統退化的傳染性羊瘙癢病物質的生化特性顯示了疾病傳播所必需的成分是蛋白質(Prusiner，S.B.(1982)Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.Science，216，136-144)。朊病毒增殖進一步包括由稱為PrPC的細胞型朊病毒蛋白向有毒性的羊瘙癢病形式PrPSc的轉變，通過PrPSc作為模板用于PrPC形成新的PrPSc分子推動了這一轉變(Prusiner，S.B.(1987)Prions and neurodegenerative diseases.N Engl JMed，317，1571-1581)。這種“唯蛋白質”假說暗示同樣的多肽序列，在不存在任何翻譯后修飾的情況下，能夠采用兩種明顯不同的穩定的蛋白質構象。因而，對于朊病毒來說有可能，盡管沒有證實，它們違背了蛋白折疊的中心范例。有一些間接的證據即其它因子可能涉及構象轉變過程(Prusiner，S.B.(1998)Prions.Proc Natl Acad Sci U S A，95，13363-13383)，該過程包括一種由α螺旋變為β折疊二級結構的顯著改變。盡管有人提出一種假定的“因子X”可能作為一種分子伴侶而起作用，但其化學特性卻一直未得到鑒定(Zahn，R.(1999)Prionpropagation and molecular chaperones.Q Rev Biophys，32，309-370)。
對于PrPSc促進細胞同工型的轉變的分子機制已提出兩種通用的模型(見
圖1)。關于PrPSc形成的“晶核形成”或“結籽”模型(Jarrett，J.T.和Lans-bury，P.T.，Jr.(1993)Seeding″one-dimensional crystallization″of amyloida pathogenicmechanism in Alzheimer′s disease and scrapie？Cell，73，1055-1058)提出PrPC和PrPSc處于快速建立的平衡態中，并且PrPSc的構象只有在陷入于晶體樣的晶種內時才是熱動力學穩定的(見圖1A)。該建議的過程類似于充分描述了特性的成核依賴的蛋白質聚合作用的其它過程，包括微管裝配、鞭毛裝配以及鐮狀紅細胞血紅蛋白原纖維的形成，其中動力學勢壘是由單分子周圍成核所致。為闡明指數式轉變速率，必須假定聚集物不斷地分裂以產生增加的堆積表面，盡管分裂的機制還有待于解釋。PrPSc形成的“模板輔助”或“異二聚體”的模型(Prusiner，S.B.，Scott，M.，Foster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等(1990)Transgenetic studiesimplicate inter-actions between homologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)提出PrPC在一定程度上是未折疊的并在作為模板起作用的PrPSc分子的作用下重折疊(見圖1B)。在沒有通過預先存在的PrPSc催化的情況下，高的能量勢壘被假定使得這種轉變不可能發生。構象變化被認為是通過PrPC-PrPSc異二聚體分解為兩個PrPSc分子進行動力學控制的，且能被視為是一種繼Michaelis-Menten動力學自動催化之后的一種誘導裝配的酶反應。一旦轉變開始啟動其就引起一種指數式的轉變級聯，與此同時PrPSc二聚體快速地解聚為單體。模板輔助模型的一個缺點是它沒有解釋為什么在增殖后PrPSc會聚集為蛋白質原纖維。Manfred Eigen曾進行過朊病毒的兩種建議的疾病機制的比較動力學分析(Eigen，M.(1996)Prionics or the kinetic basis of prion diseases.Biophysical Chemistry，63，A1-A18)。他發現大體而言兩種模型在邏輯上都是可行的，但是它們作用過程中的條件似乎是過于狹窄且不切實際。自動催化的模板輔助模型需要協同效應以啟動，但接著其在現象上變得與成核模型無法區分，該成核模型也是一種(被動的)自動催化的形式。盡管這兩種機制依然可能在兩種單體蛋白質構象的哪一種是有利的平衡態的問題上產生不一致，但它們二者都需要一種聚集態作為最終在平衡上有利的形式以及假定類似朊病毒蛋白質的病理形式。Eigen推斷需要更多的實驗證據來判斷兩種模型的哪一種是正確的。原則上，對于朊病毒增殖的兩種模型都沒有排除可能的通過“因子X”的協同作用。
對一種朊病毒疾病的機理的理解需要細胞型和病理型朊病毒蛋白的三維結構的詳細知識。只有兩種蛋白的結構都得到了解釋，那么才能夠理解轉變是如何發生的。在體內，“健康的”朊病毒蛋白通過一種糖基化肌醇磷酯錨和稱為脂質筏的膜結構域部分而附于細胞表面(Vey，M.，Pilkuhn，S.，Wille，H.，Nixon，R.，DeArmond，S.J.，Smart，E.J.，Anderson，R.G.，Taraboulos，A.和Prusiner，S.B.(1996)Subcellular colocalization of the cellular and scrapie prion proteins in caveolae-like membranous domains.Proc Natl Acad Sci USA，93，14945-14949)。近來的結構研究集中在使用核磁共振(NMR)波譜法研究來自不同物種的可溶性重組朊病毒蛋白。這些研究顯示了哺乳動物PrPC由兩個不同的結構域組成一個柔性無序的N端尾部，它包含殘基23-120，以及殘基121-230的一個井狀結構的C末端球狀結構域，它富含α螺旋二級結構及包含一種少量反平行的β折疊(Lopez Garcia，F.，Zahn，R.，Riek，R.和Wüthrich，K.(2000)NMR structure of thebovine prion protein.Proc Natl Acad Sci USA，97，8334-8339)。當PrPC轉變成PrPSc后，代表在哺乳動物和非哺乳動物朊病毒蛋白中最保守序列的殘基90-120(Wopfner，F.，Weidenhofer，G.，Schneider，R.，von Brunn，A.，Gilch，S.，Schwarz，T.F.，Werner，T.和Schatzl，H.M.(1999)Analysis of 27 mammalian and 9 avian prionproteins reveals high conservation of flexible regions of the prion protein.J Mol Biol，289，1163-1178)，變得抗蛋白酶K的處理(Prusiner，S.B.，Groth，D.F.，Bolton，D.C.，Kent，S.B.和Hood，L.E.(1984)Purification and structural studies of a majorscrapie prion protein.Cell，38，127-134)，暗示該多肽片段結構變化了。有進一步的證據即PrPC的構象轉變伴隨著β折疊二級結構的大量的增加(Pan，K.M.，Baldwin，M.，Nguyen，J.，Gasset，M.，Serban，A，Groth，D.，Mehlhorn，I.，Huang，Z.，Fletterick，R.J.，Cohen，F.E.等.(1993)Conversion of alpha-helices into beta-sheetsfeatures in the formation of the scrapie prion proteins.Proc Natl Acad Sci USA，90，10962-10966)。
在朊病毒領域中觀察到的問題自從mPrP(121-231)的結構測定以來已經知道潛在蛋白質X抗原表位的分子表面由兩個在不同物種間具有低同源性的多肽片段構成，它們具有相似的三維結構(Billeter，M.，Riek，R.，Wider，G.，Homemann，S.，Glockshuber，R.和Wüthrich，K.(1997)Prion protein MR structure and species barrier for prion diseases.Proc.Natl.Acad.Sci USA 94，7281-7285)。根據在不同哺乳動物物種間靜電表面電位的明顯改變鑒定了螺旋3和環165-172這兩個節段(見圖2)人PrP因谷氨酰胺殘基168和219為谷氨酸所取代，以及在166、215和220位的保守性取代而區別于牛和小鼠的PrP。以轉染了嵌合的人/小鼠Prnp的感染羊瘙癢病的成神經細胞瘤細胞所作的研究證實了在蛋白質X抗原表位區的單個氨基酸取代影響重組PrP轉變成PrPSc的效率(Kaneko，K.，Zulianello，L.，Scott，M.，Cooper，C.M.，Wallace，A.C.，James，T.L.，Cohen，F.E.和Prusiner，S.B.(1997).Evidence for protein X binding to a discontinuous epitope on the cellular prion proteinduring scrapie prion propagation.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，10069-10074)。在人PrP中相應的殘基取代殘基168、215或219，但在220位不取代，減少或阻止了在重組構建體中向PrPSc的轉變。通過突變的和野生型PrP的共轉染研究測定突變的和野生型的蛋白質對于蛋白質X的相對親和性，顯示發生168、172或219位的堿性殘基對谷氨酰胺的取代抑制了突變的和野生型PrP二者的轉變，這是由于突變的PrPC無法釋放蛋白質X。相反，以谷氨酸取代168或219谷氨酰胺阻止了突變的PrP的轉變，但允許野生型PrP的轉變，可能是通過弱化突變的PrPC-蛋白質X的結合。
這些研究顯示在細胞培養中在假定的突變朊病毒蛋白質的因子X抗原表位內的單氨基酸取代能夠抑制野生型PrP向PrPSc的轉變。因而在人和動物中的傳播性海綿狀腦病(TSE)的治療中，體細胞基因治療看來是一種有前景的方法。但是，這種取代是否在足夠長的時間內也具有抑制朊病毒在人和動物中的增殖的能力，而不影響野生型PrPC的生理功能還有待證實，事實上，野生型PrPC的生理功能可能依賴于與蛋白質X的功能性相互作用。
