專利名稱：同源補體介導下裂解活化淋巴細胞的人IgM抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及與HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體，此抗體通過與活化淋巴細胞的分化抗原反應，在同源人補體的介導下，裂解活化淋巴細胞，本發明還涉及含有該單克隆抗體的治療自身免疫疾病藥物。
背景技術：
現已開發出各種免疫抑制劑如環孢菌素和FK506，用于控制膠原蛋白疾病、自身免疫疾病和器官移植中的生物免疫反應。但是，由于這些免疫抑制劑與免疫活性細胞以外的細胞反應，應考慮到這些藥物的副反應。
現已研究了各種使用特別作用于目標細胞的抗體的方法。例如，與目標細胞反應的抗體被期望通過與補體反應而被裂解。但是由于人細胞膜上存在種族特異性補體調控膜因子(如DAF，衰變加速因子；MCP，膜輔助因子蛋白；以及HRF20，20kDa同源限制因子)，它們通過補體反應使不能誘導細胞裂解反應，以阻止同源人補體中的反應。
另一方面，人血清中與HIV感染細胞反應的IgM抗體被發現可通過人補體越過補體調控膜因子，使HIV感染細胞產生細胞裂解反應。IgM抗體被發現可對神經節苷脂如GM2和Gg4表現出類似上述的反應，而神經節苷脂的表達被HIV感染增強(Japanese Patent Application Laid-OpenNo.9-227409)。
L55被報道為人抗GM2神經節苷脂IgM單克隆抗體，其中L55由EB病毒轉形的無限增殖人B原淋巴細胞產生。用此人IgM單克隆抗體處理后的HIV感染細胞被發現通過人補體反應產生裂解。
發明內容
本方面的一個目的是提供控制免疫應答的藥物，該藥物包含特別作用于活化淋巴細胞的人IgM單克隆抗體，以在同源補體介導下誘導細胞裂解。
作為解決上述問題而進行的透徹研究的結果，本發明提供與HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體，該抗體在同源人補體介導下，裂解人活化淋巴細胞。
本發明為解決上述問題提供了一種HIV藥物，該藥物治療T淋巴細胞過度應答造成的移植排斥反應和自身免疫疾病，以及通過使用與HIV感染細胞和活化淋巴細胞反應的人IgM單克隆抗體，細胞裂解清除活化淋巴細胞以治療HIV感染疾病。
更具體的說，本發明為解決上述問題提供了第一方面到第二個方面任一項的人IgM單克隆抗體，其中該與活化淋巴細胞和HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體為9F11抗體，具有序列編號1表示的H鏈可變區堿基序列。
更具體的說，本發明為解決上述問題提供了第一方面到第三個方面任一項的人IgM單克隆抗體，其中該與活化淋巴細胞和HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體為9F11抗體，具有序列編號2表示的L鏈可變區堿基序列。
圖1示出了9F11抗體特異性。
流式細胞儀分析的結果示出HIV感染細胞被9F11抗體染色，而非感染細胞則沒有。
圖2示出了9F11抗體對外周血淋巴細胞的特異性。
此圖示出9F11抗體與受PHA刺激的活化淋巴細胞反應，但它不與正常外周血淋巴細胞反應(PBMC外周血淋巴細胞)。
圖3示出了9F11抗體在補體介導下的細胞損傷反應。
(A)向HIV-1感染細胞MOLT-4/IIIB中加入2μg/ml的9F11抗體和新鮮人血清(包括補體成分)后，幾乎所有的細胞在4小時內被摧毀。在未加入血清時或未感染細胞MOLT-4中沒有觀察到任何效果。
(B)通過使用PHA活化外周血活化淋巴細胞誘導9F11抗原，細胞被9F11抗體和補體損傷，如同在HIV-1感染細胞中(FHS新鮮人血清(作為補體來源)，PHA人活化淋巴細胞活化劑，％51Cr release＝細胞死亡率，PBMC外周血淋巴細胞)。
圖4簡要例示9F11μ鏈表達質粒結構。
具體實施例方式
雖然本發明通過實施例被詳細說明，本發明的技術范圍不被這些實施例所限制。
為解決上述問題，本發明的發明人使小鼠(TC鼠轉染色體小鼠；Kirin Brewery Co.，Ltd.制備)的HIV感染細胞免疫，該小鼠中被轉入含有人免疫球蛋白基因的染色體，從而獲得產生特別作用于HIV感染細胞的人抗體的小鼠。通過此傳統的方法，融合免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株，制備雜交瘤。從雜交瘤中選出產生單克隆抗體的克隆，其中所述單克隆抗體作用于HIV感染細胞，并在人補體存在下導致感染細胞裂解。將所選雜交瘤命名為9F11細胞株。9F11細胞株產生的9F11單克隆抗體為人IgM單克隆抗體，包含人μ鏈和人κ鏈。雖然9F11抗體可在人補體介導下與HIV感染細胞反應，產生細胞裂解，該抗體也可導致未感染的淋巴細胞的活化淋巴細胞裂解。