發明目的和概述本發明的一個目的是提供在足夠長的時間內抑制朊病毒在人和動物中增殖的PrP蛋白質。這個目的通過權利要求1的特征得以實現。
本發明的另一個目的是提供該PrP蛋白質或其片段的治療用途，以及在制備治療性處理蛋白構象轉變后引發的疾病的藥物中的用途，以及一種對在構象轉變后引發疾病的蛋白質的治療性處理的藥物。
根據本發明的優選實施方案和附加特征體現在從屬權利要求中。
本發明描述了具有兩個二硫鍵的突變的人朊病毒蛋白，hPrP(M166C/E221C)的121-230位殘基的球狀結構域的核磁共振(NMR)結構，hPrP(M166C/E221C)在與人doppel蛋白(hDpl)相似的位置含有另一個二硫鍵。另一個突變體，hPrP(M166C/Y225C)被表達并顯示折疊成球狀結構，但是它的聚合趨向使得無法進行詳細的結構分析。hPrP(M166C/E221C)核磁共振結構顯示其具有與野生型hPrP(121-230)相同的球狀折疊。它包含殘基144-154、173-194和200-228的三個α螺旋、殘基128-131和161-164的一個反平行β折疊，以及Cys166-Cys221和Cys179-Cys214二硫鍵。在假定的“因子X”結合位點上改造的額外的二硫鍵適應于輕微的、嚴格局限的構象變化。通過使用其它變異結構的模型計算進一步證實了hPrP與在因子X抗原表位中插入的另外的二硫鍵的高度相容性。hPrP結構能夠輕易容納在假定的因子X結合抗原表位內不同位置的另外的二硫鍵，強烈地暗示了天然的另外二硫鍵對觀察到的hDpl中相應區域中的廣延微擾(extensive perturbation)的功能性作用。在Dpl中和也可能在突變的朊病毒蛋白質中另外的二硫鍵的功能性作用，也許包括耐抗構象轉變成病理性同功型的傾向，所述病理性同功型引發傳播性海綿狀腦病(TSE)如在人類中的克-雅病(CJD)。
附圖簡述下面的附圖用來引證先前的技術以及本發明。根據本發明的方法的優選的實施方案將也將通過附圖來解釋，而這不應限制本發明的范圍。
圖1.PrPSc促進細胞同功型轉變的分子機制提出的兩種通用模型(Zahn，R.(1999))圖1A“晶核形成”或“結籽”模型；圖1B“模板輔助”或“異二聚體”模型；圖2.人朊病毒蛋白質節段165-230的氨基酸序列和人doppel蛋白質節段93-153的氨基酸序列比對；圖3.(A)hPrP(M166C/E221C)和(B)hPrP(M166C/Y225C)的二維[15N，1H]-關聯能譜(COSY)波譜；圖4.hPrP(M166C/E221C)的NMR結構的立體視圖圖4A 20種能量優化的DYANA構象異構體的主鏈疊加用于殘基125-228的N、Cα和C’原子的最佳擬合；
圖4B顯示了來自(A)的構象異構體的所有重原子；圖4C來自(B)的構象異構體的飄帶圖；圖5.hPrP(121-230)氨基酸序列對13Cα化學位移差異Δδ(13Cα)作的圖圖5A hPrP(M166C/E221C)對無規卷曲位移；圖5B hPrP(M166C/Y225C)對無規卷曲位移；圖5C hPrP(M166C/E221C)對野生型hPrP(121-230)；圖5D hPrP(M166C/Y225C)對野生型hPrP(121-230)；圖6.hPrP(M166C/E221C)和hPrP(121-230)的穩態15N{1H}-NOEs；圖7.人朊病毒蛋白質的GdmCl依賴的平均殘基摩爾橢圓率圖7A在含有20mM磷酸鈉pH7.0的緩沖液中；圖7B在含有20mM醋酸鈉pH5.0的緩沖液中；圖8人朊病毒的圓二色譜圖8A hPrP(121-230)；圖8B hPrP(M166C/E221C)；圖8C hPrP(M166C/Y225C)；圖9.人朊病毒蛋白質的溫度依賴的平均殘基摩爾橢圓率圖9A hPrP(121-230)；圖9B hPrP(M166C/Y225C)；圖9C hPrP(M166C/E221C)。
發明詳述人朊病毒蛋白質和人doppel蛋白質的三維結構顯示了相似的折疊拓撲學(Thorsten 1ührs，Roland Riek，Peter Güntert und Kurt Wüthrich，已投稿；Zahn等，2000)，帶有一個附于100個殘基的球狀C端結構域上的柔性無序的N端“尾部”，所述C端結構域含有三個α螺旋和一個小的反平行β折疊。這兩種蛋白質之間的顯著差異與二硫鍵的數目有關。在hPrP和hDpl二者中，一個連接螺旋α2和α3的二硫鍵埋在疏水核中，并對球狀蛋白質結構的整體穩定性起著明顯的作用。已知殘基179和214的Cys的還原產生二硫蘇糖醇并導致體外PrP的解折疊和聚合(Mehlhorn，I.，Groth，D.，Stckel，].，Moffat，B.，Reilly，D.，Yansura，D.，Willett，W.S.，Baldwin，M.，Fletterick，R.，Cohen，F.E.，Vandlen，R.，Henner，D.和Prusiner，S.B.(1996)High-level expression and characterization of a purified 142-residue polypeptide of the prion protein.Biochemistry 35，5528-5537)，暗示到目前為止尚不知道PrP的生理功能，并且可能Dpl也依賴于這個完整的二硫鍵。
在Dpl中，在α鏈2和螺旋α2之間的環通過一個額外的二硫鍵連接到序列接近C端的位置，而在野生型PrP中沒有與之相應部分(圖2)。
圖2顯示在考慮了兩種蛋白質的序列以及三維結構的基礎上，人朊病毒片段165-230的氨基酸和人doppel蛋白質節段93-153的氨基酸序列比對(T.Lührs，R.Riek，P.Güntert和K.Wuthrich，已投稿；Zahn，R.，Liu，A，Lührs，T.，Riek，R.，vonSchroetter，C.，López García，F.，Billeter，M.，Calzo-lai，L.，Wider，G.和Wüthrich，K.(2000) NMR solution structure of the human prion protein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，145-150)。在這篇論文中在hPrP中被Cys替換的殘基位置為斜體。實體黑線表示天然的二硫鍵，而在野生型蛋白質中通過黑框表示常規α螺旋二級結構的位置。斷線和點狀線分別表示在獲得的完整結構的hPrP(M166C/E221C)以及經表達并表征的hPrP(M166C/Y225C)中額外的二硫鍵。
PrP的相應區域缺乏半胱氨酰殘基，且在以表達各種PrP構建體的轉基因小鼠進行的接種研究的基礎上(Telling，G.C.，Scott，M.，Mastrianni，].，Gabizon，R.，Torchia，M.，CohenF.E.，DeArmond，S.J.和Prusiner，S.B.(1995)Prion propagationin mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction ofcellular PrP with another protein.Cell 83，79-90)，已暗示其代表尚沒有進一步鑒定的“因子X”的結合抗原表位，所述“因子X”據推測參與疾病相關的PrP的體內構象轉變(Prusiner，1998)。
人和鼠Dpl蛋白質的NMR結構顯示在相應于PrP中假定的“因子X”結合抗原表位的區域引入另外的二硫鍵導致三維結構的大的改變。為研究這個區域中一個人工額外的二硫鍵對朊病毒蛋白質三維結構的影響，我們制備了人朊病毒蛋白質hPrP(121-230)球狀結構域的兩種突變體。設計了hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)從而同時在hDpl(圖2)中模擬另外的二硫鍵的位置并與野生型人PrP的三維結構相容(Zahn等，2000)。因而在hPrP中在被選擇進行氨基酸取代的位點中，Glu221在27種哺乳類和9種鳥類的蛋白質中是完全保守的(Wopfner等，1999)，在一些物種中Tyr225被Ser、Phe或Ala取代，而Vall66只在人、黑猩猩和有袋類的PrP中被Met或Ile取代(Moore，R.C.，Lee，I.Y.，Silverman，G.L.，Harrison，P.M.，Strome，R.，Heinrich，C.，Karunaratne，A.，Pasternak，S.H.，Chishti，M.A.，Liang，Y.，Mastrangelo，P.，Wang，K.，Smit，A.F.A.，Katamine，S.，Carlson，G.A，Cohen，F.E.，Prusiner，S.B.，Melton，D.W.，Trembla，P.，Hood，L.E.和Westaway，D.(1999)Ataxia in prion protein(PrP)-deficient mice isassociated with upregulation of the novel PrP-like proteindoppel.1.Mol.Biol.292，797-817)，在額外的二硫鍵中殘基Cys94和Cys145是完全保守的。
本發明描述了hPrP(M166C/E221C)的高質量NMR結構、hPrP(M166C/Y225C)定性的光譜特征，以及hPrP(121-230)額外的雙二硫鍵突變體的模型計算。對在PrP中的因子X結合抗原表位以及在Dpl中的相應分子區域可能的功能性作用的結果進行了評估。
另外，本發明包括下列應用1)生產用于傳播性海綿狀腦病(TSE)治療性處理的朊病毒蛋白質或其片段的“二硫突變體”，特別是在節段165-175和C端殘基215-230之間導入額外的二硫鍵的突變的蛋白質。額外的二硫鍵可能會阻止突變的PrPC向PrPSc的構象轉變，并且因此通過下列種類的顯性失活抑制而阻止了在共存的野生型蛋白質中PrPC向PrPSc的構象轉變a)突變的PrPC結合到野生型PrPC上，因而阻止了向野生型PrPSc寡聚體的構象轉變(見圖1A)。
b)突變的PrPC結合到野生型PrPSc寡聚體上，因而阻止了野生型PrPSc淀粉樣蛋白原纖維的形成(見圖1A)。
c)突變的PrPC結合到野生型PrPSc上，因而阻止了野生型PrPC/PrPSc異二聚體的形成(見圖1B)。
d)突變的PrPC結合到野生型PrPSc淀粉樣蛋白原纖維上，因而阻止了淀粉樣蛋白原纖維的延伸(見圖1A，B)或淀粉樣蛋白原纖維向PrPSc寡聚體的分解(見圖1A)。