相應地，對HIV感染細胞的應答可理解為HIV感染使淋巴細胞達到某活化狀態，HIV感染細胞表達作為分化抗原的抗的9F11抗原(9F11抗原)，在人補體介導下被裂解。換句話說，9F11抗原為由淋巴細胞活化表達的分化抗原，在補體介導下通過與抗原反應誘導細胞裂解的9F11抗體，在補體介導下特別導致活化淋巴細胞裂解。因此可以解釋包含9F11抗體的藥物可用在抑制活化淋巴細胞的治療中。本發明完全基于上述發現。產生本發明9F11抗體的9F11細胞株于2003年5月8號由國際先進工業科學協會—國際專利組織保藏處(NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，International PatentOrganism Depository，Chuo-6，Higashi 1-1-1，Tsukuba City，Ibaraki Pref.)保藏，保藏號(accession number)FERM BP-8379。
表1示出κ鏈和μ鏈可變區中分別編碼9F11抗體基因的堿基序列分析結果。恒定區的堿基序列與報道基因的堿基序列大致相同。
表1μ鏈可變區堿基序列GCTGAATTCTGGCTGACCAGGGCAGTCACCAGAGCTCCAGACAATGTCTGTCTCCTTCCTCATCTTCCTGCCCGTGCTGGGCCTCCCATGGGGTGTCCTGTCACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCGCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCCATTGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGAGAATTACTATGGTTCGGGGAGGTACAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAκ鏈可變區堿基序列TGTCAGGACACAGCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA用于免疫反應調節劑的本發明組合物包含人IgM單克隆抗體，該抗體特別與活化淋巴細胞反應，并在同源補體介導下誘導細胞裂解，所述組合物可通過與生理學可接受的載體結合獲得。生理學可接受的載體是本領域已知的，包括生理鹽水緩沖液或其他具有緩沖性能的水溶液，或者是溶劑如乙二醇、甘油、油(例如橄欖油)或可注射的有機酯。生理學可接受的載體可包含能穩定人IgM抗體或增加其吸收的化合物。生理學可接受化合物的實例包括糖如葡萄糖、蔗糖和葡聚糖；抗氧化劑如抗壞血酸和谷胱甘肽；鰲合劑；諸如白蛋白的蛋白質；以及其它穩定劑和賦形劑。各種諸如環孢菌素的免疫抑制劑和FK506以及其它免疫抑制劑可加入到組合物中。可根據給藥途徑和對象的疾病選擇任何生理學可接受載體的組合。
實施例1.9F11抗體的特異性受試細胞以1×106細胞/ml的濃度懸浮于培養液中，等體積10μg/ml濃度的9F11抗體溶液加入懸浮物中，隨后反應30分鐘。洗滌受試細胞，連接的9F11用熒光標記的抗人IgM抗體染色，細胞用流式細胞儀分析。結果表明HIV感染表達9F11抗原，雖然作為人細胞株的MOLT-4細胞和CEM細胞沒有被染色，被HIV-1病毒IIIB株和MN株感染的細胞被強烈染色(圖1)。由于HIV感染導致淋巴細胞活化，向正常人外周血細胞淋巴細胞中加入植物血凝素(PHA)后，培養3天，可發現活化淋巴細胞染色。顯然9F11抗原為活化T淋巴細胞中表達的分化抗原(圖2)，雖然外周血細胞和外周血淋巴細胞中沒有被觀察到染色，經PHA刺激的活化T淋巴細胞被強烈染色。
實施例2.9F11抗體在補體介導下的細胞損傷反應受試細胞用51Cr放射性同位素預先標記，40μl不同濃度的9F11溶液和20μl人新鮮血清(補體血清)加入到標記的受試細胞中(以5×105/ml的濃度懸浮于培養液中)，使混合物在微量滴定板上反應4小時。反應后，離心板沉淀細胞，測定由于細胞裂解而釋放到上清液中的51Cr的放射性，用作細胞裂解反應的指標。表達9F11抗原的細胞如MOLT-4/IIIB(被HIV-1感染的MOLT-4細胞)和PHA活化的外周血衍生出的淋巴細胞在2μg/ml的9F11存在下經補體介導被裂解。相反，使用56℃加熱或缺乏C9的失活人血清，沒有觀察到細胞裂解。由于向缺乏C9的人新鮮血清中加入純化的C9，可使細胞裂解發生，可以得出結論人補體反應是細胞裂解反應必須的(圖3)。
實施例3.基因工程重建抗體重建9F11抗體的一個實施例的方法如下所述，該實施例基于表1所示的9F11抗體可變區堿基序列，其中產生9F11抗體的細胞株用基因工程如鳥槍連接法(shot-gun ligation method)構建(Grundstrom，T.et al.，Nucleic Acid Res.13，3305-3316，1985)。
9F11抗體可變區的氨基酸序列通過翻譯表中的堿基序列獲得。如表2中所示，9F11抗體可變區中有許多編碼氨基酸序列的堿基序列，如原始9F11抗體可變區的堿基序列以及通過變換密碼子活動的序列。從這些序列中選出具有特定限制性內切酶識別片斷的堿基序列，使每段達到能作為寡核苷酸化學合成的長度(表2)。
表29F11抗體氨基酸序列中編碼同樣氨基酸的cDNA實例
1M S V S F L I F L P V L G L P W G V L SATA TCT GTT TCT TTT TTA ATT TTT TTA CCT GTT TTA GGT TTA CCT TGA GGT GTT TTA TCTATG TCC GTC TCC TTC TTG ATC TTC TTG CCC GTC TTG GGC TTG CCC TGG GGC GTC TTG TCCTCA GTA TCA CTT CTT CCA GTA CTT GGA CTT CCA GGA GTA CTT TCATCG GTG TCG CTC CTC CCG GTG CTC GGG CTC CCG GGG GTG CTC TCGAGT AGT CTA CTA CTA CTA CTA AGTAGC AGC CTG CTG CTG CTG CTG AGC
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61Q S P L R G L E W L G R T Y Y R S K W YCAA TCT CCT TTA CGT GGT TTA GAA TGA TTA GGT CGT ACT TAT TAT CGT TCT AAA TGA TATCAG TCC CCC TTG CGC GGC TTG GAG TGG TTG GGC CGC ACC TAC TAC CGC TCC AAG TGG TACTCA CCA CTT CGA GGA CTT CTT GGA CGA ACA CGA TCATCG CCG CTC CGG GGG CTC CTC GGG CGG ACG CGG TCGAGT CTA CTA CTA AGTAGC CTG CTG CTG AGC
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121R E N Y Y G S G R Y N W F D P W G Q G TCGT GAA AAT TAT TAT GGT TCT GGT CGT TAT AAT TGA TTT GAT CCT TGA GGT CAA GGT ACTCGC GAG AAC TAC TAC GGC TCC GGC CGC TAC AAC TGG TTC GAC CCC TGG GGC CAG GGC ACCCGA GGA TCA GGA CGA CCA GGA GGA ACACGG GGG TCG GGG CGG CCG GGG GGG ACGAGTAGC
141L V T V S STTA GTT ACT GTT TCT TCTTTG GTC ACC GTC TCC TCCCTT GTA ACA GTA TCA TCACTC GTG ACG GTG TCG TCGCTA AGT AGTCTG AGC AGC基于為每個限制性內切酶識別片斷分開的堿基序列，化學合成寡核苷酸。在用相應限制性內切酶依次消化合成的寡核苷酸后，將其連接獲得編碼9F11抗體可變區氨基酸序列的全長堿基序列。通過同樣的方法獲得9F11抗體H鏈和L鏈可變區的cDNA片斷，每個片斷(分別命名為rVμ9F11和rVκ9F11)整合到含有用同樣方法獲得的人IgM抗體H鏈和L鏈恒定區基因序列(分別為Cμ和Cκ)的載體中，形成嵌合體抗體，獲得重組9F11μ鏈和κ鏈的表達質粒(分別為rVμ9F11-Cμ和rVκ9F11-Cκ；圖4)。
實施例4.重組抗體的表達使用COS7細胞(ATCC CRL 1651)中的臨時表達體系考察抗體的活性，所述抗體使用表達重組9F11抗體基因的質粒獲得，。采用GIBCO Co.的脂質轉染試劑盒，使用兩種質粒(rVμ9F11-Cμ和rVκ9F11-Cκ)的混合物以及人IgM抗體J鏈的表達質粒(Cj)導入基因。繼續培養2天，其后采用常規培養條件，取回導入了基因的細胞培養物上清液。使用抗人μ-抗體和抗人κ-抗體，用夾層ELISA法檢測系統檢測培養物上清液，確認培養物上清液中分泌的重組9F11抗體。使用諸如通過用HIV-1的IIIB株感染U937細胞和MOLT-4細胞制備的U937/IIIB和MOLT-4/IIIB細胞，通過FACS分析培養物上清液，抗體被確認具有上述特異性。而且，使熒光標記原始的9F11抗原和培養物上清液同時與U937/IIIB或MOLT-4/IIIB反應，通過此競爭性抑制試驗，確認了重組9F11抗體的活性。
隨后，表1所列出的9F11抗體μ鏈和κ鏈可變區堿基序列被確認為是抗HIV感染活化淋巴細胞表達的分化抗原活性的重要區域。
從這些結果還可確認的是編碼μ鏈可變區和κ鏈可變區堿基序列的基因對于制備重組抗HIV抗體和抗活化淋巴細胞是決定性的基因。