2)在人或細胞培養物體內產生朊病毒蛋白質或其片段的二硫化突變體用于TSE的治療，例如通過使用載體如慢病毒載體、質粒或脂質體的體細胞基因治療，其中TSE包括自發性的、遺傳的、醫源性的以及不同形式的克-雅病(CJD)，致命性家族性失眠癥(FFI)和Gerstmann-Strussler-Scheinker綜合征(GSS)。
3)重組生產朊病毒蛋白質的二硫化突變體或其片段，用于人類中TSE的治療，例如通過該重組蛋白質直接應用，其中TSE包括自發性的、遺傳的、醫源性的以及變異形式的CJD、FFI和GSS。
4)在動物或細胞培養物中體內生產朊病毒蛋白質的二硫化突變體或其片段，用于TSE的治療，例如通過使用載體像慢病毒載體、質粒或脂質體的體細胞基因治療，其中TSE包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊的瘙癢病、貓海綿狀腦病(FSE)以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)。
5)重組生產朊病毒蛋白質的二硫化突變體或其片段，用于人類中TSE的治療，例如通過該重組蛋白質的直接應用，其中TSE包括BSE、羊瘙癢病、FSE以及CWD。
6)重組生產朊病毒蛋白質的二硫化突變體或其片段，以作為TSE檢測的“PrPC抗轉變標準”，其中重組的PrPC由來自病理組織或體液如血液和尿液的PrPSc而擴增。TSE檢測可以應用于人和動物如牛、貓、羊、駝鹿、鹿、豬、馬和雞。
7)體內生產朊病毒蛋白質的二硫化突變體或其片段，用于耐受TSE的動物的育種，其中動物包括牛、羊、貓、駝鹿和鹿。
8)本發明及其應用可以用于涉及神經變性疾病(例如阿爾茨海默癥、帕金森病和多發性硬化癥)的其它蛋白質或通常應用于在構象轉變以后引發疾病的蛋白質(構象病如原發性系統淀粉樣變性、II型糖尿病、動脈淀粉樣變性)。
本發明進一步包括根據1-8點的野生型蛋白質及其變體的生產和/或應用。這樣的變體包括蛋白質片段、突變蛋白質、融合蛋白質和蛋白質-配體復合物。
實驗結果1.兩種突變的朊病毒蛋白質的生產和光譜特征兩種突變的蛋白質hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)在大腸桿菌(E.coli)中表達為包含體并通過高親和柱重折疊進行純化，得到了與野生型hPrP(121-230)相似的產量(Zahn，R.，von Schroetter，C.和Wüthrich，K.(1997)Human prion proteinsexpressed in Escherichia coli and purified by high-affinity column refolding.FEBSLett.417，400-404；Zahn等，2000)。通過質譜分析確認形成了一個額外的二硫鍵，并且它導致兩種蛋白質解鏈溫度上升了大約10℃(數據未顯示)。將突變的蛋白質進行均一地13C、15N標記以進行共振歸屬和結構測定。對于NMR實驗使用20℃的含有1mM蛋白質的10mMpH4.5的醋酸鈉溶液。
兩種蛋白質的1H NMR譜顯示制品是均質的，而且對于球狀蛋白質而言，化學位移離差是典型的。通過二維的[15N，1H]-關聯能譜(COSY)波譜觀察到的化學位移，顯而易見具有相似的結構(圖3)。
圖3顯示了(A)hPrP(M166C/E221C)和(B)hPrP(M166C/Y225C)的二維的[15N，1H]-COSY波譜。以黑色字體表示選擇的交叉峰歸屬。在圖3A中，圓圈和字母顯示對于hPrP(M166C/E221C)而言，已觀察到的，但在hPrP(M166C/Y225C)或野生型hPrP(121-230)的波譜中未曾見到的交叉峰(Zahn等2000)。在圖3B中，空心圓表示由與(A)和與hPrP(121-230)的比較所預期的交叉峰的位置，矩形表示由于在三重共振波譜中喪失了連續性而不能進行歸屬的交叉峰。在兩種波譜中矩形框都包括了在Arg側鏈中HNE折疊的交叉峰。在600MHz下用含有1mM蛋白質的90％的H2O/10％D2O、10mM[d4]乙酸鈉的溶液，在pH4.5和溫度20℃下記錄波譜。
但是，盡管在hPrP(M166C/E221C)的波譜(圖3A)中觀察到所有的108個預期的主鏈酰胺共振(凝血酶剪切位點在朊病毒蛋白質序列的N端前添加了一個Gly-Ser二肽(Zahn等，1997)，從而也在[15N，1H]-COSY波譜中觀察到Serl20和Vall21的共振)，我們只能在hPrP(M166C/Y225C)中鑒定出103個主鏈酰胺共振(圖3B)。總體而言，在hPrP(M166C/Y225C)中的酰胺質子的共振線與波譜A相比大約加寬了6Hz，顯示這種突變蛋白質向寡聚體轉變的短暫聚合作用。
2.hPrP(M166C/E221C)的共振歸屬和結構測定利用標準的三重共振實驗以13C、15N標記的蛋白質獲得序列特異性的主鏈歸屬(Bax，A.和Grzesiek，S.(1993)Methodological advances in protein NMR.Acc.Chem.Res.26，131-138)，并通過連續和中度的核歐沃豪斯增強(NOE)交叉峰獨立地確證序列特異性的歸屬(Wuthrich，K.(1986)NMR of Proteins and Nucleic Acids，Wiley，New York)。將所有的多肽主鏈共振進行歸屬，包括在環165-175和Phel75的所有殘基的酰胺氮和酰胺質子(圖3A)，而在野生型蛋白質中沒有檢測到(Zahn等，2000)。對于每一對相鄰的殘基而言，至少觀察到一個異核連續標量連通性或一個連續的NOE。基于與野生型hPrP(121-230)的化學位移比較對側鏈進行歸屬(Zahn等，2000)，并利用三維的15N解析的[1H，1H]-全相關波譜學(TOCSY)波譜進行了確證(Marion，D.，Kay，L. E.，Sparks，S.E.，Torchia，D.A.和Bax，A.(1989)Three-dimensional heteronuclear NMR of15N-labelled proteins.J.Am.Chem.Soc.111，1515-1517)。無標記質子的側鏈歸屬是完全的，唯一例外的是His155和His187的εCH和Phe175和Phe198的ζCH。在標記的側鏈質子中，所有7個Asn和Gln殘基的酰胺基團和8個Arg殘基的ε-質子共振通過分子內殘基的NOEs(Wüthrich，1986)被歸屬。在Ser、Thr和Tyr的測鏈羥基質子中只有Thr183的共振能觀察到并歸屬。
利用在DYANA軟件包(Guntert，P.，Mumenthaler，C.和Wuthrich，K.(1997)Torsion an-gle dynamics for NMR structure calculation with the newprogramDYANA.J.Mol.Biol.273，283-298)中運行的FOUND程序對hPrP(M166C/E221C)中9個Val和2個Leu的甲基進行了立體特異性歸屬，并獲得2αCH2、30βCH2、17γCH2和4δCH2基團額外的立體特異性歸屬(Gun-tert，P.，Billeter，M.，Ohlenschlager，O.，Brown，L. R.和Wüthrich，K.(1998)Con-formationalanalysis of protein and nucleic acid fragments with the new grid searchalgorithmFOUND.J.Biomol.NMR 12，543-548)。四個Cys殘基的13Cα共振都在39.6pp到41.6ppm范圍內進行了強烈地低磁場位移，確證了它們都形成了二硫鍵(Wishart等，1995)。hPrP(M166C/E221C)的1H、13C和15N化學位移已存放于生物磁共振庫中，文檔號5378。
在水中以40ms的混合時間記錄的750MHz下三維聯合15N/13C解析的[1H，1H]-NOESY中，重復選取并積分了一共4477個核歐沃豪斯增強波譜(NOESY)交叉峰。利用這些峰的列表和化學位移列表輸入程序CANDID中進行自動的NOE歸屬(Herrmann，T.，Güntert，P.和Wuthrich，K.(2002)Protein NMR structuredetermination with automated NOE assignment using the new software CANDID andthe torsion angle dynamicsalgo-rithmDYANA.J.Mol.Biol.319，209-227)以及在DYANA中進行結構計算(Güntert等，1997)(詳見材料和方法)，得到1775個NOE上限距離約束。作為補充的構象約束，所有具有13Cα化學位移偏離無規卷曲值多于1.5ppm的殘基都受限于下面的二面扭角的范圍對于偏差大于1.5ppm而言，-120°＜Φ＜-20°并且-100°＜Ψ＜0°；對于偏差小于1.5ppm而言，-200°＜Φ＜-80°并且40°＜Ψ＜220°(Luginbühl，P.，Szyperski，T.和Wüthrich，K.(1995)Statistical basis for the use of13Cαchemical shift in protein structure determination.J.Magn.Reson.B 109，229-233)。來自殘基內的和連續NOEs的組合信息以及用作程序FOUND輸入值的13Cα化學位移在二面扭角Φ、Ψ、X1和X2上產生了458次約束。利用三個上限的和三個下限距離約束來分別計算兩個二硫鍵Cys166-Cys221和Cys179-Cys214(Williamson，M.P.，Havel，T.F.和Wüthrich K.(1985)Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by1Hnuclear magnetic resonance and distance geometry.J.Mol.Biol.182，295-315)。用100種隨機起始結構在CANDID標準方法(Herrmann等，2002)的第七次循環中的進行最終DYANA計算，并用程序OPALp對20種最佳DYANA構象異構體進行進一步能量優化。用得到的20種能量最小化的構象異構體的集合來代表NMR結構。表1給出了結構計算結果的概觀。
表1代表hPrP(M166C/E221C)aNMR結構的20種能量優化的DYANA構象異構體的表征
a由1775個NOE的上限距離約束、116個在Φ和Ψ上二面角約束，以及6個上限距離和6個下限距離約束的輸入以計算二硫鍵166-221和179-214。
b給出具有最低DYANA靶功能值的20個能量最小化的構象異構體的平均值±標準偏差。
c能量最小化之前。
d相對于平均坐標的RMSD值。
小的殘基約束偏差顯示結構與實驗約束相一致，而在20個構象異構體集合間的球形RMSD值代表了高質量結構的測定(圖4)。
圖4顯示hPrP(M166C/E221C)的NMR結構的立體視圖。在圖4A中，將20種能量優化的DYANA構象異構體的主鏈進行疊加用于殘基125-228的N、Cα和C’原子的最佳擬合。圖4B是顯示了來自(A)的具有與平均坐標最小偏差的構象異構體的所有重原子，其中主鏈顯示為通過Cα位置的一種鍵槽(spline)功能。圖4C是來自(B)的構象異構體的飄帶圖。在所有的圖中兩個二硫鍵用白色繪出。
20個構象異構體集合的原子坐標已保存于蛋白質數據庫中，登錄號1HOL。
3.以程序DYANA和CANDID進行野生型hPrP(121-230)NMR結構的新計算假定本項工作的主要興趣集中在突變的人朊病毒蛋白質與野生型hPrP(121-230)的比較上，我們以新的CANDID/DYANA法(Herrmann等，2002)重新評估了NOE輸入數據并重復了以往發表過的hPrP(121-230)結構(Zahn等，2000)的結構計算。這確保了在這篇論文中的結構比較不受系統差異的影響，所述系統差異可能緣于用于數據分析和突變蛋白的新結構和參考的野生型結構的計算的方法之間的一些差異。
4.額外二硫鍵對于hPrP(M166C/E221C)NMR結構中的構象平衡的影響hPrP(M166C/E221C)NMR結構具有與hPrP(M166C/E221c)相同的球狀折疊，在兩種蛋白質的平均結構(mean structures)中的殘基125-228的主鏈重原子之間具有1.08的RMSD值。常規的二級結構包括具有殘基128-131和161-164的短的雙鏈反平行的β折疊、具有殘基144-154的螺旋α1、具有殘基173-194的螺旋α2，以及具有殘基200-228的螺旋α3。
在保守的球狀結構的框架內，在突變的和野生型hPrP(121-230)中的環165-172的結構測定的精度上有所不同。在野生型蛋白質中，在環165-172中的三個氨基酸的主鏈酰胺共振是觀察不到的，可能是由于線性加寬減慢了NMR化學位移時間尺度上的構象變換(Zahn等，2000)。由于NOE上限距離約束的不足，這導致了片段165-172結構測定的減弱的精度。相反，對于hPrP(M166C/E221C)獲得了主鏈歸屬的完整多肽，它使得在環165-172中能夠進行額外的中度NOEs的鑒定，因而與野生型蛋白質相比其得到了明顯更好地限定(圖4A)。因此在Cys166和Cys221之間的二硫鍵似乎減少了可進入環165-172的構象空間并因此大大阻止了以前觀察到在這一多肽片段中主鏈酰胺共振的交換加寬。(Zahn等，2000)。
在hPrP(M166C/E221C)和hPrP(121-230)中的螺旋α3同樣得到了充分說明，并且兩種結構間的差異在20種構象異構體的集合所包含的構象空間之內。在結構計算中這些觀察與NOE距離約束的近似密度相關聯，特別是中度約束dαN(i，i+3)、dαN(i，i+4)和dαβ(i，i+3)，它們對于常規的α螺旋折疊具有主要的影響(Wüthrich，1986)。由于NOE強度對距離d的六次冪反比的相關性，只有具有低d值的多肽的折疊形式才顯著地對觀察到的NOEs作出貢獻，從而在具有未折疊形式的快速構象平衡的存在下，在基于NOE的NMR結構測定中通常只獲得折疊的結構。不同的平均值應用于在觀察到的和無規卷曲的13Cα化學位移之間的差異，Δδ(13Cα)，它因而能夠與常規二級結構對象總體定性地關聯(Luginbuhl等，1995；Wishart，D.S.和Sykes，B.D.(1994)The13C Chemical-ShiftIndexa simple method for the identification of protein secondary structure using13Cchemical-shiftdata.J.Biomol.NMR 4，171-180)。
圖5顯示13Cα化學位移差異Δδ(13Cα)相對于hPrP(121-230)氨基酸序列的圖(A)和(B)，分別為hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)對無規卷曲(Wishart，D.S.，Bigam，C.G.，Holm，A.，Hodges，R.S.和Sykes，B.D.(1995)1H，13C and15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids.I.Investigations of nearestneighboreffects.J.Biomol.NMR 5，67-81)；(C)和(D)，分別為hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)對野生型hPrP(121-230)(Zahn等，2000)。在hPrP(121-230)的兩種突變體中的氨基酸替換的位置通過序列位置表示。在(B)和(D)中的矩形表示殘基164-171，因為它13Cα化學位移無法在hPrP(M166C/Y225C)中進行歸屬。在(C)和(D)中，由于這些13Cα化學位移無法在hPrP(121-230)中進行歸屬，對殘基169和175沒有給出數據。在頂部給出了常規二級結構元件的定位。
圖5A顯示盡管相對于無規卷曲位移，所有位于hPrP(M166C/E221C)的α3螺旋內的13Cα原子共振都進行了低磁場位移，所有在C端兩個轉折內的殘基的較小的Δδ(13Cα)值顯示了朝向C端的α螺旋結構的下限值。考慮到在基于NOE的結構中其未出現，這種平衡似乎帶有多肽的未折疊形式。比較hPrP(M166C/E221C)和hPrP(121-230)之間Δδ(13Cα)值進一步顯示了在突變蛋白質的片段222-228內除了一個以外其它所有的化學位移都是高磁場位移(圖5C)。因而額外二硫鍵的引入似乎稍微降低了在C端兩個α3轉折中螺旋結構的數量。
在13Cα化學位移中出現的構象平衡與可通過異核的15N{1H}-NOEs測量檢測到的分子內速率進程相關。對于hPrP(121-230)和hPrP(M166C/E221C)而言，15N{1H}-NOEs顯示了在大多數氨基酸序列上的均一分布，對于具有hPrP(121-230)尺寸的球狀蛋白質而言，具有典型值。
圖6顯示hPrP(M166C/E221C)(黑條)和hPrP(121-230)的穩態15N{1H}-NOEs(開放的方形)。對于hPrP(121-230)而言，由于線加寬無法觀察到殘基169、170、171和175的酰胺質子。殘基137、158和165是脯氨酸。在底部給出了常規二級結構元件的定位。
除了螺旋α3的最后兩個轉折，只有殘基121-126和殘基191-198顯示降低的正的或負的15N{1H}-NOE值，所述殘基121-126未結構化并且在完整PrP中通過柔性尾部與球狀結構域聯接，所述殘基191-198形成有些無序的螺旋α2的C端末尾以及緊接的環(Zahn等，2000)。因而在兩種蛋白質中螺旋α3都是唯一充分限定的結構區域，帶有一定程度上高于平均值的內部流動性，并且在hPrP(M166C/E221C)中額外二硫鍵的引入引起了α3螺旋結構數量的降低及其內部流動性的稍微增加。
5.hPrP(M166C/Y225C)的光譜特征在hPrP(M166C/Y225C)的NMR譜中增加的線寬(圖3B)使得無法進行完整的主鏈歸屬。對于Arg164、Cys166、Asp167、Glu168、Tyr169、Ser170、Asn171和Phe175的酰胺質子和酰胺氮而言，無法獲得明確的歸屬。同時考慮到NMR數據有限的質量以及下面描述的模型計算，我們僅完成了基于13Cα化學位移的常規二級結構分析。結果，相對于無規卷曲以及相對于野生型hPrP(121-230)(圖2)的13Cα化學位移的差異顯示了野生型hPrP(121-230)的二級結構元件是保守的，對于這種突變蛋白質也是保守的。
6.對于具有兩個二硫鍵的其它hPrP(121-230)突變體的模型計算為研究野生型hFrP(121-230)結構的相容性，使用一個具有改變位置的額外二硫鍵，，我們利用程序DYANA 進行了一系列的模型計算。我們使用與前述hPrP(121-230)的新結構測定相同的距離和二面角作為輸入數據，除此以外加入三個上限和三個下限距離約束以計算每一個不同的單獨的額外二硫鍵(Williamson等，1985)，除去被半胱氨酸取代的殘基的βCH2之外的質子的所有NOE約束。在表II中結果顯示了所有連接殘基165或166與殘基221、222或225的二硫鍵約束的計算值都高度一致，與hPrP(121-230)的計算值相比沒有或僅有輕微的殘基DYANA靶功能值的升高。而且，這些二硫鍵的引入沒有導致明顯的殘基上限二硫鍵約束偏差，并且相對于hPrP(121-230)的平均坐標，突變蛋白質的“RMSD”位于由20個構象異構體所包含的構象空間之內。作為一種分子內控制我們也研究了具有連接野生型Cys和人工Cys殘基的二硫鍵的蛋白質。這些計算值確實相當地一致，但得到的結構顯示了明顯提高的靶功能值、二硫鍵約束偏差以及RMSD值。
表II在向以前用作野生型hPrP(121-230)a結構測定的輸入值中加入對于引入一個額外二硫鍵的約束后計算的hPrP(121-230)的二硫突變體的特性鑒定
a通過將兩個天然Cys殘基和兩個人工的額外Cys殘基結合成兩個二硫鍵生產八個不同的突變蛋白質，其中額外的半胱氨酸占據著5個不同的序列位置。進行結構計算的輸入值采用來自野生型hPrP(121-230)的輸入值，其數據也列于頂排以作比較。對于兩個Xxx到Cys的轉換，將具有在殘基的βCH2之外的側鏈質子的NOEs從列在第二欄中的NOE上限距離約束中減去。通過標準的三個上限和三個下限距離約束計算列在第一欄中的每個二硫鍵(Williamson等，1995)。每次運算以100種隨機化的結構起始。
b在輸入值中NOE上限距離約束的數值。
c殘基DYANA靶功能值()。對于用來代表結構的20種構象異構體的集合給出平均值±標準偏差。
d大于0.1的殘基上限二硫鍵約束偏差的平均值±標準偏差。大于0.1的殘基下限二硫鍵約束偏差的數值在所有的計算值中都在0和1之間。
e相對于殘基125-228的的主鏈重原子N、Cα和C’計算的平均坐標的20種構象異構體集合的RMSD值(，平均值±標準偏差)。