工業應用性由于本發明抗活化淋巴細胞表達的分化抗原的人IgM單克隆抗體在補體介導下表現出對活化淋巴細胞的裂解功能，該抗體可用作控制體內異常活化淋巴細胞的藥物。本發明還提供編碼μ鏈可變區和κ鏈可變區堿基序列的基因，該基因對于重組抗活化淋巴細胞抗體有決定性作用。
序列表<110>岡田 則子岡田 秀親<120>同源補體介導下的人IgM抗體裂解活化淋巴細胞<130>T-070102-2<150>2002-227952<151>2002-07-01<160>2<170>專利版本3.1<210>1<211>481<212>DNA<213>未知<220>
<223>人u鏈的可變區<220>
<221>V區<222>(1)..(481)<223>
<400>1gctgaattct ggctgaccag ggcagtcacc agagctccag acaatgtctg tctccttcct 60
catcttcctg cccgtgctgg gcctcccatg gggtgtcctg tcacaggtac agctgcagca120gtcaggtcca ggactggtga agcccgcgca gaccctctca ctcacctgtg ccatctccgg180ggacagtgtc tctagcaaca gtgctacttg gaactggatc aggcagtccc cattgagagg240ccttgagtgg ctgggaagga catactacag gtccaagtgg tataatgatt atgcagtatc300tgtgaaaagt cgaataacca tcaacccaga cacatccaag aaccagttct ccctgcagct360gaactctgtg actcccgagg acacggctgt gtattactgt gcaagagaga attactatgg420ttcggggagg tacaactggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc480a481<210>2<211>401<212>DNA<213>未知<220>
<223>人k鏈的可變區<220>
<221>V區<222>(1)..(401)<223>
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cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcatccagtt240tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca300ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt360tccctctcac tttcggcgga gggaccaagg tggagatcaa a40權利要求
1.一種人IgM單克隆抗體，其特征在于，所述抗體與活化人淋巴細胞和HIV感染細胞反應，在同源人補體介導下裂解細胞。
2.一種抑制免疫的抗HIV藥物，所述藥物用于治療移植排斥反應和T淋巴細胞過度活化導致的自身免疫疾病，其特征在于，其中異常的活化淋巴細胞被與活化人淋巴細胞反應的人IgM單克隆抗體裂解清除。
3.根據權利要求1或2的人IgM單克隆抗體，其特征在于，其中與活化的人淋巴細胞和HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體為9F11抗體，所述抗體包含序列號1表示的H鏈可變區堿基序列。
4.根據權利要求1-3任一項的人IgM單克隆抗體，其特征在于，其中與活化的人淋巴細胞和HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體為9F11抗體，所述抗體包含序列號2表示的L鏈可變區堿基序列。
5.保藏號為FERM PB-8379的細胞株，其特征在于，所述細胞株產生與活化的人淋巴細胞和HIV感染細胞反應的人IgM單克隆抗體，該抗體在同源人抗體介導下裂解細胞。
6.根據權利要求1-4任一項的單克隆抗體，其特征在于，所述抗體由保藏號為FERM BP-8379的細胞株產生。
全文摘要
一種應對HIV感染細胞的人IgM單克隆抗體，所述抗體在同源人補體介導下裂解活化人淋巴細胞。使用上述單克隆抗體，可提供一種免疫反應控制劑，該控制劑包括人IgM單克隆抗體，該抗體特別作用于活化淋巴細胞，并在同源補體介導下誘導細胞裂解。使用應對活化人淋巴細胞的人IgM單克隆抗體，還可提供一種HIV藥物等，該藥物裂解并消除活化淋巴細胞，從而治療T淋巴細胞過度應答造成的移植排斥反應和自身免疫疾病，以及治療HIV感染。
文檔編號C12P21/08GK1665926SQ03815600
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月30日 優先權日2002年7月1日
發明者岡田秀親, 岡田則子 申請人:岡田秀親, 岡田則子