f對殘基125-228計算的突變蛋白質和hPrP(121-230)的平均結構之間的RMSD值()。
7.于pH7處球狀蛋白質結構的穩定性
對hPrP(121-230)和蛋白變體的球狀蛋白質穩定性進行測定，在含不同濃度的氯化胍(GdmCl)的溶液中監測于222nm的摩爾橢圓率。
圖7顯示人朊病毒蛋白質的GdmCl依賴的殘基平均摩爾橢圓率(A)在含有20mM磷酸鈉的pH7.0的緩沖液中和(B)在含有20mM醋酸鈉的pH5.0的緩沖液中。(A)和(B)中的波譜在22℃30μM的蛋白質溶液中進行記錄實心方形，hPrP(121-230)；開放方形，hPrP(M166C/Y225C)；實心圓形，hPrP(M166C/E221C)。
在pH7.0時，hPrP(121-230)發生了一種高度協同的二態轉變(圖7A)，它具有轉變的中間點[D]1/2＝2.1M以及在不存在變性劑情況下的解折疊自由能ΔG0＝19kJmol-1。這些熱動力學值近似于對hPrP(90-231)測定的那些值(Swietnicki，W.，Petersen，R.，Gambetti，P.和Surewicz，W.K.(1997)pH-dependentstability and conformation of the recombinant human prion protein PrP(90-231).J BiolChem，272，27517-27520)。對于兩種hPrP(121-230)變體而言，也觀察到了單獨的折疊轉變(圖7A)。但是，hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)顯示了轉變中間點[D]1/2的升高，提示球狀結構被改造的二硫鍵穩定化了(Fersht，A.R.(1993)The sixth Datta Lecture.Protein folding and stabilitythe pathway of folding ofbarnase.Febs Lett，325，5-16；Fersht，A.R.(1994)Jubilee Lecture.Pathway andstability of protein folding.Biochem Soc Trans，22，267-273)。蛋白變體較低的協同性提示了背離了二態折疊機制。
8.于pH5.0處α螺旋相對于β折疊二級結構的穩定性在pH5.0時，hPrP(121-230)顯示了兩種在1.3和2.7M GdmCl中具有轉變中間點的明顯的折疊轉變區域，清楚地表明在約2 M GdmCl中存在折疊中間體的最大化增加(圖7B)。對于hPrP(90-231)已經報道了在GdmCl中于平衡解折疊期間一種穩定的折疊中間體的存在并在緩沖液的pH小于4.0時觀察到這種穩定的折疊中間體的存在(Swietnicki等，1997)。但是在pH5.0時，hPrP(90-231)的解折疊曲線接近于一種二態轉變模型。因而似乎柔性無序的肽片段90-120使折疊的中間體去穩定化，可能是通過與球狀蛋白質相互作用，這種折疊中間體在低GdmCl濃度和酸性pH下積聚(Zahn等，2000).
變性蛋白質降低的溶解性使得在1.2 M GdmCl濃度下無法進行定性的CD測定(圖7B)，因此我們對這些蛋白質無法測定折疊轉變模型。與在中性pH下獲得的數據相似，相對于hPrP(121-230)的第二個轉變中間點所觀察到的hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)的折疊轉變中間點向更高摩爾濃度的變性劑位移，而折疊協同性降低了(圖7B)。
為了深入了解人朊病毒蛋白質在相應于hPrP(121-230)的穩定折疊中間體存在的條件下的構象特性，我們于pH5.0處在存在或不存在2 M GdmCl的情況下測定了深紫外CD光譜。
圖8顯示了人朊病毒蛋白質的圓二色性光譜(A)hPrP(121-230)，(B)hPrP(M166C/E221C)和(C)hPrP(M166C/Y225C)。在2 M GdmCl存在(粗線)或不存在(細線)的情況下，用在pH5.0和22℃的20mM醋酸鈉中的20μM蛋白質溶液來記錄光譜。
三種蛋白質在不存在變性劑時的光譜基本相似(圖8)，在208和222nm處有最小值，表示所有三種蛋白質具有大量α螺旋結構。在蛋白變體的光譜中相對于野生型的輕微差異可以歸因于另外的二硫鍵在深紫外區的額外吸收(Coleman，D.L.和Blout，E.R.(1968)Optical activity of disulfide bond in L-cystineand some deriva-tives of L-cystine.J Am Chem Soc，90，2405-2416)，因為除了在二硫鍵插入點周圍小的局部性變化外，結構都十分相似。而且，從NMR的化學位移測定知道在hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)二者的螺旋α3內，α螺旋二級結構的數量稍微減少了(圖5)。
在hPrP(121-230)的折疊中間體最大化增加的2M GdmCl中，在hPrP(121-230)CD譜中的雙最小值由在213nm處的單個最小值所取代(圖8A)，這是富含β折疊二級結構的蛋白質的特性。對于hPrP(90-231)在pH4.0已描述了一種相似的單體折疊中間體，它在1M GdmCl中最大化增加(Swietnicki等，1997)，并且還描述了小鼠的PrP(121-231)于4M尿素中最大化增加(Hornemann，S.和Glockshuber，R.(1998)A scrapie-like unfolding intermediate of theprion protein domain PrP(121-231)induced by acidic pH.Proc Natl Acad Sci USA，95，6010-6014)。有人假定這些中間體可能代表一種PrPSc的可溶性前體。在對hPrP(90-231)的構象轉變機制更詳細了解的基礎上(Swietnicki，W.，Moril-las，M.，Chen，S.G.，Gambetti，和Surewicz，W.K.(2000)Aggregation and fi-brillization ofthe recombinant human prion protein huPrP(90-231).Biochemistry-Us，39，424-431)，發現β折疊中間體寡聚成大分子量的聚合物，它們共同具有一些PrPSc淀粉樣蛋白的物理性質。對于小鼠PrP(121-230)(Hornemann等，1998)和hPrP(121-231)而言，沒有觀察到這些聚合物，可能是由于這些構建體缺少肽片段90-120，它對于在腦中PrPC向PrPSc轉變期間α螺旋向β折疊二級結構的構象轉變是必需的(Prusiner，S.B.，Groth，D.F.，Bolton，D.C.，Kent，S.B.和Hood，L.E.(1984)Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.Cell，38，127-134)；Pan等，1993)。但是，基于β折疊二級結構相似的CD譜特征，我們相信所有的中間體在特性上是相似的，并且因此可能都牽涉到導致致病蛋白質的構象轉變。
兩種變異的朊病毒蛋白質在2M GdmCl中的CD譜對于富含α螺旋結構的蛋白質是典型的(圖8B和8C)，表示沒有折疊中間體的積累，所述折疊中間體具有增加的β折疊結構。當與天然蛋白質相比時208nm相對于222nm在振幅上相對增加，可以通過α螺旋向無規卷曲構象的部分轉變而進行合理地說明，但對于在GdmCl存在下則沒有證據表明α螺旋-β折疊的轉變，如同野生型蛋白質的情況一樣。
圖9顯示人朊病毒蛋白質(A)hPrP(121-230)，(B)hPrP(M166C/Y225C)和(C)hPrP(M166C/E221C)的溫度依賴的平均殘基摩爾橢圓率。在10mM pH4.5醋酸鈉中蛋白質濃度為24μM。
三種朊病毒蛋白質在酸性條件下的熱解折疊發生在單個的轉變中(圖9)，但是相對于蛋白變體的野生型的性質不同的折疊特征也在熱解折疊實驗中出現。hPrP(121-230)的二態熱解折疊與大約60℃的變性溫度高度協同(圖9A)。hPrP(M166C/Y225C)和hPrP(M166C/E221C)的折疊轉變協同性要小得多，并且向更高溫度位移超過10℃(圖9B和9C)，再次反映了更大的穩定性。對于蛋白變體無法測定折疊轉變的精確溫度，因為即使在100℃它們還未達到解折疊后的階段并包含在222nm處具有負橢圓率的蛋白質二級結構的顯著度(significant degree)。
結果討論人Dpl和人PrP球狀結構域的比較既揭示了相近的球狀相似性還揭示了顯著的局部差異(T.Luhrs，R.Riek，P.Gun-tert und K.Wüthrich，未發表)。對于相應的鼠蛋白質報道了相似的觀察結果(Mo，H.，Moore，R.C.，Cohen，F.E.，Westaway，D.，Prusiner，S.B.，Wright，P.E.和Dyson，H.J.(2001)Two differentneuro-degenerative diseases caused by proteins with similar structures.Proc Natl AcadSci USA，98，2352-2357)。在相應于hPrP中假定的因子X抗原表位的hDpl結構的區域之內(Telling等，1994；Prusiner，1998)，螺旋α3縮短了兩個以上的轉折，并且相對連接β2和α2的環，C端的肽片段144-149進行了折疊。在兩種蛋白質之間，在PrP序列中因子X抗原表位之前緊接著β折疊平面，相對于由螺旋二級結構形成的分子構架旋轉了大約180°，并且在hDpl中它位于接近螺旋α1的兩個殘基處。而且，在hDpl中hPrP的螺旋α2，它在PrP序列中連接著因子X的抗原表位，被兩個較短的螺旋α2a和α2b所取代。現有的一種包含兩個二硫鍵的突變人朊病毒蛋白質結構的測定使得能夠對在因子X抗原表位中的hPrP和hDpl的分子結構之間的關系作出新的了解，它也可能支持正在進行的對于兩種蛋白仍舊未知的功能的研究。
突變的hPrP的球狀結構與野生型hPrP和hDpl二者都相似。hPrP(M166C/E221C)和hDpl的平均結構中的普通α螺旋的殘基的主鏈重原子之間的RMSD值為1.69。在三維結構疊加為具有最小RMSD這種構架之后，在hPrP(M166C/E221C)中的人工二硫鍵和在hDpl中相應的天然二硫鍵的位置和取向都近似。考慮到在hDpl中二硫鍵Cys94-Cys145連接兩個沒有常規二級結構的片段，即環91-100和殘基142-153的C端片段，而在突變的hPrP中二硫鍵Cys166-Cys221相對于螺旋α3錨定易變的環165-172(見圖2)，這是相當令人驚奇的。從目前的數據來看好像在PrP中觀察到的假定因子X抗原表位的局部結構可能一開始也在Dpl中存在，在94位有一個半胱氨酸殘基，它與另一個半胱氨酸形成一個二硫鍵，另一個半胱氨酸位于與一直延伸到C端的螺旋α3相諧調的位置，例如147位(圖2)。在進一步的進化中，在螺旋α3中的一個缺失將這個半胱氨酸重定位于位置145(圖1)，那里它與在約殘基141范圍外的常規α螺旋不相容。隨后自然界好像選擇了這個二硫橋以及未充分結構化的C端肽片段。由于在所有已知的哺乳類Dpl序列中這個二硫鍵普遍存在Moore等，1999)，清楚地顯示這種令人感興趣的離C端最近的Cys位置的選擇在生理性的Dpl功能中具有一種特異性的作用。環91-100在位置98包含一個Asn連接的糖基化位點的事實獨立地提出Dpl的這種結構性區域與在PrP中因子X抗原表位具有不同的功能(Moore等，1999)，這一糖基化位點在PrP中沒有對應部分。如果對于朊病毒增殖而言，因子X相互作用是實際上必需的，那么在Dpl的這一分子區域中二硫鍵相關的不同構象可能為所觀察到結果提供理論基礎，該觀察結果即至今沒有證據表明TSE是由Dpl所引起的(Behrens，A.，Brandner，S.，Genoud，N.，和Aguzzi，A.(2001)Normal neu-rogenesis and scrapiepathogenesis in neural grafts lacking the prion proteinhomologue Doppel.EMBO Rep，2，347-352；Tuzi，N.L.，Gall，E.，Melton，D.和Manson，J.C.(2002)Expression ofdoppel in the CNS of mice does not modulate transmissible spongiformencephalopathy disease.J Gen Virol，83，705-711)。
目前為止沒有藥物可用于治療人和動物的朊病毒疾病。在惟蛋白質假說的框架內(Prusiner，1998)，可以設想至少兩種機制能夠阻止導致TSE的毒性蛋白質的累積。第一種機制依賴于“PrPC結合物”特異性結合到朊病毒正常結構上，因而阻止PrPC折疊成PrPSc。在“晶核形成”模型(Jarrett，I.T.and Lansbury，P.T.，Jr.(1993)Seeding″one-dimensional crystallization″of amyloida pathogenicmechanism in Alzheimer’s disease and scrapie？Cell，73，1055-1058)的內容中，提出PrPC和PrPSc處于快速建立的平衡態中，PrPC結合分子可以簡單地穩定PrPC的天然蛋白質構象從而通過降低聚合的核的濃度而減緩轉變動力學(Prusiner，S.B.，Scott，M.，Foster，D.，Pan，K.M.，Groth，D.，Mirenda，C.，Torchia，M.，Yang，S.L.，Serban，D.，Carlson，G.A.等.(1990)Transgenetic studies implicate interactions betweenhomologous PrP isoforms in scrapie prion replication.Cell，63，673-686)，PrPC結合物可以直接阻抑PrPSc的結合位點或另一種朊病毒增殖所必需的分子如蛋白質X(Telling等，1994；1995)。第二種機制利用一種“PrPSc結合物”去阻抑PrPSc同種聚集成淀粉樣蛋白原纖維或去干擾與其它大分子的異種相互作用，否則這種作用將與致病途徑相關。PrPSc結合物較PrPC結合物的好處是它們不干擾蛋白質細胞形式的尚不清楚的生理功能。
幾篇最近的報道指出直接抗PrPC的抗體具有在體外從感染瘙癢病的細胞中去除海綿狀腦病傳播因子的潛力(Enari，M.，Flechsig，E.和Weissmann，C.(2001)Scrapie prion protein accumulation by scrapie-infected neuroblastoma cellsabrogated by exposure to a prion protein antibody.Proc Natl Acad Sci USA，98，9295-9299；Horiuchi，M.和Caughey，B.(1999)Specific binding of nor-mal prion protein tothe scrapie form via a localized domain initiates its conver-sion to the protease-resistant state.Embo J，18，3193-3203)。一種體液免疫反應能夠在體內阻止羊瘙癢病的發病，顯示保護性抗朊病毒免疫的誘導似乎是可行的(Heppner，F.L.，Musahl，C.，Arrighi，I.，Klein，M.A.，Rulicke，T.，Oesch，B.，Zinkernagel，R.M.，Klinke，U.和Aguzzi，A.(2001)Prevention of scrapie pathogenesis by transgenic expression of anti-prion protein antibodies.Science，294，178-182)。這些研究大多數都認定包含朊病毒蛋白質殘基的132-156的區域為抗體結合的靶位(Heppner等，2001)。已經對在ScN2a細胞中各種結合到PrPC上并抑制朊病毒增殖的多種化合物進行了描述，但只有少數幾個在動物實驗中顯示了短暫的治療效果(Gilch，S.，Winklhofer，K.F.，Groschup，M.H.，Nunziante，M.，Lucassen，R.，Spielhaupter，C.，Muranyi，W.，Riesner，D.，Tatzelt，J.和Schatzl，H.M.(2001)Intracellular reroutingof prion protein prevents propagation of PrPs′and delays onset of prion disease.Embo J，20，3957-3966)。最近抗瘧疾藥米帕林被鑒定為治療克-雅病(CJD)有希望的先導化合物(Doh-Ura，K.，Iwaki，T.和Caughey，B.(2000)Lysosomotropic agents andcysteine protease inhibitors inhibit scrapie-associatedprion protein accumulation.JVirol，74，4894-4897；Korth，C.，May，B.C.H.，Cohen，F.E.和Prusiner，S.B.(2001)Acridine and phenothiazine derivatives as pharmacotherapeutics for prion disease.ProcNatl Acad Sci USA，98，9836-9841)。人PrP的米帕林結合位點已經定位至“蛋白質X”抗原表位附近的螺旋α3的殘基Tyr225、Tyr226和Gln227上(Vogtherr，M.，Grimme，S.，Elshorst，B.，Jacobs，D.M.，Fiebig，K.，Griesinger，C.和Zahn，R.(2003)Antimalarial drug quinacrine binds to Cterminal helix of cellular prion protein.JMed Chem，(印刷中))。米帕林-PrPC復合物的毫摩爾分解常數提示這種藥物抑制朊病毒在內溶酶體中的增殖，在那里它濃縮了10,000倍(O’Neill，P.M.，Bray，P.G.，Hawley，S.R.，Ward，S.A.和Park，B.K.(1998)4-Aminoquinolines-Past，present，and futureA chemical perspective.Pharmacol Ther，7，29-58)。盡管以米帕林治療的病人的恢復是暫時的(Follette，P.(2003)New perspectives for priontherapeutics meetingPrion desease treatment’s early promise unravels.Science，299，191-192)，基于米帕林及其類似物的第二代藥物還是為治療CJD的更加有效的藥物帶來了希望(May，B.C.H.，Fafarman，A.T.，Hong，S.B.，Rogers，M.，Deady，L.W.，Prusiner，S.B.和Cohen，F.E.(2003)Potent inhibition of scrapie prionreplication in cultured cells by bis-acridines.Proc Natl Acad Sci USA，100，3416-3421)。
只有少數幾種能特異性結合到朊病毒的羊瘙癢病構象上的具有治療潛力的少數化合物得以鑒定。1997年發現了一種單克隆PrPSc結合抗體(Kort，C.，Stierli，B.，Streit，P.，Moser，M.，Schaler，O.，Fischer，R.，SchulzSchaeffer，W.，Kretzschmar，H.，Raeber，A.，Braun，U.，Ehrensperger，F.，Homemann，S.，Glockshuber，R.，Riek，R.，Billeter，M.，Wüthrich，K.and Oesch，B.(1997)Prion(PrPSc)-specific epitopdefined by a monoclonal antibody.Nature，390，74-77)，但最近沒有報道確證特異性體內結合活性。Soto及其同事構建了一個13殘基的β折疊開關肽，它在體外將PrPSc部分地逆轉成PrPC樣的蛋白質(Soto，C.，Kascsak，R.J.，Saborio，G.P.，Aucouturier，P.，Wisniewski，T.，Prelli，F.，Kascsak，R.，Mendez，E.，Harris，D.A.，Ironside，J.，Tagliavini，F.，Carp，R.I.和Frangione，B.(2000)Reversion of prionproteinconformational changes by syntheticp-sheet breaker peptides.Lancet，355，192-197)。該肽在完整的細胞中也具有活性并且在患瘙癢病的實驗小鼠中延緩臨床癥狀的出現。
另一個已提出用于TSE治療的方法是基于可溶性PrP衍生物洐的設計，它結合到PrPSc上，但不能通過一種模板輔助機制進行轉變并且因此失活結合的PrPSc分子。Bürkel及其合作者顯示小鼠PrP氨基酸114-121的存在在PrPC向PrPSc的轉變中扮演著重要角色，并且缺少這些殘基的缺失突變在細胞培養中表現為PrPSc聚集的顯性失活突變(Hlscher，C.，Delius，H.and Burke，A.(1998)Overexpression of nonconvertible PrPCD114-121 in scrapie-infected mouseneuroblastoma cells leads to trans-dominant inhibition of wild-type PrPScaccumulation.J Virol，72，1153-1159)。因而顯性失活抑制能夠作為治療或預防朊病毒疾病的基礎。最近，Aguzzi及其合作者構建了一種可溶性的二聚朊病毒蛋白質，它在體內結合PrPSc并抗朊病毒疾病(Meier，P.，Genoud，N.，Prinz，M.，Maissen，M.，Rulicke，T.，Zurbriggen，A.，Raeber，A.J.和Aguzzi，A.(2003)Solubledi-meric prion protein binds PrPScin vivo and antagonizes prion disease.Cell，113，49-60)。可溶性的二聚PrP由融合于人IgG1的Fcγ-尾部的全長鼠PrP所組成。在用朊病毒大腦內和腹膜內接種后，在Prnp+/+小鼠中這種可溶性蛋白質的亞化學計量(substochiometric)的量明顯延緩了疾病的發作。這些研究提供了可溶性的PrP融合蛋白質可以用作朊病毒疾病的治療的證據。
結合hPrP(M166C/E221C)和hPrP(M166C/Y225C)結構和熱力學資料暗示PrP的二硫變體也可以作為用于朊病毒疾病的顯性失活治療劑。PrP變異體的天然三維結構使得這些變體可能與野生型PrPC具有對于PrPSc的相似的親和性。PrPC的PrPSc結合位點未知，但由遺傳實驗(Telling等，1994；1995)的證據即螺旋α1(在人PrP中殘基144-154)和前面的環區(在人PrP中殘基132-143)參與PrPSc的結合所證實。在將一個在螺旋α3和環之間的額外的二硫鍵引入后，該環連接螺旋α2及第二個β鏈，該區域結構未改變(圖4)。在用于朊病毒增殖的“模板輔助”PrP模型內容中(Prusiner，1998)，蛋白變體增加的[D]1/2值(圖7)和解鏈溫度(圖9)表明需要更多數量的自由能用于將PrPSc結合的PrPC轉變為能折疊成PrPSc的構象。因而，在蛋白變體中的額外二硫鍵應獨自降低朊病毒增殖的效率并且因此延緩朊病毒疾病的進展。內含體中在pH4.7-5.8下，(Lee，R.J.，Wang，S.和Low，P.S.(1996)Measurement of endosome pH following folatereceptor-mediated endocytosis.Biochim Biophys Acta，1312，237-242)防止向致病蛋白構象轉變的保護作用可能更加明顯，因為蛋白變體的α螺旋二級結構耐抗向β折疊二級結構的構象轉變(圖8B和8C)。因而，在內含體和溶酶體的環境中PrPSc可能陷入一種具有結合PrPC二硫化物變體的復合物中。
研究是否該機制可以在細胞培養和動物實驗過程中得以證實將是令人感興趣的，在細胞培養和動物實驗中將重組的二硫化物變體朊病毒蛋白質進行大腦內或腹膜內接種或利用一種基因治療方法進行體內表達。如果成功，向PrPC內引入穩定的二硫鍵可能會用于治療多種神經變性疾病。
材料和方法1.樣品的制備和特征描述對于未標記形式的和具有均一的13C，5N標記的雙二硫化hPrP(121-230)突變體的克隆、表達和純化，我們基本按照制備野生型hPrP(Zahn等，1997，2000)的方法進行，其中雙殘基交換按照Quickchange定點誘變方案(Stratagene)進行構建。使用Ultrafree-15離心過濾Biomax設備(Millipore)獲得用于NMR譜分析的含有1mM蛋白質的10mM pH4.5[d4]醋酸鈉、90％H2O/10％D2O溶液。
2.NMR測量和結構計算
用裝備有四射頻通道以及帶有防護的Z-梯度線圈的三重共振探頭的BrukerDRX500、DRX600和DRX750波譜儀來進行NMR測量。為了收集構象約束，三維結合的15N/13C解析的[1H，1H]NOESY波譜(Boelens，R.，Burgering，M.，Fogh，R.H.和Kaptein，R.(1994)Time-saving methods for heteronuclear multidimensionalNMR of(13C，15N)doubly labeledproteins.J.Biomol.NMR 4，201-213)在水中被記錄，具有在T＝20℃時的混合時間Tm＝40ms，256(t1)×50(t2)×1024(t3)的復合點，t1，max(1H)＝28.4ms，t2，max(15N)＝20.6ms，t2，max(13C)＝8.3ms，以及t3，max(1H)＝97.5ms，，并且這一數據系列從0一直收集到512×128×2048點。使用程序PROSA來進行波譜歸屬(Güntert，P.，Dtsch，V.Wider，G.和Wüthrich，K.(1992)Processing of multidimensional NMR data with the new softwarePROSA.J.BIOMOL，NMR 2，619-629)。相對于2，2-二甲基-2-silapentane-5-磺酸，鈉鹽，1H，15N和13C的化學位移已被校準。
按照Farow等(Farrow，N.A.，Zhang，O.，Forman-Kay，J.D.and Kay，L.E.(1994)Aheteronuclear correlation experiment for simultaneous determination of 15Nlongitudinal decay and chemical exchange rates of systems inslow equilibrium.J.Biomol.NMR 4，727-734)的方法對穩態15N{1H}-NOEs于600MHZ下進行測量，通過進行20ms間隔的120度脈沖級聯以使用5秒的質子飽和期，t1，max(15N)＝61.0ms，t2，max(1H)＝142.6ms，時域數據大小為152×1024復合點。
使用程序CANDID(Herrmann等，2002)結合結構計算程序DYANA(Güntert等，1997)獲得NOE歸屬。CANDID和DYANA自動執行NOE歸屬和NOE強度的距離校準、共價固定距離約束的去除、以扭角動力學進行的結構計算以及自動的NOE上限距離約束偏差分析。作為CANDID的輸入數據，前述NOESY波譜的峰列表由程序XEASY所得到的重復峰(Bartels，C.，Xia，T.H.，Billeter，M.，Guntert，P.andWüthrich，K.(1995)The program XEASY for computer-supportedNMR spectral analysis of biologicalmacromolecules.J.Biomol.NMR 6，1-10)和用程序SPSCAN進行的峰體積的自動積分(Ralf Glaser，個人通訊)而產生。用CANDID和DYANA進行的運算的輸入數據包含這些峰列表、來自于以前序列特異性共振歸屬的化學位移列表和來自于13Ca轉變的主鏈角Φ和Ψ的二面角約束(Luginbühl等，1995)。按照7個循環的迭代NOE歸屬的標準方法和結構計算來進行計算(Herrmann等，2002)。在最初的六次CANDID循環中，采用模糊距離約束。對于最終的結構計算而言，只有NOE距離約束得以保留，它在運算的第六個循環后相應于具有清楚歸屬的NOE交叉峰。通過比較上限距離約束與得自第六次CANDID循環的結構，對立體特異性歸屬進行鑒定。使用AMBER力場(Cornell，W.D.，Cieplak，P.，Bayly，C.I.，Gould，I.R.，Merz，K.M.，Jr.，Ferguson，D.M.，Spell meyer，D.C.，Fox，T.，Caldwell，J.W.和KoIIman，P.A.(1995)A second generation force field for the simulation of proteins，nucleic acids，andor-ganicmolecules.J.Am.Chem.Soc.117，5179-5197)，將具有最低的終極DYANA靶功能值的20個構象異構體用程序OPALp在水框架內進行能量最小化(Luginbuhl，P.，Guntert，P.，Billeter，M.和Wuthrich，K.(1996)The new programOPAL for molecular dynamics simulations and energy refinements ofbiologicalmacromolecules.J.Biomol.NMR 8，136-146)。利用程序MOLMOL(Koradi，R.，Billeter，M.和Wuthrich，K.(1996)MOLMOLA program for display and analysisofmacromolecular structures.J.Molec.Graphics 14，51-55)來分析得到的20種能量最小化的構象異構體(表I和II)并且制備結構圖。
3.CD測量和平衡態實驗用帶有1mm或者0.2mm徑長比色杯的與Peltier型溫度控制單元接口的Jasco J720旋光分光計記錄圓二色性光譜。222nm處的橢圓率用來監測GdmCl誘導的解折疊，變性曲線與二態模型擬合，假定解折疊的自由能ΔG線性依賴于溶液中的變性劑濃度[D](Bolen，D.W.和Santoro，M.M.(1988)Unfoldingfree-energy changes determined by the linear extrapolation method.2.Incorporation ofdelta G degrees N-U values in a thermodynamic cycle.Biochemistry-Us，27，8069-8074；Santoro，M.M.and Bolen，D.W.(1988)Unfolding free-energy changesdetermined by the linear extrapolation method.1.Unfolding of phenylmethanesulfonylalpha-chymotrypsin using different denaturants.Biochemistry-Us，27，8063-8068)ΔG＝ΔG0+m[D]，其中m表示解折疊的協同效應而ΔG0為在不存在變性劑情況下的ΔG。通過將轉變前和轉變后的基線外推入轉變區而獲得在轉變區的平衡常數的賦值。二態模型用于擬合這些數據，即假定如下相關的觀察到的信號SobsSobs＝((SN+mN[D])exp(-(ΔG+m[D])/RT+SD+mD[D])/(1+exp(-(ΔG+m[D])/RT))，其中SN和SD以及mN和mD分別為轉變前和轉變后階段的截距和斜率，T為開氏絕對溫度而R為氣體常數。因而，在轉變的中間點[D1/2]，指數形式的自變量一定為零[D]1/2＝Δ0/m。
進行熱變性實驗，于222nm處監測圓二色性，同時以每小時50℃變化的恒速從10℃到90℃改變溫度。
權利要求
1.一種蛋白質突變體，所述蛋白質在進行了構象轉變以后引發一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發性硬化癥和帕金森病的神經變性疾病；和/或其它b)包括原發性系統淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構象病；其中蛋白質突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵在人和動物中抑制這種蛋白質的一種構象轉變。
2.權利要求1的蛋白質，其中所述的至少一個額外的二硫鍵的改造是在位于與結構上相關的非致病蛋白質中二硫鍵相似的位置上進行的。
3.權利要求1的蛋白質，其中所述的蛋白質為一種朊病毒蛋白質，所述的至少一個改造的額外二硫鍵位于球狀結構域中。
4.權利要求3的朊病毒蛋白質，其中所述的至少一個改造的額外二硫鍵位于與doppel蛋白質(Dpl)中相似的位置上。
5.權利要求3的朊病毒蛋白質，其中所述蛋白質包含一種“因子X”結合表位并且所述的至少一個改造的額外二硫鍵位于這種“因子X”結合表位內。
6.權利要求3的朊病毒蛋白質，其中將所述的至少一個改造的額外二硫鍵引入到人朊病毒蛋白質中包含氨基酸殘基165-175的第一節段和包含C端氨基酸殘基215-230的第二節段之間，或在其它物種中結構上相應的氨基酸節段之間。
7.權利要求6的朊病毒蛋白質，其中所述的至少一個改造的額外二硫鍵連接氨基酸殘基M166C和E221C或連接氨基酸殘基M166C和Y225C。
8.編碼一種蛋白質突變體的核酸序列，所述蛋白質在進行了構象轉變以后引發一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發性硬化癥和帕金森病的神經變性疾病；和/或其它b)包括原發性系統淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構象病；其中該核酸序列編碼蛋白質突變體或其變體，該蛋白質突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵在人和動物中抑制這種蛋白質的構象轉變。
9.包含根據權利要求8的核酸序列的和/或由根據權利要求8的核酸序列編碼的質粒構建體、載體、轉化的細胞、包括牛、羊、貓、駝鹿和鹿的轉基因動物，以及重組蛋白質。
10.一種蛋白質突變體的應用，該蛋白質在進行了構象轉變以后引發一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發性硬化癥和帕金森病的神經變性疾病；和/或其它b)包括原發性系統淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構象病；其中蛋白質突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，它在人和/或動物中抑制這種蛋白質的一種構象轉變，其中所述蛋白質突變體被用于構象病的治療性處理。
11.一種蛋白質突變體應用，該蛋白質在進行了構象轉變以后引發一種疾病，所述疾病包括a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發性硬化癥和帕金森病的神經變性疾病；和/或其它b)包括原發性系統淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構象病；其中蛋白質突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，它在人和/或動物中抑制這種蛋白質的一種構象轉變，其中所述蛋白質突變體被用于制備治療性處理構象病的藥物。
12.根據權利要求10或11的應用，其中所述改造的額外二硫鍵阻止突變的PrPC向PrPSc的構象轉變并因此通過顯性失活抑制作用阻抑了在共存的野生型蛋白質中PrPC向PrPSc的構象轉變。
13.根據權利要求10或11的應用，其中通過突變的PrPC結合到野生型PrPC上抑制所述野生型PrPC向PrPSc寡聚體的構象轉變。
14.根據權利要求10或11的應用，其中通過突變的PrPC結合到野生型PrPSc寡聚體上抑制所述野生型PrPSc寡聚體向PrPSc淀粉樣蛋白原纖維的構象轉變。
15.根據權利要求10或11的應用，其中通過突變的PrPC結合到野生型PrPSc上抑制所述野生型PrPC向PrPC/PrPSc異源二聚體的構象轉變。
16.根據權利要求10或11的應用，其中通過突變的PrPC結合到野生型PrPSc淀粉樣蛋白原纖維上抑制淀粉樣蛋白原纖維的延伸或淀粉樣蛋白原纖維分解成PrPSc寡聚體。
17.根據權利要求8，9，10或11的應用，其中在體內產生朊病毒蛋白質的二硫突變體或其變體以便能夠在人類中進行傳播性海綿狀腦病(TSE)的預期治療，例如通過以慢病毒載體進行的體細胞基因治療，其中TSE包括自發性的、遺傳的、醫源性的以及不同形式的克-雅病(CJD)，致命性家族性失眠癥(FEI)和Gerstmann-Strussler-Scheinker綜合征(GSS)。
18.根據權利要求10或11的應用，其中進行朊病毒蛋白質的二硫突變體或其變體的重組生產以便能夠在人類中進行TSE的預期治療，例如通過重組蛋白質的直接應用，其中TSE包括自發性的、遺傳的、醫源性的以及不同形式的CJD、FFI和GSS。
19.根據權利要求8，9，10，或11的應用，其中在體內產生朊病毒蛋白質的二硫突變體或其變體以便能夠在動物中進行TSE的預期治療，例如通過使用慢病毒載體體細胞基因治療，其中TSE包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊瘙癢病、貓海綿狀腦病(FSE)以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)。
20.根據權利要求10或11的應用，其中進行朊病毒蛋白質的二硫突變體或其變體的重組生產以便能夠在動物中進行TSE的預期治療，例如通過重組蛋白質的直接應用，其中TSE包括BSE、羊瘙癢病、FSE以及CWD。
21.根據權利要求10或11的應用，其中進行朊病毒蛋白質的二硫突變體或其變體的重組生產作為應用于人或動物的TSE檢測的“PrPC抗轉變標準”，其中重組的PrPC由來自病理組織或體液如血液和尿液的PrPSc而擴增。
22.根據權利要求10或11的應用，其中在體內產生朊病毒蛋白質的二硫突變體或其變體以便能夠通過用慢病毒載體的體細胞基因治療進行TSE抗性動物的育種，其中動物包括牛、羊、貓、駝鹿、鹿、豬、馬和魚。
23.治療人類中的a)包括傳播性海綿狀腦病(TSE)、阿爾茨海默癥、多發性硬化癥和帕金森病的神經變性疾病；和/或其它b)包括原發性系統淀粉樣變性、II型糖尿病和動脈淀粉樣變性的構象病的藥物，所述藥物包含一種蛋白質突變體或其變體，該蛋白質突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵抑制這種蛋白質的構象轉變。
24.治療牛海綿狀腦病、羊瘙癢病、貓海綿狀腦病以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病的藥物，所述藥物包含一種蛋白質突變體或其變體，該蛋白質突變體或其變體包含至少一個額外的改造的二硫鍵，所述二硫鍵抑制這種蛋白質的構象轉變。
全文摘要
本發明涉及一種朊病毒蛋白質(PrP)突變體，它的球狀結構域在與人doppel蛋白質(hDpl)相似的位置包含一個改造的另一個二硫鍵。在一個實施方案中，朊病毒蛋白質在假定的“因子X”結合抗原表位具有一個改造的額外二硫鍵，并適應輕微的、嚴格局限的構象變化以抑制在人和動物中朊病毒的增殖。還公開了朊病毒蛋白質(PrP)突變體或其片段的用途，即在治療性處理或制備治療性處理蛋白質構象轉變后引發的疾病的藥物中的用途，例如在人類中的傳播性海綿狀腦病(TSE)、不同形式的克－雅病(CJD)、致命性家族性失眠癥(FFI)和Gerstmann－Strussler－Scheinker綜合征(GSS)，所述PrP的球狀結構域在與人doppel蛋白質相似的位置包含至少一個改造的額外二硫鍵。另外，還公開了使用PrP蛋白質突變體在體內產生朊病毒蛋白質或其片段的二硫突變體的應用，以便能夠在動物中進行TSE的預期治療，例如通過使用慢病毒載體的體細胞基因治療，其中TSE包括牛海綿狀腦病(BSE)、羊瘙癢病、貓海綿狀腦病(FSE)以及在駝鹿和鹿中的慢性消耗性疾病(CWD)。
文檔編號C12Q1/00GK1665837SQ03816220
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月5日 優先權日2002年7月11日
發明者R·扎恩 申請人:瑞士聯邦蘇黎世技術大學